专利名称：缢蛏抗菌肽基因的pcr重组制备抗菌肽的方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗菌肽的方法与用途，特别是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法与用途。
背景技术：
随着水产养殖业的迅速发展，水产病害日趋严重，防治过程中抗生素甚至一些禁用药物的大量长期使用，不仅威胁食品安全，而且破坏了水生环境，许多细菌产生了明显的耐药性，影响了水产养殖业的可持续性发展。滥用抗生素也使我国水产品出口屡屡受阻，给水产业造成了巨大损失。因此寻求抗菌力强、抗菌谱广、活性稳定的抗菌素替代品成为防治水产病害的当务之急。抗菌肽是生物体内产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，具有广谱抗菌活性，同时有“传统抗生素”无法比拟的优越性不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗菌剂。抗菌肽添加到养殖鱼类的饲料中，不仅可以抑制和消灭水生环境中的病原微生物，提高鱼体的免疫能力，而且可以避免抗生素在鱼体中的蓄积，提高水产品质量。目前国内外研究以从生物体分离纯化抗菌肽为主，此方法得到的抗菌肽量少成本较高，因此很难得以广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的对水产疾病具有防治效果的缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供前述方法制得的抗菌肽的一种用途。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，其特点是，其步骤如下
(1)收集缢蛏血淋巴10mL，4°C、4000 rpm下离心25 min得到血淋巴细胞，弃上清液，收集沉淀物于1. 5 mL RNase-free的EP管,加入I mL Trizol,吹打混勻后室温静置5 min,每管加500 U L氯仿,振摇30s,冰浴3 min,然后在4°C, 12000 rpm下离心15 min,吸取上清液，转移至另外一支RNase-free的EP管,用体积比为24 1的氯仿异戍醇抽提至无蛋白沉淀，吸取上清液，加4°C预冷的500 UL异丙醇，混匀，冰上静置10 min,4°C, 12000 rpm离心15 min,弃上清；加I mL 4°C预冷的75%乙醇洗一次，4°C,8000 rpm离心5 min,倒掉乙醇，室温倒置15 min，加10 mL DEPC处理水溶解，得缢蛏总RNA样品，置于4 °C冷藏；
(2)按下述方法对缢蛏总RNA样品进行PCR扩增
a.反转录cDNA合成体系建立
取20 缢蛏总RNA样品70 °C下温育10 min，迅速冰上冷却，得到变性总RNA，备用；按下述方法建立反转录cDNA合成体系
权利要求
1.一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，其特征在于，其步骤如下 (1)收集缢蛏血淋巴10mL，4°C、4000 rpm下离心25 min得到血淋巴细胞，弃上清液，收集沉淀物于1. 5 mL RNase-free的EP管,加入I mL Trizol,吹打混勻后室温静置5 min,每管加500 μ L氯仿,振摇30s,冰浴3 min,然后在4°C, 12000 rpm下离心15 min,吸取上清液，转移至另外一支RNase-free的EP管,用体积比为24 1的氯仿异戍醇抽提至无蛋白沉淀，吸取上清液，加4°C预冷的500 μ L异丙醇，混匀，冰上静置10 min,4°C, 12000 rpm离心15 min,弃上清；加I mL 4°C预冷的75%乙醇洗一次，4°C,8000 rpm离心5 min,倒掉乙醇，室温倒置15 min，加10 mL DEPC处理水溶解，得缢蛏总RNA样品，置于4 °C冷藏； (2)按下述方法对缢蛏总RNA样品进行PCR扩增 a.反转录cDNA合成体系建立 取20 μ I缢蛏总RNA样品70 °C下温育10 min，迅速冰上冷却，得到变性总RNA，备用；按下述方法建立反转录cDNA合成体系
2.权利要求1所述的缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法所制得在含抗菌肽的上清液在制备抑制泥鳅病害抗菌肽制剂中的用途。
全文摘要
本发明是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，它以缢蛏血窦淋巴细胞为材料，从中提取总RNA，设计特异引物，采用嵌套PCR方法，获得258bp大小的scp基因，将其插入pPICZαA表达载体，转入毕赤酵母GS115,得到表达菌株LGS-3，通过表达条件优化，获得其最佳表达条件为温度28℃，甲醇浓度1%，诱导表达时间为72h。诱导表达的产物抗菌肽对凡隆气单胞菌具有较强的抑制活性。将其应用于泥鳅养殖，饲料中添加0.5%的抗菌肽制剂，可使泥鳅在投放凡隆气单胞菌的情况下存活率提高48%左右，产量的增加28.55%左右。
文档编号C12N15/81GK103045604SQ201210547250
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者李联泰, 安贤惠, 朱明 申请人:淮海工学院