中华大蟾蜍抗菌肽bg-cath37、bg-cath(5-37)及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37、BG-CATH(5-37) 及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药 蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍 及/fb to/b Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛 应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。
[0003] 国内外学者发现两栖动物皮及其分泌物含有丰富的抗菌肽，这类多肽通常含有 10~50个氨基酸残基，成熟的多肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌肽由于富含碱性氨基 酸而带净正电荷。抗菌肽具有很多优点：消炎、抗感染、抗真菌、抗肿瘤、促进伤口愈合等作 用，这些功能使抗菌肽可能成为良好应用前景的临床候选药物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供了中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37、BG-CATH(5-37)及其编码 基因和应用，所述抗菌肽BG-CATH37具有显著的抑菌和抗肿瘤作用，其还具有结构简单、合 成成本低和抗菌谱系广等优点。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案予以实现： 中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37,其具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
[0006] 中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH(5-37)，其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0007] 含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的蛋白前体，其具有SEQ ID NO: 2所示 的氨基酸序列。
[0008] 所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列。
[0009] 所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的蛋白前体的编码基因，使用T7启动子序列 和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因， 所述 17 启动子序列为 5' -TAATACGACTCTATAGGGA-3' ； 所述 SP6 启动子序列 5' -CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3'。
[0010] 本发明还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37在制备用于抑菌和抗肿瘤 的药物中的应用。
[0011] 本发明还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH(5-37)在制备用于抑菌、抗肿 瘤的药物中的应用。所述抗菌肽BG-CATH(5-37)对嗜水气单胞菌抑制效果最好。
[0012] 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在中华大蟾蜍毒液腺CDNA 文库中获得了具有广谱抗菌活性的抗菌肽BG-CATH37,并将本发明的中华大蟾蜍抗菌肽 BG-CATH37全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同成熟肽，所 述抗菌肽BG-CATH37具有创新性。
[0013] 本发明通过实验证明两栖动物来源的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37具有显著的 抑菌和抗肿瘤的作用，尤其是对临床耐药肿瘤细胞有很好的抑制作用，且应用范围广泛，与 其它来源的抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广等有益特 点。可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的 市场应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的CDNA及其蛋白质序列，其中斜体加 框序列为中华大蟾蜍抗菌肽的成熟序列。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
[0016] 实施例1 一、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH37的基因克隆 1、总RNA的提取 将中华大蟾蜍放于玻璃烧杯中，加入几滴乙醚，收集毒液腺分泌物（也可以直接使用收 集好的毒液腺分泌物)，立即放入液氮中。称重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末状。加 入IOml总RNA提取缓冲液（Trizol溶液，美国GIBC0/BRL产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆 30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4 ° C，12000 rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4 ° C，12000 rpm离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。
[0017] 2、mRNA 的分离 采用美国Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒。取中华大蟾蜍毒腺总RNA 500 μ g溶 于500 μ 1经DEPC处理然后高压灭菌的水中，放入65 ° C水浴10分钟。加入3μ1的Oligo (dT)探针和13 μ 1 20 X SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠（SA-PMP)的洗涤： 将磁珠(随mRNA分离纯化试剂盒)轻轻混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0. 5 X SSC 0. 3 ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1 ml 0.5X SSC悬浮，称为B液。将A液加入B液中，室 温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0. I X SSC洗涤4次。然后弃上清，加0. 1 ml DEPC水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管中，加入0.15 ml DEPC水重新 悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至上述试管，则上清中为纯化的mRNA。加入1/10 体积的3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异戊醇，于-70 ° C放置30分钟，然后于4 ° C， 12000 rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于10 μ I DEPC水中。 3、cDNA文库构建。
[0018] 采用美国GIBC0/BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒。
[0019] 3. UcDNA第一链合成（mRNA反转录):于I. 5 ml试管中加入2. 0 μ I NotI引物和 7 μ? mRNA，3 μ? DEPC水，70 ° C保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4 μ? 5Χ 第一链合成缓冲液，2 μ? 0.1Μ DTT，1 μ? IOmM dNTP混合物，再加入Ιμ? Superscript II反转录酶，于42 ° C保温1小时后放入冰浴。
[0020] 3. 2、cDNA第二链合成：在第一链合成试管中加入：95 μ I DEPC水，30 μ I 5X第 二链合成缓冲液，3 μ I IOmM dNTP混合物，1 μ 1大肠杆菌DNA连接酶，4 μ 1大肠杆菌DNA 多聚酶I，1 μ 1大肠杆菌RNA酶，反应总体积150 μ 1，混匀后于16 ° C保温2小时；力口 入2 μ I Τ4 DNA多聚酶继续保温5分钟。
[0021] 3. 3、DNA的抽提和乙醇沉淀：加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25/24/1)混合物抽 提，12000 rpm离心5分钟，取180 μ 1上层溶液转移到干净的试管中，加入70 μ I 7. 5Μ 乙酸铵，0. 5 ml无水乙醇，12000 rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干。
[0022] 3.4、Sal I adapter的连接：上述沉淀溶于25 μ I DEPC水中，加入10 μ I 5XT4 DNA连接酶缓冲液，10 μ? Sail adapter，5 μ? Τ4 DNA连接酶，反应总体积50μ1，于16 ° C保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41 μ I DEPC水中。
[0023] 3. 5、Not I酶水解：于cDNA溶液中加入5 μ I React 3缓冲液，4 μ I NotI酶， 反应体积50 μ 1，于37 ° C保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解 于100 μ I TEN缓冲液中。
[0024] 3. 6、DNA分级分离：将cDNA样品过柱(试剂盒中含有）后，去除小于300bp核苷 酸的cDNA，cDNA大于300 bp的组分合并，体积为200 μ 1，加入5 μ 1酵母tRNA，100 μ 1 7. 5 M乙醇胺，0. 6 ml无水乙醇，12000 rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次， 晾干，沉淀溶于20 μ I TEN缓冲液中。
[0025] 3. 7、合成的cDNA连接到pSPORT 1质粒：取10 μ 1溶解于TEN缓冲液中的cDNA， 加入4 μ? 5XT4 DNA连接酶缓冲液，1 μ? pSPORT 1质粒（Not I-Sal I酶水解，50 ng)， 4 μ? DEPC水，1 μ? T4 DNA连接酶，反应体积20μ1，室温3小时。
[0026] 3. 8、大肠杆菌HBlOl感受态细胞的制备：挑取单个HBlOl菌落，接种于3ml不含氨 苄青霉素的LB培养基中，37 ° C培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50ml LB培养液中，37 ° C振荡2小时，待菌液在540 nm的OD值为0. 4时，4 ° C，2000rpm离 心8分钟，弃上清，沉淀用0.1 M CaCl2重悬，再以2000 rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以 适量0. I M CaCl2重悬，