一种油菜抗菌肽BnLTP1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和生物技术领域。具体涉及一种油菜抗菌肽BnLTPl及其应 用。
【背景技术】
[0002] 病原菌可引起包括人类，牲畜，作物和其他生物的严重病害，造成严重的经 济损失。植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80 %以上的植物病害（张福 丽，王占斌，王志英，几丁质酶在植物抗真菌病害中的作用，林业科技，2006, 31(3): 24-27)，造成世界粮食作物减产约 20 % (Knight S.C·，Anthony V.M·，Brady A.M.，et al. Rationale and perspecti ves on the developmentof fungicides.Annu Rev Phytopathol，1997,35:349-372)。许多重要植物病害都是真菌造成的，如马铃薯晚疫病、 稻瘟病、小麦白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成非常巨大 的经济损失。另一方面，真菌在侵染植物的过程中，释放出来的代谢产物一一真菌毒素 (mycotoxin)，对农作物以及人类的健康也造成极大的危害，如黄曲霉毒素（aflatoxin) 等。
[0003] 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘 菌科、核盘菌属。是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盘菌可以广 泛地侵染很多单子叶和双子叶植物。核盘菌引起的菌核病是一种类似于灰霉的腐生营养 型真菌，这种破坏性病源侵染超过400种植物，分布广泛。目前对菌核病的防治主要依靠 化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想；同时，食品的安全性 也受到严重影响。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，茎和角果 的腐烂，导致了巨大的产量损失。尽管菌核病严重威胁了农业生产，植物对核盘菌的寄 主抗性的分子机制，我们依然知之甚少。暨今为止还没有发现完全免疫或者高抗的油菜 栽培品种（Liu, S.，Wang, H.，Zha ng，J.，Fitt，B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang, W.， and Guo, X. 2005. In vitro mu tation and selection of doubled-hapIoid Brassica napus lines with improved resistance to S clerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24:133-144)，因此，探宄植物对这种病源的抗性机制，发现新的抗性基因具有深远意 义。
[0004] 灰霉菌（Botrytis cinerea)，又称灰葡萄孢菌，是一种广寄主性的、能够引起200 多种已知植物（如水果、蔬菜及花丼）灰霉病的坏死营养型病原真菌。其在空气中广泛分 布，不仅能够侵染田间作物，同样会给植物的采后阶段造成巨大损失。灰霉菌能够在低温条 件下（〇°C)生长，靠产生大量的灰色分生孢子进行传播，与其它采后病原真菌相比，具有潜 伏侵染和低温致病的优势。同时，其还具有繁殖快、遗传变异大和适合度高的特点。日常 生活中遇到的果蔬放一段时间会长毛，多数就可能是受到了灰霉菌的侵染。灰霉病最初只 是流行于欧洲和美洲，自20世纪80年代才开始在中国发生蔓延。由于温室和大棚种植技 术的推广普及，作物灰霉病害严重，已成为蔬菜、花丼和林业苗培育基地生产的主要限制因 素。截止2013年，世界上尚未发现有任何一种植物对灰霉菌产生抗性（陈琪，丁克坚，檀根 甲，张晓伟，灰霉病菌菌株抗药性变异及其遗传性研宄。2003华东植物病理学术研讨会暨江 苏省植物病理学会第十次会员代表大会论文集）。因此发现新的抗灰霉菌的基因具有深远 的意义。
[0005] 稻瘟病又名稻热病：俗称火烧瘟、嗑头瘟，稻瘟病是水稻四大重要病害之一，主要 由病原真菌稻梨孢（稻瘟病菌P.oryzae)引起。可引起大幅度减产，严重时减产40%? 50%，甚至颗粒无收水。世界各稻区均匀发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不 同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。主要为害叶片、茎杆、穗 部。因为害时期、部位不同分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟。苗瘟发生于三叶前，由种 子带菌所致。病苗基部灰黑，上部变褐，卷缩而死，湿度较大时病部产生大量灰黑色霉层，即 病原菌分生孢子梗和分生孢子。叶瘟在整个生育期都能发生。分蘖至拔节期为害较重。秧 苗期发病后变成黄褐色而枯死，不形成明显病斑，潮湿时，可长出青灰色霉。在我国南、北方 稻区都有不同程度发生，流行年份一般减产10-20%，严重的减产达40-50%，在水稻秧苗 期和分蘖期发病，可使叶片大量枯死，严重时全田呈火烧状，有些稻株虽不枯死，但抽出的 新叶不易伸长，植株萎缩不抽穗或抽出短小的穗，孕穗抽穗期发病、节瘟、穗颈瘟严重发生， 可造成大量白穗或半白穗，损失极大（凌忠志，《稻瘟病研宄论文集》，中国农业出版社）。
[0006] 目前常用的病害防治措施，主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环 境，而且防效也不理想；同时，食品的安全性也会受到严重影响。随着社会的进步，人们越 来越深刻地认识到长期大量使用化学农药对生态环境和人类健康的危害。生物防治可以有 效地克服这些弊端，因而生物农药越来越受到人们的重视。
[0007] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有抗菌活性的天然小分子 蛋白，广泛存在于生物界，是机体非特异性免疫的重要组成部分，在体内体外均具有抗菌 活性（Gordo n YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。抗菌肽的广泛的生物学活性，对细菌真菌、原生动物、病毒和肿瘤等有很强的抑制作 用，具有高效、环保、不使病原菌产生耐药性等优点使它在生物防治和医学上具有良好的应 用前景（Gordon YJ, Romanowski E G, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Dr ugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。近年来已经成为植物抗病基因工程、养殖饲料添加剂，食品防腐剂、新兴医药等领域的 研宄热点，在疾病防治领域中是抗生素的理想替代品（Boman HG，Peptide antibiotics and their role in innateimmunity. Annu Rev Immunol. 1995,13 :61-92) 〇 在农业生产过程 中，用抗菌肽进行植保工作可以避免农用抗生素通过食物链的传递对人体产生的威胁。
[0008] 按照氨基酸序列及二级结构，已发现的植物抗菌肽可以分为植物防御素 （plant defensins)、脂转移蛋白（lipidtransfer proteins，LTPs)，硫素（thionins)，蜕皮 素（snakins)，橡胶蛋白类（hev ein-like)，打结素类（knottin-like peptides)，凤仙 花素（IbAMP)，和新近发现的养菜素 （she pherdins)、环肽（cyclotides)等（Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother, 1999,43 (6)： 1317-1323)。抗菌肽基本上都具有一些共性，如：小分子量（<10KDa)，阳离子表面、正电荷 以及两亲性，这些特性使得抗菌肽能够和细胞膜绑定并能够插入到细胞内部，大部分抗菌 肽是通过破坏细胞膜从而使目标细胞死亡而达到杀菌目的。而另一些抗菌肽却能够通过细 胞膜上的离子通道进入到细胞内部破坏细胞而不破坏细胞膜（Vogel PMHaHJ:Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochem Cell Biol 1998,76:235-246.)。脯氨酸富集类抗菌肽（PRPs)的杀菌方式就是通过不破坏细胞膜， 而是利用离子通道的方式进行的（L.Otvos J:The short proline-rich antibacterial peptide f amily.Cellular and Molecular Life Sciences 2002,59:1138_1150.)〇 大 多数类型的植物源抗菌肽对动物和植物细胞都没有毒性（Murad AEPelegrini PB. Neto SM. Novel Findings of Defensins and their Utilization in Construction of Transgenic Plants. Transgenic Plant Journ al 2001(1) :39-48)。与动物源抗菌肽相比， 植物源抗菌肽更易于在作物中表达和调控，不容易被细胞内的蛋白酶降解。与其他杀菌剂 相比，植物来源的抗菌肽对环境的影响更小，更友好，更具开发成为抗真菌生物制剂的潜力 (Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibi otics. Antimicrob Agent Chemother，1999， 43 (6) : 1317-1323)。如将Rs-AFPs等植物抗菌肽基因导入微生物中进行发酵，更容易克服 对宿主的毒性作用而进行大量生产。
[0009] 抗菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的小分子肽，它能被细 菌、真菌或物理的、化学的刺激所诱导，甚至有些抗菌肽在植物体内能形成组成性的表达。 它不仅