具有肿瘤靶向及穿膜的小肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种小肽及其作为靶向造影剂和抗肿瘤药物载体的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤特异性的细胞表面受体能够吸引靶向分子，使肿瘤细胞选择性制剂得以设计与开发，用于肿瘤的诊断和治疗。很多肿瘤受体靶向肽作为主动靶向载体。在前期研宄中，我们从人结缔组织生长因子CTGF中提取了 Plc肽(CIRTPKISKPIKFELSG)，它能与人整合素av β 3特异性结合。同时利用超顺磁性氧化铁USP1s，这种肽成功地应用于α ν β 3阳性表达的原发性肝癌Bel 7402的核磁共振(MRI)检查中。
[0003]抗菌肽是从人工合成或天然肽和蛋白质中提取，其中大部分是一种阳离子肽，能直接与磷脂双分子层作用。这些肽不仅可以穿透细胞膜，还可以通过疏水螺旋结构插入细胞质膜的机制将物质运送进入哺乳动物细胞内。
[0004]然而，拥有的其他二级结构的小肽(如β片层结构)，是否可以起到同样的作用尚待研宄。S-thanatin (Ts，GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRM)，一种具有受限于二硫键的反向β折叠结构的抗菌肽，对革兰氏阴性菌和阳性菌具有广谱抗菌活性。
[0005]Ts的杀菌作用是以一种膜依赖性的方式与细胞发生反应。我们的研宄表明Ts通过β折叠结构与细菌脂多糖结合，其疏水端插入细胞膜导致膜的通透性增高。细胞膜的通透性增高和膜去极化破坏了细胞的能量代谢，从而导致了细胞死亡。
[0006]
【发明内容】
[0007]解决的技术问题:本发明提供了一种具有肿瘤靶向及穿膜的小肽及其应用，它是由α νβ 3结合肽Plc与Ts用氨基酸GS连接形成。
[0008]技术方案:一种具有肿瘤靶向及穿膜的小肽，氨基酸序列为GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRMGSIRTPKISKPIKFELSGo该肽能与整合素α ν β 3结合，并能快速穿过细胞膜，分子量为4362.27，等电点为 11.15。
[0009]所述小肽在制备靶向造影剂或抗肿瘤药物载体中的应用。
[0010]一种靶向造影剂，含有权利要求1所述的小肽。
[0011]一种抗肿瘤药物载体，含有权利要求1所述的小肽。
[0012]有益效果:本发明的小肽(PTS)在体外表现出较低的溶血毒性；流式细胞术显示FITC-PTS能特异性结合MDA-MB-231乳腺癌细胞；激光共聚焦显微镜观察FITC-PTS的荧光主要在细胞质内；体内近红外荧光成像技术显示α νβ 3阳性MDA-MB-231肿瘤检测到Cy5.5-PTS探针高信号。
【附图说明】
[0013]图1为PTS纯度鉴定图。
[0014]图2为PTS质谱鉴定图。
[0015]图3为PTS，Plc和Ts的溶血毒性示意图:人类红细胞与不同浓度的多肽在PBS溶液中37°C孵育15 min。三组间没有显著差异(P>0.05)。
[0016]图4为流式细胞术检测荧光探针与MDA-MB-231细胞的结合情况示意图:A为对照组，细胞与PBS孵育；B为细胞与抗α νβ 3单克隆抗体孵育后加入FITC标记的羊抗小鼠二抗；(:为细胞与FITC-PTS孵育山为细胞与FlTC-Plc孵育；Ε为细胞与FITC-Ts孵育；F为细胞与游离Plc孵育后加入FITC-PTS ；G为细胞与抗α V β 3单克隆抗体孵育后加FITC-PTS。
[0017]图5为荧光探针的细胞定位示意图:MDA-MB-231细胞分别与PBS (对照组)，FITC-PTS, FITC-Plc, FITC-Ts,游离 Plc 和抗 α ν β 3 单克隆抗体加 FITC-PTS孵育 30min，采用激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况。
[0018]图6为荧光探针作用于MDA-MB-231细胞膜的原理图:A为FITC-PTS首先与肿瘤细胞表面的整合素ανβ3结合，其β折叠结构与细胞膜紧密连接，然后FITC标记的疏水性头部插入磷脂双分子层并快速渗透进入细胞；Β为FlTC-Plc与肿瘤细胞表面的整合素α ν β 3结合；C为FITC-Ts对细胞膜不起作用。
[0019]图7为体内近红外荧光成像图:Α为注射Cy5.5-PTS探针的MDA_MB_231肿瘤模型的24h在体近红外荧光成像；B为静脉注射Cy5.5-PTS 8h后离体组织器官的成像(左，明视野；右，近红外荧光成像)1，肌肉；2，肺；3，肾；4，脾；5，骨；6，心脏；7，肝脏；8，肿瘤。C为静脉注射不同荧光探针Cy5.5-PTS (左)、Cy5.5-Plc (中)及Cy5.5_Ts (右)8 h时近红外成像比较。
[0020]图8为比较三种探针在不同时间点的肿瘤与正常组织荧光强度比值示意图(T/N) *，P〈0.05,不同时间点实验Cy5.5- PTS组与Cy5.5- Plc组比较，差异有统计学意义；#，P〈0.05，不同时间点实验Cy5.5- PTS组与Cy5.5- Ts组比较，差异有统计学意义。
[0021]图9 MDA-MB-231肿瘤的组织学评估图:A为肿瘤组织HE染色图为肿瘤的免疫组织化学染色图。
【具体实施方式】
[0022]本发明中，我们通过氨基酸SG将Ts的C端和Plc的N端相连，设计形成一种杂合肽PTS。Plc和Ts仍然保留其生物活性。当用荧光基团FITC或Cy5.5标记PTS后，预期荧光探针(FITC-PTS或Cy5.5-PTS)会与α ν β 3阳性表达的肿瘤细胞具有很强的特异性结合力，并且可以快速渗透细胞膜。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测细胞体外结合和荧光探针摄取情况。采用体内近红外荧光成像(NIRF)评估PTS对乳腺癌MDA-MB-231的肿瘤靶向性。
[0023]实施例1.PTS的合成和鉴定
PTS由上海科肽生物技术公司采用固相合成的方法制备，纯度>95%(图1)，质谱鉴定结果与预期分子量一致(图2)。
[0024]实施例2.溶血试验
人类红细胞用PH7.4的PBS溶液洗三次并重悬。加入PTS，Plc，和Ts，终浓度为0-1.0mmol/L，37°C孵育15min，5, 600Xg离心I min，检测上清液在350 nm处的吸光度。按以下公式计算溶血百分率:溶血百分率(％) = (A-AB)/(Ap-AB) X100。Ab:空白对照，即未加入多肽；AP:阳性对照，S卩加入0.2% Triton X-100导致完全溶血。实验结果显示:三种肽均显示较低的溶血活性，溶血百分率无显著差异(K0.05)(图3)。
[0025]实施例3.流式细胞术
人乳腺癌MDA-MB-231细胞用含10% FBS的DMEM于37°C、5%