CO2的湿润环境中培养。用冷的含1% FBS的PBS洗涤两次并收集。然后，细胞中加入或不加入5 μ mol/L游离Plc或2mg/ L的抗人ανβ 3单克隆抗体37°C预温lh。洗涤三次后，加入终浓度为2.5 μ mol/LFITC-PTS，FITC-Plc或FITC-TS，避光，37°C 30min。将细胞洗涤两次，并通过流式细胞仪进行分析。
[0026]将细胞与2.5 mg / L抗人α ν β 3单克隆抗体的含I % FBS的PBS溶液于4°C孵育I小时后，分析MDA-MB-231细胞的整合素α νβ 3表达。鼠免疫球蛋白(Ig)作为阴性对照。然后将细胞洗涤两次后，与lmg/L羊抗鼠抗体-FITC于4°C避光孵育30min。将细胞洗涤三次，用4%甲醛固定后，进行流式细胞术分析。所有实验重复三次。流式细胞仪分析显示，FITC-PTS或FITC-Plc组的阳性染色细胞的百分比显著高于对照组或TS组(P〈0.05，图4-C-图4-E所示)。增强的效果可被游离Plc或抗人α ν β 3单克隆抗体抑制(P〈0.05，图
4-F ?图 4-G)。
[0027]实施例4.激光共聚焦
MDA-MB-231细胞在细胞培养皿贴壁生长，用PBS洗涤，然后加入2 μ mol/ L FITC-Plc，FITC-PTS或FITC-TS 37°C避光孵育30min。在抑制实验中，将细胞与4 ymol/L的游离Plc或2mg/ L的抗ανβ 3单克隆抗体预孵育，再加入FITC-PTS孵育30min。细胞用PBS洗涤两次，4%甲醛固定后，激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况。MDA-MB-231细胞与FITC-PTS，FITC-Plc或FITC-TS孵育30min，经FITC-Plc处理，观察到细胞膜表面较强的荧光信号，使用FITC-PTS处理组主要出现在细胞质中的(图5)。将细胞预温育与自由Plc的肽或抗素ανβ 3单克隆抗体细胞荧光显著降低或减弱(图5)。将细胞用FITC标记的TS (图5)处理，细胞膜或细胞浆没有观察到荧光信号。三个探针与细胞膜作用机制示意图如图6。实施例5.体内近红外荧光成像
(I)小鼠肿瘤模型:按照批准的东南大学中国动物护理和使用委员会的协议执行。雌性BALB/ c裸鼠(4?6周龄)购自中国扬州实验动物中心。将5Χ 16的MDA-MB-231细胞于左前腿皮下接种。当肿瘤达到直径0.4?0.6厘米(植入后的10-14天)，荷瘤小鼠接受体内近红外荧光成像研宄。
[0028](2)体内近红外荧光成像:小鼠分为三组，分别腹膜内注射戊巴比妥钠30mg/kg进行麻醉，然后通过尾静脉分别注射5nmol的Cy5.5-PTS，Cy5.5 Plc或Cy5.5_Ts。利用Maestro成像系统在不同时间点连续进行活体近红外荧光成像。成像条件选用橙色滤光片(激发波长586-631 nm，发射波长645 nm)及相应的液晶可调滤波器(640-820 nm/10 nm)来检测Cy5.5的焚光信号及小鼠自发焚光信号。图像分析使用Maestro 2.10.0 software,选肿瘤区及对侧正常组织区为感兴趣区(reg1n of interest，R0I)，测定单位面积内的平均荧光强度(单位为scaled counts/s)随时间的变化，计算肿瘤与对侧正常组织平均信号强度比值(T/N)。8 h后补充注射荧光探针，处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织，并分离主要器官组织，并对离体肿瘤组织及主要器官组织进行近红外荧光成像。
[0029]结果显示，MDA-MB-231乳腺癌裸鼠静脉注射5nmol Cy5.5-PTS后的近红外荧光图象显示见图7-A。注射后的动物整体变得荧光，24h内皮下MDA-MB-231肿瘤可以从周围背景组织明确界定。在8h时，肿瘤对荧光探针的摄取达到最大值(图7-A，图7-C左侧)并随时间推移逐渐被清除。相比之下，除肝组织，正常组织均快速吸收并清除荧光探针。在8 h时补充注射Cy5.5-PTS后，离体组织的近红外荧光结果证实该化合物主要由MDA-MB-231肿瘤摄取(图7-Β，1，肌肉；2，肺；3，肾；4，脾；5，骨；6，心脏；7，肝脏；8，肿瘤)。
[0030]虽然Cy5.5-Plc具备肿瘤成像性质(图7_C，中)但是24h内的各时间点，其肿瘤-正常组织的对比度比率显著小于Cy5.5-PTS组(P〈0.05)(图8)。此外，Cy5.5-TS组观察到轻微的肿瘤-正常组织的对比度(图7-C中，右)，但是均低于Cy5.5-PTS或Cy5.5 -Plc组(图8)。
[0031]实施例6.MDA-MB-231肿瘤的组织学评估
处死小鼠，完整剥离肿瘤组织，用戊二醛固定，4°c过夜，石蜡包埋，并切成4 μ m的切片。对于HE染色，用二甲苯切片脱蜡并依次用乙醇和PBS水化洗涤。然后苏木精染色5分钟，用蒸馏水洗涤，用乙醇分化30s，在50°C的水中浸泡5min，最后用伊红复染2min。对于免疫组织染色，将切片在微波炉中加热以保持温度在92-98?进行抗原修复15分钟，然后用10%正常山羊血清孵育封闭。最后加入4mg/L的抗人α νβ 3单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG (1:5000)孵育。
[0032]结果显示，肿瘤组织HE染色显示肿瘤细胞呈多形性和细胞核深染，观察到有丝分裂相和不规则细胞核(图9-Α)。肿瘤组织的免疫组织化学染色表明，整合素ανβ3在MDA-MB-231肿瘤细胞强烈表达(图9-B)。
【主权项】
1.一种具有肿瘤靶向及穿膜的小肽，其特征在于氨基酸序列为GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRMGSIRTPKISKPIKFELSGo
2.权利要求1所述小肽在制备靶向造影剂或抗肿瘤药物载体中的应用。
3.—种靶向造影剂，其特征在于含有权利要求1所述的小肽。
4.一种抗肿瘤药物载体，其特征在于含有权利要求1所述的小肽。
【专利摘要】具有肿瘤靶向及穿膜的小肽及其应用，氨基酸序列为GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRMGSIRTPKISKPIKFELSG。本发明的小肽（PTS）在体外表现出较低的溶血毒性；流式细胞术显示FITC-PTS能特异性结合MDA-MB-231乳腺癌细胞；激光共聚焦显微镜观察FITC-PTS的荧光主要在细胞质内；体内近红外荧光成像技术显示αvβ3阳性MDA-MB-231肿瘤检测到Cy5.5-PTS探针高信号。
【IPC分类】C07K14-00, A61K49-00, A61K47-42
【公开号】CN104530200
【申请号】CN201410808679
【发明人】吴国球
【申请人】东南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月23日