一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽及其制备方法和应用，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽 及其制备方法和应用，属于生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的生长过程可分为两个时期：血管前期和血管期。血管前期因缺少血液的供 应，肿瘤处于休眠状态，直径l_2mm，并不发病；血管期因获得充足的血液供应，肿瘤体积快 速增大，产生浸润、转移，并诱导新生血管生成。肿瘤血管形成（angiogenesis)是指肿瘤细 胞诱导的微血管生长以及肿瘤中血液循环建立的过程。肿瘤新生血管形成过程受血管形 成的促进因子和抑制因子调节血管形成抑制因子通过抑制肿瘤组织血管形成，断绝血液供 应，间接的抑制肿瘤细胞的增长。用血管形成抑制因子治疗肿瘤具有抗瘤谱广，没有毒副作 用，不产生耐药性等优点。血管形成抑制因子不能直接杀伤肿瘤细胞，停药肿瘤会复发，因 此血管形成抑制因子主要是作为化疗药物的辅助药物，配合化疗药物使用，用以减少化疗 药物剂量，降低化疗药物的毒性。
[0003] 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，寻找新型高效、低毒的抗肿瘤 药物抑制是国内外医药研发的热点。抗肿瘤小分子多肽具有分子量小、低毒性、高活性、 易于穿透肿瘤细胞等特点，且能以多种方式给药、易于多途径吸收、不易产生耐药性。蛋白 质类大分子药物分子量大、结构复杂，不易穿透细胞，且具有免疫原性，而小分子多肽结构 易于改造，人工合成成本较低，由于其具有相对分子质量（Mr)小、活性高、毒性低的特点， 在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。近年来，人们主要通过从动植物中提取、从肽库中筛 选和化学合成等方法得到抗肿瘤活性小分子多肽，如来源于海兔的DolastatinlO衍生物 TZT-1027、来源于海天牛鼠的KahalalideF，它们已进入II期临床研究，分别对非小细胞肺 癌细胞和黑色素瘤细胞有较强杀伤作用。由于小肽类化学合成的成本低于基因重组，目前 小肽类药物多用化学合成法生产。但并不是所有的小肽类药物都适合用固相化学合成法生 产。有的小肽固相化学合成产量很低，称为合成困难肽。
[0004] 本发明公开一种由30个氨基酸组成的多肽，其特点是固相化学合成的产量高，结 构稳定，具有抑制血管形成活性和抑制肿瘤细胞增殖活性，并且治疗肿瘤安全有效，可作为 抗肿瘤药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是基于抗肿瘤多肽分子设计理论和固相化学合成技术，提供一种具 有高效、低毒的抗肿瘤活性的多肽。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
[0007] 本发明的多肽由30个氨基酸组成，氨基酸序列见SEQ ID No. 1，分子量为 3299.2Da。
[0008] 本发明中，优选的，在SEQ ID No. 1的羧基端氨基酸上连入NH2，人工酰胺化，以使 合成的多肽结构稳定。
[0009] 本发明的抗肿瘤多肽是通过固相化学合成方法直接获得的。
[0010] 本发明中，优选的，固相化学合成方法包括以下步骤：
[0011] (1)称取Fmoc-Rink Linker -树脂放入小烧杯中，采用ΡΙΡ/DMF溶液去保护 25min，过滤得到去Fmoc的树脂备用；
[0012] (2)经保护的氨基酸在树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行耦合并脱 保护；
[0013] (3)合成的多肽经体积比为TFA :H20 :EDTA = 95:5:5的裂解液进行裂解3小时后， 得到多肽粗品。
[0014] 多肽的合成从羧基端开始，合成的难易、产量的高低与多肽羧基端7-12位氨基酸 的种类有关。如果7-12位氨基酸序列易形成β-折叠或β-转角二级结构，会影响合成过 程中的偶联反应，产生不完整肽段，降低完整产物的得率。本发明的抗肿瘤多肽羧基端12-7 位氨基酸序列为His-Leu-Val-Leu-Asn-Ser。用软件预测二级结构既不易形成β-折叠， 也不易形成β_转角。用IOg树脂起始合成抗肿瘤多肽，得到产品4. 6g，纯度95.9%，总收 率27. 9%。本发明发明人在试验中发现：另一条氨基酸种类和每种氨基酸数量都与本发明 抗肿瘤多肽相同，但羧基端12-7位氨基酸序列为Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly (形成β -转 角）的30肽，在其他条件完全相同的情况下，IOg树脂所得产品1.7g，纯度95.6%，总收 率10. 3%。本发明抗肿瘤多肽的产率几乎是另一条30肽的3倍。同时用氨基酸种类不同 的另外一些30肽作为合成的对照物，本发明抗肿瘤多肽的总收率都比对照物高，有的竟差 7-8 倍。
[0015] 对采用上述制备方法制备得到的多肽粗品进行反向液相色谱纯化，并通过质谱分 析确证。
[0016] 鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验结果显示，30ug本发明多肽滴加在9日龄的鸡胚尿 囊膜血管丰富区，孵育48小时，鸡胚尿囊膜血管的形成受到明显抑制；用脐静脉内皮细胞 做MTT试验，本发明多肽对脐静脉内皮细胞的IC 5tl= 16. 9ug/mL ;上述两项试验结果证实： 本发明多肽具有确切的抑制血管形成的活性。
[0017] 用SGC-7901胃癌细胞和Hela宫颈癌细胞做MTT试验，本发明多肽对SGC-7901胃 癌细胞的IC 5tl= 28. 5ug/mL，Hela宫颈癌细胞的IC5tl= 39. 9ug/mL，证实本发明多肽具有直 接抑制肿瘤细胞增殖的活性。
[0018] 采用H22小鼠腹水肝癌模型，本发明多肽按照10mg/kg/d进行腹腔注射，顺钼按照 2mg/kg/d进行腹腔注射，PBS缓冲液按照200?250uL/只进行腹腔注射，连续给药10天，本 发明多肽的抑瘤率为57. 01 %，顺钼的抑瘤率为82. 02%，PBS的抑瘤率为0 ;试验后动物体 重与试验前比，对照组（给予同体积PBS缓冲液）增加 39. 5%，本发明多肽组增加 22. 65%， 顺钼组降低了 12. 4%。溶血试验未发现本发明多肽有溶血现象；上述试验结果证实：本发 明多肽治疗肿瘤安全有效。
[0019] 因此，更进一步的，本发明还提出了所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应 用。
[0020] 总之，本发明的多肽具有高效、低毒的抗肿瘤活性，且可采用固相化学合成法合 成，产量高，工艺稳定，在肿瘤的药物研发上具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明多肽的质谱检测图；
[0022] 图2为本发明多肽对鸡胚尿囊膜血管形成抑制试验结果图，其中，左图为PBS缓冲 液对照组，右图为本发明多肽组；
[0023] 图3为本发明多肽治疗小鼠 H22肝癌效果图，其中，上面一行为PBS缓冲液对照 组；中间一行为本发明多肽组（l〇mg/kg/d);下面一行为顺钼组（2mg/kg/d);
[0024] 图4为本发明多肽溶血试验结果图，其中，左侧试管为生理盐水阴性对照组，中间 试管为蒸馏水阳性对照组，右侧试管为本发明多肽给药组。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0026] 本发明中所出现的缩略语的说明：
[0027] Fomc 9_莉甲氧撰基
[0028] PIP 哌啶
[0029] HOBt 1-羟基苯并三唑
[0030] DIC N, N-二异丙基碳二亚胺
[0031] DMF 二甲基甲酰胺
[0032] TFA 三氟乙酸
[0033] EDT 1，2-乙二硫醇
[0034] DMSO 二甲基亚砜
[0035] 实施例1制备本发明多肽
[0036] 以下制备多肽的Fmoc-Rink Linker-树脂，Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、裂解试 剂均购买于上海吉尔生化有限公司。
[0037] 1. 1本发明多肽树脂的合成
[0038] 本发明多肤树脂为：Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Met-His(Trt)-Ser(tBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Asp (OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Pro-Val-Leu-His( Trt)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Pro-Leu-Ser(tBu)-Gly-Gly-Met-NH-Rink Linker-树脂。使用Fmoc- Rink Linker -树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应， 依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得本发明多肽树脂。本实施例所使用的保护氨基酸 从树脂起算第1至第30个氨基酸相对应的保护氨基酸如下表所示 ：
[0039] 表1保护氨基酸
[0040]
【主权项】
1. 一种抗肿瘤多肽，其特征在于，所述的抗肿瘤多肽的氨基酸序列为SEQ ID No. 1所 /_J、i〇
2. 根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，在SEQ ID No. 1的羧基端氨基酸上 连入NH2，人工酰胺化，以使合成的多肽结构稳定。
3. 制备权利要求1或2所述的抗肿瘤多肽的方法，其特征在于，所述制备方法为固相化 学合成法。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 称取Fmoc-Rink Linker -树脂，采用PIP/DMF溶液去保护25min，过滤得到去Fmoc 的树脂备用； (2) 经保护的氨基酸在树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并脱保 护； ⑶合成的多肽经体积比为TFA :H20 :EDT = 95:5:5的裂解液进行裂解3小时后，得到 多肤粗品。
5. 权利要求1或2所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其制备方法和应用。本发明所述的抗肿瘤多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为3299.2Da。研究表明本发明多肽具有抑制血管形成和肿瘤细胞增殖的活性，且治疗肿瘤安全有效。因此，本发明的一种具有高效、低毒的抗肿瘤活性的多肽将在肿瘤的药物研发上具有重要的应用价值。
【IPC分类】C07K1-20, A61P35-00, A61K38-16, C07K14-00, C07K1-04, C07K1-06
【公开号】CN104530199
【申请号】CN201410658306
【发明人】杨宝峰, 刘兴汉, 杜智敏, 吕延杰, 初文峰, 王晓峰
【申请人】哈尔滨医科大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月18日
【公告号】CN104530199B