虾蛄多肽在抗肺癌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及虾蛄酶解物的应用，尤其涉及虾蛄酶解多肽在抗肺癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 虫下蛄（Oratosquilla oratoria)隶属节肢动物门、甲壳纲、软甲亚纲、口足目、虫下 蛄科、口虾蛄属，又名东方虾蛄、皮皮虾、富贵虾、濑尿虾等，广泛分布在中国、日本、韩国以 及东南亚的沿海地区。我国南北沿海均有大量生产，产量很大，虾蛄肉质鲜美，营养丰富， 价格低廉，备受消费者喜爱。目前对虾蛄的研究主要包括：虾蛄乙醇提取物能抑制CNE-2Z 细胞裸鼠移植瘤的生长，降低CNE-2Z细胞体外侵袭能力，口虾蛄神经系统一氧化氮合酶的 NADPH2d组织化学定位研究等，虾壳的利用大多数是粉碎作为饲料，提取甲壳素[61]，提取营 养性物质等。据报道，虾蛄壳中的粗蛋白含量达到36%，但现在对虾蛄蛋白水解成多肽的研 究尚少。
[0003] 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，发病率越来越高，目前已有的 化疗药物虽对大多数肿瘤有一定的疗效，但选择性差、毒副反应大、耐药性等问题依然非常 明显。因此，寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍势在必行。多肽因其分子量小、无免疫 原性、活性高、副作用小，尤其是对多药抗性的肿瘤细胞系也有很好的抑制活性。目前已在 多种海洋生物中提取了具有抗肿瘤活性的生物多肽，如邓伟等发现藻蓝蛋白酶解多肽对人 宫颈癌HeLa细胞株的体外生长有明显的抑制作用；杨永芳等酶解紫贻贝所得的紫贻贝多 肽对前列腺癌PC-3细胞和DU-145细胞有特异性的增殖抑制作用，并且对DU-145细胞的抑 制作用强于对PC-3细胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶多肽在0. 25-1. 0g · L 1范围 内，多肽能明显的抑制肺癌细胞A549和Ketr-3细胞的增殖，同时还能抑制细胞蛋白质的合 成，并呈明显的剂量依赖性。
[0004] 近年来，随着经济的快速繁殖，肺癌的发病率和死亡率快速增加，成为对人类健康 和生命威胁最大的恶性肿瘤，研究虾蛄多肽在抗肺癌中的应用具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种虾蛄多肽在抗肺癌中的 应用，尤其提供虾蛄多肽在抑制肺癌H1299细胞增殖中的应用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种虾蛄多肽在抑制肺癌H1299 细胞增殖药物中的应用，其中药物的具体实现形态可为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂等。
[0007] 上述虾蛄多肽的制备方法包括以下步骤：新鲜虾蛄洗净去壳，取虾蛄肉，加入质量 比为1:3~4的蒸馏水匀浆，将溶液的pH值调节为5~9,加入0. 04~0. 20%溶液质量的 胰蛋白酶，40~60°C保温水解5~9h，水解完成后95~100°C、10~15min进行灭酶，将水 解液7500~8000r/min离心20~25min，取上清液，旋转蒸发，冷冻干燥得虾蛄多肽。
[0008] 作为优选,虾蛄多肽通过以下步骤制得，新鲜虾蛄洗净去壳,取虾蛄肉加入质量比 为1:3的蒸馏水匀浆，将溶液的pH值调节为9,加入0. 20%溶液质量的胰蛋白酶，55°C保温 水解5h，水解完成后100°C、15min进行灭酶，将水解液7500~8000r/min离心20~25min， 取上清液，旋转蒸发，冷冻干燥得虾蛄多肽；由该方法制得的虾蛄多肽对肺癌H1299细胞株 的体外抑制率达61. 8%。
[0009] 所述虾蛄多肽在5~25mg/ml浓度下，可显著抑制H1299细胞增殖，并且对H1299 细胞的增殖抑制率达到40. 3%以上。
[0010] 进一步，所述虾蛄多肽在20~25mg/ml浓度下，可显著抑制H1299细胞增殖，并且 对H1299细胞的增殖抑制率达到66. 8%以上。
[0011] 所述虾蛄多肽包括分子量为10~5kd的第一组分、分子量为5~3kd的第二组分 以及分子量小于3kd的第三组分，其中该第三组分对H1299细胞的增殖抑制率大于第一组 分和第二组分。
[0012] 与现有技术相比，本发明的优点在于：以虾蛄为原料，酶解虾蛄肉获取虾蛄多肽， 研究虾蛄多肽对肺癌H1299细胞的增殖抑制性。虾蛄来源广泛，在我国沿海均有分布，营养 丰富，并且虾蛄多肽的提取方法温和，工艺简单，提取的虾蛄多肽对体外培养肺癌H1299细 胞的增殖抑制效果显著，5~25mg/ml浓度下，对H1299细胞的增殖抑制率达到40. 3 %以 上。
【附图说明】
[0013] 图1为pH值对虾蛄酶解多肽抗肿瘤活动的影响；
[0014] 图2为加酶量对虾蛄酶解多肽抗肿瘤活动的影响；
[0015] 图3为酶解温度对虾蛄酶解多肽抗肿瘤活动的影响；
[0016] 图4为酶解时间对虾蛄酶解多肽抗肿瘤活动的影响；
[0017] 图5为各浓度虾蛄酶解多肽对肺癌H1299细胞的增殖抑制率。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0019] 实施例1 :虫下蛄多肽的制备
[0020] (1)酶解工艺
[0021] 采用胰蛋白酶水解虾蛄软体组织：将虾蛄洗净去壳，将虾蛄肉加入质量比为1:3 的蒸馏水进行匀浆，用〇· lmol/L HC1和0· 5mol/L NaOH调节溶液的pH值，加入胰蛋白酶进 行保温水解，水解完成后l〇〇°C、lOmin进行灭酶，将水解液8000r/min离心20min,取上清 液，旋转蒸发，冷冻干燥。
[0022] (2)酶解工艺的影响因素和优化
[0023] 按照上述工艺步骤，观察pH值、加酶量、温度和酶解时间等因素对酶解工艺的影 响，比较酶解多肽在不同水解条件下的抗肿瘤活性，从而确定最佳酶解条件。
[0024] (2. 1) pH值影响虾蛄酶解多肽对H1299细胞的增殖抑制率
[0025] 如图1所示：在一定的范围内，随着pH值的增加，酶解多肽的抗肿瘤活性呈现上升 趋势，当pH值为8时抗肿瘤活性最高，再继续增加 pH值，抗肿瘤活性又有所下降。（2. 2)加 酶量影响虾蛄酶解多肽对H1299细胞的增殖抑制率
[0026] 如图2所示：随着胰蛋白酶加酶量的增加，虾蛄酶解多肽的抗肿瘤活性逐步增强， 当加酶量为0. 20 %时抗肿瘤活性最强。
[0027] (2. 3)酶解温度影响虾蛄酶解多肽对H1299细胞的增殖抑制率
[0028] 如图3所示，酶解温度对胰蛋白酶酶解虾蛄多肽的抗肿瘤活性变化明显，在一定 范围内，随着温度增加，抗肿瘤活性上升，继续增加温度，抗肿瘤活性又下降。当温度为55°C 时，抗肿瘤活性最佳。
[0029] (2. 4)酶解时间影响虾蛄酶解多肽对H1299细胞的增殖抑制率
[0030] 如图4所示，在一定范围内，酶解多肽的抗肿瘤活性随着酶解时间的增加而下降， 当酶解时间5h时的抗肿瘤活性最强。
[0031] (2. 5)正交实验优化酶解工艺
[0032] 如表1所示，影响虾蛄酶解多肽对肺癌H1299细胞增殖抑制率的各因