一种抗氧化多肽aop-om1及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物技术领域，具体涉及一种抗氧化多肽AOP-OMl及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]抗氧化剂是阻止氧气不良影响的物质，它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。目前已经发现了大量的抗氧化剂，这些抗氧化剂可以被分为以下两大类:1)非基因编码的小分子无助，如维生素E、维生素C、谷胱甘肽等；2)基因编码的大分子物质，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白等。这些抗氧化剂已经被广泛应用于各种领域，包括健康、食品、化妆品及各种工业中，比如作为燃料和润滑剂的稳定剂防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合从而避免引擎积垢形成的目的，单在2007年，工业用途的抗氧化剂的就创造了大约37亿美元的收入。基于抗氧化剂的重要性，科学家们一直在孜孜不倦的寻找着新型抗氧化剂。
[0003]两栖动物是水生动物过度到陆生动物之间的重要类群，其皮肤裸露，表面没有毛发覆盖，直接面对各种生存压力，承当着诸多重要的生物学功能，比如抵御微生物入侵、体色调节、水盐平衡调节等。已经有大量的研宄证据表明，两栖动物的皮肤能分泌大量的活性物质(主要是蛋白和多肽)使得其能完成这些重要的生物学功能。但因药材来源等特殊性，其效应物质基础与作用机制的研宄还较为薄弱，关于其活性成分的报道几乎为零。因此，如何充分利用现代生物技术手段，分离纯化活性多肽并进行结构鉴定，深入开展研宄药材效应物质基础与作用机制研宄，是该领域科研技术人员多年来努力寻求突破的研宄方向之
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【发明内容】
[0004]本发明的第一目的在于提供一种抗氧化多肽A0P-0M1 ;第二目的在于提供所述的抗氧化多肽A0P-0M1的制备方法；第三目的在于提供所述的抗氧化多肽A0P-0M1的应用。
[0005]本发明的第一目的是这样实现的，所述的抗氧化多肽A0P-0M1的氨基酸序列如SEQ ID:N0.1 所示。
[0006]本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤:
A、取原料大绿臭娃皮肤分泌物lOOmg，加入Iml去离子水溶解，上SephadexG-75柱，用Tris-HCl缓冲液以流速1.5ml/min进行洗脱，每1min收集一次，分别测定洗脱液在280nm下的吸光度，收集合并活性峰值组分的洗脱液，浓缩干燥后得到浸膏a ;
B、Img浸膏a中加入Iml去离子水溶解，上Hypersil0DS2色谱柱，用乙腈以lml/min流速进行洗脱，监测215nm下的吸光度，收集合并活性峰值组分的洗脱液，浓缩干燥后得到目标物。
[0007]以上述分离纯化方法制备得到的抗氧化多肽A0P-0M1的结构式通过以下方法鉴定出来的: 1、氨基酸序列的测定:
纯化得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl在全自动蛋白质序列测定仪(岛津PPSQ-31A)上经Edman降解法，测定了大绿臭娃皮肤抗氧化肽AOP-AMl氨基酸全序列，结果表明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl具有本发明SEQ ID NO:1所示的结构。
[0008]2、质谱分子量测定:
基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)检测了纯化得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1的精确分子量，所用仪器为Bruker公司Autoflex III T0F/T0F质谱仪。大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl质谱测定的分子量分别为938.1道尔顿，质谱结果揭示大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1不存在翻译后修饰。
[0009]本发明的第三目的是这样实现的，所述的抗氧化多肽A0P-0M1在制备抗氧化药物中的用途。
[0010]本发明是在两栖动物滇蛙的皮肤中发现了一类新型的抗氧化剂，其化学本质为多肽，和传统的两大类抗氧化剂不同，其由基因编码，但分子量却很小。此后，在一些两栖动物皮肤中也发现了这一类物质，但和传统的抗氧化剂相比，我们对这一类新型抗氧化剂的结构和功能了解还知之甚少。大绿臭蛙是中国特有的一种臭蛙，广泛分布于强紫外照射的云贵高原，根据其生境，我们推测其皮肤能分泌高效的抗氧化剂使得其能抵御紫外照射所造成的伤害。本发明从中国产大绿臭蛙的皮肤中得到了 I个新颖的抗氧化多肽A0P-0M1，其抗氧化活性很强，约为维生素E的200倍。
【附图说明】
[0011]图1为本发明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1的G-75分子筛层析图；
图2为本发明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1的HPLC反相C18柱层析图；
图3为本发明分离纯化天然大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1的质谱图；
图4为本发明分离纯化大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1的自由基ABTS+清除活性图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0013]本发明所述的抗氧化多肽A0P-0M1的氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
[0014]本发明所述的抗氧化多肽A0P-0M1的制备方法，包括以下步骤:
A、取原料大绿臭娃皮肤分泌物lOOmg，加入Iml的去离子水溶解，上SephadexG-75柱，用Tris-HCl缓冲液以流速1.5ml/min进行洗脱，每1min收集一次，分别测定洗脱液在280 nm下的吸光度，收集合并活性峰值组分的洗脱液，浓缩干燥后得到浸膏a ;
B、取浸膏aI mg，加入Iml去离子水溶解，上Hypersil 0DS2色谱柱，用乙腈以lml/min进行洗脱，监测215nm下的吸光度，收集合并活性峰值组分的洗脱液，浓缩干燥后得到目标物。
[0015]A步骤中所述的S印hadex G-75柱需预先用20 mmol/L，pH7.8的Tris-HCl缓冲液平衡24h。
[0016]B步骤中所述的Hypersil 0DS2色谱柱需预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水平衡20 min0
[0017]B步骤中所述的乙腈为含0.1%三氟乙酸的乙腈。
[0018]B步骤中所述的洗脱是在线性梯度洗脱，即乙腈浓度从0%升至100%所花的时间为100 min0
[0019]本发明的应用为所述的抗氧化多肽AOP-OMl在制备抗氧化药物中的用途。
[0020]本发明提供的大绿臭蛙皮肤抗氧