一种复合酶制备黑豆抗氧化多肽粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及抗氧化多肽粉制备领域，具体涉及一种复合酶制 备黑豆抗氧化多肽粉的方法。
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【背景技术】
[0003] 我国大豆资源丰富，其中黑豆被称为"豆中之王"，黑豆是一种具有高蛋白、低热量 特点的绿色食品。黑豆自古就是一种药食兼用的保健食材，中医理论认为黑豆味甘性平， 具有活血化瘀、乌发明目、延年益寿等功效。现代研究表明，黑大豆含有丰富的蛋白质、月旨 肪和微量元素，还含有皂苷、黄酮等功能因子，其优质豆类蛋白质比普通黄豆高24. 5 %，且 必需氨基酸组成结构水平总体优于黄豆，与黄豆相比，黑豆赖氨酸高出15. 5%，苏氨酸高出 15. 3%，蛋氨酸高出29%，适于抗氧化蛋白肽类产品的开发应用。
[0004] 黑豆多肽是指黑豆蛋白质经酶水解、分离精制等过程而获得的对分子量低的多肽 混合物，其水溶性很高（可溶性氮NSI约为99% )，可作为新的治疗药剂、功能食品添加剂 或饲料添加剂来使用。现代营养学研究发现，多肽具有比氨基酸吸收快、吸收率好、生物效 价高等特点，是具有多种生理功能的活性物质。近几年来，飞速发展的生物技术和分离纯化 技术，使得人们发现存在于生物体内的多肽达到了数万种，且具有不同的生理功效。黑豆中 蛋白含量丰富，可以通过酶解获得功能性多肽。据报道，黑豆多肽具有调节人体生理功能， 如具有易吸收和低过敏性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、增 强运动员体能，帮助恢复疲劳、促进钙磷和其他微量元素的吸收、促进大脑发育、提高记忆 力增强免疫功能、保护表皮细胞、防止黑色素细胞沉淀等多种生物功能。因此，以黑豆为原 料，制备具有抗氧化活性的肽类物质正受到蛋白制造者的关注，功能性黑豆多肽具有广阔 的发展前景。
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【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种复合酶制备黑豆抗氧化多肽粉 的方法，所得黑豆抗氧化多肽粉降低了成本。
[0007] 为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为： 一种复合酶制备黑豆抗氧化多肽粉的方法，包括以下步骤： 第一步，黑豆蛋白质的分离 步骤1，挑选黑豆，除去杂质后置于4-KTC水中浸泡6-10h去除黑豆皮，置于烘箱中 50-60°C下烘5-6h，使其含水量低于10%，再将烘干后的去皮黑豆研磨过筛得黑豆粉； 步骤2,将黑豆粉与脱脂溶剂按照质量体积比为1:10-15g/mL混合后于40-50°C下搅 拌，倾去上清液，再加入石油醚继续搅拌，静置5h以上，倾去上清液，将沉淀物风干得脱脂 黑豆粉； 步骤3,取脱脂黑豆粉按照l:8-10g/mL固液比加入蒸馏水搅拌，用乳酸调pH至 4. 5-5. 5,再加入-0. 5-0. 9%黑豆粉重量的纤维素酶、0. 5-0. 7%的半纤维素酶和0. 1-0. 4%的 果胶酶，搅拌后35-45°C下震荡卵育30-50min，再升温至50-55°C，再加入1. 0%黑豆粉重量 的碱性内切蛋白酶，5%的碳酸钠溶液调pH至7. 5-8. 0,继续震荡1-2h，加热至85-95°C，并 保温10-20min，4000-5000rpm离心15-20min，收集上清液，离心后的沉淀按照脱脂黑豆粉 固液比1:3-5g/mL的量加入去离子水，再按照第一次酶量的30%依次加入纤维素酶、果胶酶 和碱性内切蛋白酶，离心得上清液，并入第一次离心上清液混合； 步骤4,用乳酸调节上清液的pH至5. 0,离心收集沉淀，再调节上清液pH至4. 7静置 30min，离心收集沉淀，最后一次调节pH至4. 4,静置后离心收集沉淀，混合三次沉淀，用去 离子水洗涤后离心得沉淀物，将沉淀物4°C下预冷处理后，冷冻干燥得黑豆蛋白粉； 第二步，黑豆多肽粉的制备 取第一步所得的黑豆蛋白粉加入4-10°C水中，使得黑豆蛋白液质量浓度为3-6%，搅拌 后调pH值为7. 5-8. 5,加热至90-95°C，灭菌15-20min，再降温至50-55°C，依次经过碱性蛋 白酶水解、风味蛋白酶水解和中性蛋白酶水解，调节pH值至4. 5,将黑豆蛋白液经微滤膜预 处理，再超滤分离纯化，调节pH至4. 5,按照活性炭：黑豆蛋白液为0. 15-0. 3g/L的量添加 活性炭，45-55°C震荡l_2h后静置并离心，收集上清液，浓缩至浓度为25-50%后在4°C下进 行遇冷处理，再冷冻干燥得黑豆抗氧化多肽粉产品。
[0008] 作为优选的是，第一步，步骤1中黑豆粉至少80目。
[0009] 作为优选的是，第一步，步骤2中脱脂溶剂为乙醇和石油醚混合物，其中乙醇体积 分数为15%。
[0010] 作为优选的是，第一步，步骤3中乳酸的浓度为2mol/L ;加入的纤维素酶、半纤维 素酶和果胶酶含量分别为黑豆粉重量的0. 7%、0. 6%和0. 3% ;纤维素酶活性大于10万u/g， 半纤维素酶活性大于5万u/g，果胶酶活性大于1万u/g ;震荡卵育温度为40°C。
[0011] 作为优选的是，第二步，超滤流速15-40mL/min，温度范围4-10°C，进料压力为 0? 21MPa，出 口压力 0? 12MPa。
[0012] 作为优选的是，第二步，碱性蛋白酶水解的碱性蛋白酶为黑豆蛋白粉质量的2% 倍，初始调节温度为40-60°C，pH为7. 5-8. 0,反应时间为30-40min，调节温度为95°C，保 温lOmin ;风味蛋白酶水解的风味蛋白酶为黑蛋白粉质量的1. 5%彳首，初始调节温度为 45-55°C，pH为7. 0-7. 5,反应时间20min，调节温度为95°C，保温lOmin ;中性蛋白酶水解 的中性蛋白酶为黑豆蛋白粉质量的1. 5%倍，调节温度为50°C，pH为6. 5-7. 5,反应时间 20min，调节温度为95°C，保温lOmin。
[0013] 作为优选的是，第二步，冷冻干燥在-20°C冰箱中过夜，冻干温度为_25°C，真空度 0?21bar〇
[0014] 有益效果 (1)在黑豆蛋白提取过程中采用了复合酶法，有效蛋白提取效率达到87. 6%。
[0015] (2)采用了复合酶多级水解黑豆蛋白，针对不同特性的黑豆大分子蛋白质分阶段 进行酶解，提高了蛋白质的水解率和酶的利用率。
[0016] (3)根据水解蛋白酶的酶学特性，调节蛋白溶液的pH值，水解温度，水解时间，分 阶段控制酶的水解环境水解。采用该种方法提高了酶的水解活力，减少了酶用量，缩短了酶 解时间，节约能耗。
[0017] (4)本发明制备的黑豆多肽经过Sephadex G-25分离显示，分子量在lOOOODa以 下的黑豆多肽占到大约60%，功能多肽含量高。
[0018] (5)本发明制得的黑豆多肽具有强的显著地清除自由基能力，在浓度3. 2mg/mL 时，清除率约85%。同时，在8-32mg/mL范围内，黑豆多肽还原能力较强，接近Vc的抗氧化 能力。在浓度40. 00mg/mL时，黑豆多肽对羟基自由基的抑制率达到85%。
[0019] (6)本发明具有操作简单、制备的黑豆多肽粉无苦味、生产成本低、产品回报率高 等特点，不仅可以直接作为高级蛋白营养补充剂，也可以作为植物蛋白饮料、运动食品、军 需食品等，具有良好的应用前景。
[0020] (7)本发明通过酶解去掉了黑豆中的抗营养因子、胀气因子，提高了黑豆多肽的食 用安全性和营养性。
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【附图说明】
[0022] 图1黑豆多肽的在S印hadex G-25凝胶上的洗脱曲线； 图2黑豆多肽和Vc对DPPH ?的清除作用； 图3黑豆多肽及Vc的还原能力； 图4黑豆多肽和Vc羟基自由基抑制。
【具体实施方式】
[0023] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0024] 实施例1黑豆蛋白质的分离 步骤1，要精选优质黑豆，除去杂质后，浸泡在水中6-10 h，水温保持在4-KTC之间；膨 胀好的黑豆揉搓，去除黑豆皮。去皮黑豆置于50 - 60°C烘箱中，烘干5-6h，使其含水量在 10%以下。然后将烘干后的黑豆磨粉，研磨细度要达80目过80%以上，得到黑豆粉。
[0025] 步骤2,粉碎后的黑豆粉与脱脂溶剂按照1:15 (g/mL)比例混合混合后于40_50°C 数显恒温磁力搅拌器上搅拌3h，其中，脱脂溶剂为乙醇和石油醚混合物，乙醇占脱脂溶剂体 积分数为15%，倾去上清液（黄色的，含石油醚、水和脂肪等），再加入新石油醚继续搅拌3h， 然后静置5h以上，倾去上清液，将沉淀部分风干得到色泽为白色的粉末，此粉末即为脱脂 黑豆粉。
[0026] 步骤3,称取一定质量的脱脂黑豆粉，按照固液比为1:8-10 (g/mL)的加入蒸馏水， 常温下用数显恒温磁力搅拌器上搅拌至脱脂黑豆粉与蒸馏水混合均匀。2mol/L的乳酸溶液 调pH值为4. 5-5. 5,添加黑豆粉干重的0. 7%的纤维素酶（1. 5X 103U/g)、0. 6%的半纤维素 酶（5X 103U/g)和0. 3%的果胶酶（1. 5X 103U/g)。充分搅拌均匀后于水浴震荡器上40°C震 荡孵育30-50min。然后将温度提高到52°C，再加入黑豆粉干重的1. 0%的Alcalase (碱性 内切蛋白酶)，5% Na2C02溶液调pH值为7. 5-8. 0继续震荡水解1-2h。加热至90°C，保温 15min。4000-5000r/min离心15-20min，收集上清。离心后的沉淀按照初始脱脂黑豆粉固 液比例1:3-5 (g/mL)的量加入去离子水并充分混匀，然后按照第一次酶量的30%依次加入 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和碱性内切蛋白酶，酶解条件同上。水解完灭酶并离心。得 到的上清液同以第一次离心上清液混合。
[0027] 步骤4,上清液用2mol/L的乳酸溶液调上清液pH值为5. 0,使蛋白质处于等电 点状态而凝聚沉淀下来，4000r/min离心15min，收集沉淀；上清液再用乳酸调节至pH4. 7， 并静置30min，4000r/min离心15min，收集沉淀；上清液再次调节至pH4. 4,静置30min后 4000r/min离心15min，收集沉淀。
[0028] 混合三次离心后的沉淀，去离子水洗并离心两次，弃去上清液，沉淀即为黑豆蛋 白。4°C低温下进行预冷处理后，置于-20°C冰箱冷冻过夜，然后在真空冷冻干燥机上冻干， 冻干温度_25°C，真空度0.21bar，等样品完全干燥后，将冻干后的蛋白粉取出，即得黑豆蛋 白粉。用本方法提取的黑豆蛋白提取率达到87. 6%。
[0029] 实施例2黑豆多肽粉的制备 取第一步所得的黑豆蛋白粉加入4-10°C的水至蛋白液浓度为3-6%，搅拌均匀，调pH值 7. 5-8. 5,加热至90-95°C，15-20min灭菌处理同时使大分子蛋白变得松软易于后续酶解， 接着将蛋白溶液降温到50-55°C，再按照以下步骤水解： Alcalase (碱性蛋白酶）水解：取少量蛋白溶液加入黑豆蛋白粉质量2%倍的碱性蛋白 酶，搅拌混合均匀后，加入剩下的蛋白溶液，调节温度40-60°C，pH7. 5-8. 0，反应时间30- 40min，调节温度95°C，保温lOmin，灭酶得第一水解液。
[0030] Flavourzyme (风味蛋白酶)水解：取黑豆蛋白粉质量1. 5%倍的风味蛋白酶加入第 一水解液，再按照黑豆蛋白粉质量的1. 5%的量，调节温度50°C，反应20min，pH7. 0-7. 5,然 后调节温度95°C，保温lOmin，灭酶得第二水解液。
[0031] Neutrase(中性蛋白酶