一种重组鸡干扰素α标准品的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组干扰素标准品的制备方法，具体涉及一种重组鸡干扰素a 标准品的制备方法。
【背景技术】
[0002] 作为新农村经济建设中的重要环节之一，禽类养殖一直是农民增收的重要途径和 手段。但长期以来，畜禽传染病不仅给从事养禽业的农民造成了重大损失，而且对人类健康 造成了严重的威胁。我国每年因各种病毒性疾病引起畜禽死亡率高达15%~20%;由此导 致的经济损失已超过数十亿元。一些病毒的高致病性毒株常导致禽类急性大规模死亡，对 养鸡业和公共卫生具有很大危害。此外还有很多病毒性疾病对鸡养殖业有着不同程度的影 响，如减卵综合症等；给经济带来不小损失。而禽类的人畜共患病对人类健康则带来直接危 害，亟需高度关注。
[0003]目前针对禽传染病常用的药物治疗主要采用人用抗生素和抗病毒化学药物进行 治疗，但是引起的食品药物残留问题，给人类健康带来威胁。现在一些国家已明令禁止一些 抗生素和抗病毒药物在养殖业中的应用。因此，使用无任何毒副作用的干扰素来治疗和预 防禽类病毒性疾病将是当前较为关注的问题。
[0004] 干扰素是一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和 免疫调节作用的蛋白质，1957年由Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因 子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因 转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照干扰素的产生细 胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为a、0、y三种型。现已知，干扰素 a在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合 成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。
[0005] 对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，如动物法和细 胞法等进行检测。这些方法本身变异性较大，因此，标准品是生产中必不可少的组成部分， 在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要 的作用。
[0006] 目前已有人干扰素标准品面市，猪的干扰素标准品已获得发明专利，然而目前国 际国内均没有重组鸡干扰素a的标准品，由于干扰素具有种属特异性，人或者猪的的干扰 素标准品并不适用于鸡干扰素，这给鸡干扰素在防治禽病毒性疾病中应用研究和生产工作 带来很多不便。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种重组鸡干扰素a标准品的制备方法，此标准品可用于生物学活 性检测，可用作重组鸡干扰素a效价测定的参考标准。
[0008] 按照此方法制备的重组鸡干扰素a抗病毒活性标准品工作效价为：9. 0X10SU/ mL ;SDS-PAGE检测其纯度为97. 34% ;HPLC检测其纯度为99. 79% ;相对分子量为35KD ; N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为A CNHLRPQDATFSHD。
[0009] 本发明技术方案为：
[0010] -种重组鸡干扰素a标准品的制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)将重组鸡干扰素a的重组菌进行发酵和诱导，后直接收集菌体破碎后上清提 取总蛋白，所述重组鸡干扰素〇的重组菌为此21/^￡1'-32€^〇1正~€ [工程菌，其0嫩序列 如序列表 SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。
[0012] (2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化，即可得重组 鸡干扰素a纯化后蛋白溶液。
[0013] (3)向重组鸡干扰素a纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即 可制得重组鸡干扰素a标准品。
[0014] 步骤（1)具体包括以下步骤：
[0015] (1-1)将工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37°C培养16~24小 时，克隆接种至2~3mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C摇床震荡培养18h，得到菌 液；
[0016] (1-2)将步骤（1-1)得到的菌液接种至50~200mL LB培养基中，菌液与培养基的 体积比为1 :1〇~100,置37°C摇床培养18h，转速为200~220r/min，作为发酵种子菌液；
[0017] (1-3)将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接PH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭 菌温度为121°C，灭菌时间为20min ;
[0018] (1-4)将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养 基的体积比为1:10~100,设置温度为37°C、溶氧为30%、转速为220~270r/min、PH为 7. 2~7. 4条件下发酵；当发酵罐内的0D6。。达到0. 6~1. 0时，加入异丙基-0 -D-硫代吡 喃半乳糖苷至终浓度为0. 5~lmmol/L，调温度至32°C，诱导表达4~5h，得到发酵液；
[0019] (1-5)将发酵液4°C条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mL生理盐水重 悬菌体，在lOOObar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4°C条件下8000~12000r/min离 心10~15min，收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组鸡干扰素a蛋白。
[0020] 所述亲和层析方法如下：纯化所用洗脱液PH为8. 0,由三羟甲基氨基甲烷、咪唑组 成，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mM，咪唑的浓度为10mM，收集rChIFN-a蛋白峰。
[0021] 所述阴离子交换层析纯化方法如下将经过亲和层析纯化后收集的蛋白，进一步采 用PH为6. 5的洗脱液在阴离子交换层析柱上进行线性洗脱，洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、 NaCl组成，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mM，NaCl的浓度为1M，收集rChIFN-a蛋白峰。
[0022] 所述分子筛层析纯化方法如下：将离子交换层析收集到的样品浓缩后，进一步经 分子筛层析柱纯化，采用PH为7. 4的洗脱液洗脱，洗脱液由Na2HPOJP NaCl组成，Na 2HP04 的浓度为50mM，NaCl的浓度为0. 15M，收集rChIFN- a蛋白峰。
[0023] 步骤（3)具体包括以下步骤：将重组鸡干扰素a纯化后蛋白溶液用0. 22 ym滤膜 过滤除菌，用10mm〇l/L PBS稀释后加入终浓度为80~150mL/L甘油、0. 12~0. 25g/mL甘 露醇和0. 025~0. 085g/mL蔗糖冻干保护剂，优选终浓度为100mL/L甘油、0. 12g/mL甘露 醇、0.025g/mL蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥，此处用PBS作为稀释剂具有盐平衡、可 调整的适宜PH缓冲作用，能够保护生物蛋白的结构及生物活性物质保持其最完整的特性。
[0024] 采用本发明制备方法制备得到的组鸡干扰素a标准品的N-末端氨基酸序列从第 十个氨基酸开始为A CNHLRPQDATFSHD。
[0025] 采用以上制备方法制备得到的组鸡干扰素a标准品的效价测定方法为：鸡胚成 纤维细胞作为测试细胞，重组鸡干扰素a标准品作为供试品，重组人干扰素a作为对照 品，将供试品和对照品分别制成不同的稀释度，在CEF/VSV系统上对其效价进行标定。
[0026] 本发明重组鸡干扰素a标准品的工作效价为9. 0X10sU/mL。
[0027]目前国际国内均没有重组鸡干扰素a的标准品，本发明提供一种重组鸡干扰素 a生物学活性检测用标准品的制备方法，为建立重组鸡干扰素a质量标准奠定基础。
[0028] 本发明制得的重组鸡干扰素a的标准品为冻干制剂，2~8°C可长期保存，在低于 25 °C室温下可保存两年。
[0029] 按此方法制备的重组鸡干扰素a作为标准品可用于重组鸡干扰素a特性鉴别和 效价测定的比对，以此为标准可使不同批次测定的重组鸡干扰素a效价检测结果更为可 靠可信。
【附图说明】
[0030] 图1为重组鸡干扰素a SDS-PAGE检测结果图：
[0031] M ：Marker
[0032] 1 :重组鸡干扰素a原液；
[0033] 2 :重组鸡干扰素a亲和层析纯化后样；
[0034] 3:重组鸡干扰素a阴离子交换层析洗脱样（杂蛋白）；
[0035] 4:重组鸡干扰素a分子筛层析纯化后目的蛋白样；
[0036] 图2为重组鸡干扰素a HPLC C18反相层析C蛋白纯度检测结果图。
【具体实施方式】
[0037] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0038]BL21/pET_32a-rChIFNa工程菌，由安徽九川生物科技有限公司自制（农业部转 基因安全证书：农基安证字2014第034号）。
[0039] 实施例一
[0040] 重组鸡干扰素a标准品的制备
[0041] 1.重组鸡干扰素a蛋白溶液的制备
[0042] 1. 1将工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37°C培养24小时，克隆 接种至3mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C摇床震荡培养18h，得到菌液；
[0043] 1. 2将步骤（1-1)得到的菌液接种至200mL LB培养基中，菌液与