培养基的体积比 为1 :100,置37°C摇床培养18h，转速为220r/min，作为发酵种子菌液；
[0044] 1. 3将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接PH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌 温度为121°C，灭菌时间为20min;
[0045] 1. 4将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基 的体积比为1:100,设置温度为37°C、溶氧为30%、转速为270r/min、PH为7. 4条件下发酵； 当发酵罐内的〇D6。。达到0. 6时，加入异丙基-D-硫代P比喃半乳糖苷至终浓度为lmmol/ L，调温度至32°C，诱导表达5h，得到发酵液；
[0046] 1. 5将发酵液4°C条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mL生理盐水重悬 菌体，在lOOObar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4°C条件下12000r/min离心10min， 收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组鸡干扰素a蛋白。
[0047] 2.重组鸡干扰素a蛋白溶液的纯化
[0048] 2. lHis亲和层析
[0049] 粗制的重组鸡干扰素a用0.22ixm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTA explorer 100蛋白纯化系统上，用Binding BufferI(PBS)平衡好的His亲和层析柱，用 PBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A2SQnm稳定，再用Elution bufferI(50mM三轻甲基氨 基甲烷，20~50mM咪唑，PH8. 0)洗脱，收集rChIFN-a蛋白峰。
[0050] 2.2DEAE阴离子交换层析
[0051] 将经过His亲和层析纯化后收集的蛋白置换到Binding BufferII(50mM三轻甲 基氨基甲烷，PH6. 5)中后，上样通过用Binding BufferII平衡好的DEAE阴离子交换层析 柱，再用 Binding BufferII过柱至 A2SQnJE稳定后，用 Elution BufferII(50mM 三轻甲基 氨基甲烷，1M NaCl，PH6. 5)线性梯度洗脱，收集rChIFN-a蛋白峰。
[0052] 2. 3分子筛层析
[0053] 将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding BufferIII(50mM Na2HP04,0. 15M NaCl，PH7. 4)平衡好 Superdex 200 分子筛层析柱，用 Binding BufferIII洗 脱，收集rChIFN-a蛋白峰。
[0054]3.重组鸡干扰素a标准品的制备
[0055] 将重组鸡干扰素a纯化后蛋白溶液用〇. 22 y m滤膜过滤除菌，用10mmol/L PBS稀 释后加入终浓度达100mL/L甘油、0. 12g/mL甘露醇、0. 025g/mL蔗糖冻干保护剂混匀后，分 装成规格为2. 2mL/瓶的半成品，分装后迅速冷冻真空干燥，按制品冷冻真空干燥法进行， 即可制得重组鸡干扰素rChIFN- a标准品。
[0056] 4.重组鸡干扰素a标准品的检测
[0057] 蛋白质含量测定：对上述纯化后的rChIFN- a标准品用Lowry法检测蛋白浓度，其 蛋白含量为〇. 4mg/mL。
[0058] SDS-PAGE进行纯度鉴定：对rChIFN- a标准品进行SDS-PAGE鉴定纯度，其纯度为 97. 34%，相对分子量35kD (图1)。
[0059] 册^：纯度鉴定1〇1正^€[标准品经111^(：(：18 3了4.6/100反相层析柱进行分析 只得到一个主吸收峰如图2,有1个峰为杂峰。通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的 99. 79% (图 2)。
[0060] N-端氨基酸序列测定：
[0061] (a)酶切：取纯化后的rChIFN-a蛋白200 yg，加4单位重组肠激酶，与酶切缓冲 液中4°C条件下酶切16小时。
[0062] (b) SDS-PAGE电泳：取酶切产物进行SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯 酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min。
[0063] (c)转膜：将蛋白电转到PVDF(聚偏氟乙烯）膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液。
[0064] (d)立春红染色：将PVDF膜放到立春红染液中染色，待看到蛋白条带后拿出，用水 洗去背景颜色。
[0065] (e)将目的条带剪下放于Eppendorf管中，_20°C保存，用Edman降解法进行N端 氨基酸测序。
[0066] (f)N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为A CNHLRPQDATFSHD， 说明纯化后的目的蛋白就是重组鸡a干扰素。
[0067] 实施例二：
[0068] 将工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37°C培养16小时，克隆接种 至2mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C摇床震荡培养18h，得到菌液；
[0069] 将步骤（1-1)得到的菌液接种至50mL LB培养基中，菌液与培养基的体积比为1: 10,置37°C摇床培养18h，转速为200r/min，作为发酵种子菌液；
[0070] 将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接PH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温 度为121°C，灭菌时间为20min;
[0071] 将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的 体积比为1:10,设置温度为37°C、溶氧为30%、转速为220r/min、PH为7. 2条件下发酵；当 发酵罐内的〇D6。。达到1. 0时，加入异丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0. 5_〇1/ L，调温度至32°C，诱导表达4h，得到发酵液；
[0072] 将发酵液4°C条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mL生理盐水重悬菌 体，在lOOObar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4°C条件下800r/min离心15min，收集 上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组鸡干扰素a蛋白。
[0073] 采用与实施例一相同的方法进行纯化、标准品制备和检测。
[0074] 实施例三：
[0075] 重组鸡干扰素a标准品的效价测定
[0076] 本检测方法根据rChIFN- a可以保护鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF)免受水疱性口 炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV)的侵害作用 的原理，以干扰素抑制病毒致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE)现象作为检测其活 性的方法。即以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞（50%)免受病毒攻击 的稀释度的倒数定为干扰素单位（或称效价），常以单位（U)表示，并用国家标准品校正结 果。该结果经用结晶紫染料对存活CEF细胞染色观察后，根据着色深浅，按Reed-Munch公 式计算出所测定干扰素的效价。
[0077] 1?实验材料
[0078] 重组人干扰素a标准品：作为对照品，购自北京中国食品药品鉴定研究院，干扰 素a国家标准品，批号：97/04,下称标化干扰素；
[0079] 重组鸡干扰素a标准品：由实施例一制得，作为供试品；
[0080] 细胞：鸡胚成纤维细胞（CEF);
[0081]病毒：攻击病毒为水疱性口炎病毒（VSV)，由安徽医科大学临床病毒研究所惠赠；
[0082]96孔细胞培养板：其编号方法为：从左至右的12列分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12进行编号；从上至下的前五行分别用A、B、C、D、E、F进行编号。
[0083] 2.主要操作步骤和方法
[0084] 2. 1鸡胚成纤维细胞制作
[0085] I .准备：取各种已消毒的培养用品置于负压生物安全柜的净化台面，紫外线消 毒 20min〇
[0086] II .选胚：取9~10日龄SPF鸡胚，用新洁尔灭擦洗蛋壳，干燥后，用碘酒、酒精消 毒蛋壳，用灭菌镊子和手术剪打开气室。
[0087]III.处理组织：用另一套消毒灭菌的镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放 灭菌生理盐水中。把鸡胚组织块置于消毒灭菌的烧杯中，用灭菌Hanks液漂洗2~3次，去 除血污，将组织块移入灭菌青霉素瓶中，用灭菌眼科剪把组织剪成1~2毫米大小的块状， 加入终浓度为0. 25%的胰蛋白酶，将其置入37°C恒温水浴箱中消化，2-3min摇晃一次，消 化时间依组织块的大小和组织的硬度而定，一般约12min。视鸡胚日龄大小而定，越小消化 时间越短，见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
[0088]IV.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观 察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化。加入10mL含10%小牛血清的营养 液，用吸管反复吹打，使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤，滤掉尚未充分消化开的组织块， 吸出上清。
[0089] V .计数：用计数板计数，补加培养液调整细胞数目为1 X 106个/mL，分装于多个 细胞培养瓶中，10mL/瓶。将其置入含5%0)2细胞培养箱中，37°C。培养24h进行观察。一 般在24~48h可形成单层细胞。
[0090] 2. 2供试品溶液的制备