[0091] 在无菌条件下操作，将重组鸡a干扰素标准品加入lmL PBS溶解后，在96孔细胞 培养板中，从1:10000 (体积比）稀释度开始做4倍递增系列稀释，共10个稀释度（横排放， 为1-10孔），每个稀释度加4孔（分别为C、D、E、F)，第11孔为CEF细胞对照组，第12孔 为VSV病毒对照组，
[0092] 2. 3对照重组鸡干扰素a的制备
[0093] 在无菌条件下操作，将人干扰素对照品按标示量在96孔细胞培养板中稀释，从 2000IU/mL的稀释度开始，做4倍递增系列稀释，共计制作10个稀释度，每个稀释度加入2 孔（分别为A、B)。
[0094] 2. 3效价测定
[0095] 取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后，消化和收集细胞，用营养培养液配制 成每毫升含1 X 106个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板的前六行中，每孔100 y 1。
[0096] 将配制完成的不同稀释度对照品溶液移入接种CEF细胞的96孔细胞培养板的A、 B行的1-10列中，每孔加入100 y 1，将配制完成的不同稀释度供试品溶液移入接种CEF细 胞的96孔细胞培养板的C、D、E、F行的1-10列中，每孔加入100y 1，于37°C、5% C02条件 下培养18~24h。
[0097] 弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水疱性口炎病毒（VSV，-70°C保存）用培养 液稀释至约100TCID5Q/mL，移入接种CEF细胞的96孔细胞培养板的A、B、C、D、E、F行的1-10 列中，每孔100 y 1，于37°C、5% C02条件下培养24h(镜检供试品溶液的50%病变点在1U/ mL)〇
[0098] 2. 4结果观察
[0099] 将置温箱24h培养物于倒置显微镜下观察。首先观察"细胞对照孔"和"病毒对照 孔"，每孔中出现的CPE用" + "表示。当病毒对照孔出现"+++或++++"，即病毒对照孔中的 细胞出现75~100%的明显病变，正常细胞对照孔中的细胞全部生长良好无病变时，则表 明本次实验对照系统合格，否则弃去重做。
[0100] ++++表示全部细胞病变；
[0101] +++表示75 %细胞病变；
[0102] +++表示50 %细胞病变；
[0103] +表示25 %细胞病变。
[0104] 当干扰素保护孔CPE不再进展，即可观察结果。
[0105] 将上述细胞板盖打开，弃去各孔内液体于消毒液中，加结晶紫染色液1~2滴/ 孔，3~5min后用细水流冲洗孔内残余染液，干燥后即可记录结果。
[0106] 2. 5结果观察
[0107] 重组鸡a干扰素标准品工作效价（U)计算方法及结果：
[0108] A、B排对照组人干扰素各孔细胞均出现了 100%病变，说明人干扰素对照品不适 用于鸡干扰素效价测序系统。
[0109] 供试品组结果记录如下表：
[0110]
[0111] 用Reed-Munch公式计算如下
[0112]
[0113] 即此批干扰素稀释到104X4S23(1:9.0X10 S)时，能保护半数细胞免受"攻击病 毒"损害，本次滴定的重组鸡干扰素a标准品工作效价为：9. 0X10sU/mL。由于本次滴定的 鸡干扰素a标准品每瓶采用lmL稀释，故本次滴定的重组鸡干扰素a标准品工作效价达 至lj :9.0X10SU/瓶。
[0114] 2. 6工作单位修正
[0115] 各实验室所测得的干扰素单位，习惯上一般都称为该实验室"工作单位"；为了表 明某种干扰素效价的高低，就必须用同型国家（际）干扰素标准品加以修正，目前干扰素国 家标准品只有人的，但是干扰素有种属特异性，本实验也证实了人干扰素a不适用于鸡源 性细胞系统的测定效价，所以制备鸡干扰素标准品是非常必要的。
[0116] 上述参照实施例对该重组鸡干扰素a标准品的制备方法和效价测定方法进行的 详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不 脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 将重组鸡干扰素a的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后的上清提取总 蛋白，所述重组鸡干扰素a的重组菌为BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌，其DNA序列如 SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。 (2) 总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化，即可得重组鸡干 扰素a纯化后蛋白溶液； (3) 向重组鸡干扰素a纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制 得重组鸡干扰素a标准品。2. 根据权利要求1所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：步骤（1) 具体包括以下步骤： (1-1)将工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37°C培养16~24小时，克 隆接种至2~3mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C摇床震荡培养18h，得到菌液； (1-2)将步骤（1-1)得到的菌液接种至50~200mL LB培养基中，菌液与培养基的体积 比为1 :10~100,置37°C摇床培养18h，转速为200~220r/min，作为发酵种子菌液； (1-3)将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接PH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温 度为121°C，灭菌时间为20min; (1-4)将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的 体积比为1:10~100,设置温度为37°C、溶氧为30%、转速为220~270r/min、PH为7. 2~ 7. 4条件下发酵；当发酵罐内的OD_达到0. 6~I. 0时，加入异丙基-D-硫代吡喃半乳 糖苷至终浓度为0. 5~lmmol/L，调温度至32°C，诱导表达4~5h，得到发酵液； (1_5)将发酵液4°C条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mL生理盐水重悬 菌体，在1000 bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4°C条件下8000~12000r/min离心 10~15min，收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组鸡干扰素a蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：所述 亲和层析方法如下： 纯化所用洗脱液PH为8. 0,由三羟甲基氨基甲烷、咪唑组成，三羟甲基氨基甲烷的浓度 为50mM，咪唑的浓度为10mM，收集rChIFN- a蛋白峰。4. 根据权利要求1所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：所述阴离 子交换层析纯化方法如下： 将经过亲和层析纯化后收集的蛋白，进一步采用PH为6. 5的洗脱液在阴离子交换层 析柱上进行线性洗脱，洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、NaCl组成，三羟甲基氨基甲烷的浓度为 50mM，NaCl的浓度为1M，收集rChIFN- a蛋白峰。5. 根据权利要求1或4所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：所述 分子筛层析纯化方法如下： 将离子交换层析收集到的样品浓缩后，进一步经分子筛层析柱纯化，采用PH为7. 4的 洗脱液洗脱，洗脱液由Na2HPOjP NaCl组成，Na 2即04的浓度为50mM，NaCl的浓度为0. 15M， 收集rChIFN-a蛋白峰。6. 根据权利要求1所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：步骤（3) 具体包括以下步骤： 将重组鸡干扰素a纯化后蛋白溶液用0.22 ym滤膜过滤除菌，用lOmmol/L磷酸缓冲 液稀释后加入终浓度为80~150mL/L甘油、0. 12~0. 25g/mL甘露醇、0. 025~0. 085g/mL 蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥。7. 根据权利要求6所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法，其特征在于：所述冻干 保护剂为终浓度为lOOmL/L甘油、0. 12g/mL甘露醇、0. 025g/mL蔗糖。8. 根据权利要求1所述的重组鸡干扰素a标准品的制备方法制备得到的重组鸡干扰 素a标准品。9. 根据权利要求8所述的重组鸡干扰素a标准品的效价测定方法，其特征在于：鸡胚 成纤维细胞作为测试细胞，重组鸡干扰素a标准品作为供试品，重组人干扰素a作为对照 品，将供试品和对照品分别制成不同的稀释度，在CEF/VSV系统上对重组鸡干扰素a标准 品效价进行标定。10. 根据权利要求8所述的重组鸡干扰素a标准品在重组鸡干扰素a特性鉴别和效 价测定中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种重组鸡干扰素α标准品的制备方法，将表达重组鸡干扰素α的重组菌进行发酵和诱导，后直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白；然后采用三步纯化法后得到该制剂的纯品，向纯品中加入冻干保护剂进行真空冷冻干燥后得到标准品，按此方法制备的重组鸡干扰素α作为标准品可用于重组鸡干扰素α特性鉴别和效价测定的比对，以此为标准可使不同批次测定的重组鸡干扰素α效价检测结果更为可靠可信。
【IPC分类】C07K1/18, C07K1/22, C07K1/16, C12R1/19, C12P21/02, C07K14/56, C12Q1/70, C12Q1/02
【公开号】CN105039474
【申请号】CN201510532805
【发明人】王明丽, 赵俊
【申请人】安徽九川生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月25日