一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方 法。
【背景技术】
[0002] 粒细胞刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)具有促进粒 系造血干细胞增殖分化及增强成熟细胞功能的作用。它能够在骨髓移植中促进中性白细胞 的增殖，并对癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏症，以及再生障碍性贫血伴随的中 性粒白细胞缺之症有明显的疗效。
[0003] John F. Reidhaar-Olson 研究发现 G-CSF 的 Leul5, Glul9, Gln25, Leu31，Lys34， Lys40，Leu47，Val48，Leu49，Leu54对蛋白活性起重要作用。二硫键对于蛋白受体二聚化，激 活下游信号传导有重要作用，发明人构建的G-CSF多肽（15-75)覆盖G-CSF活性重要的氨 基酸序列，含有完整的二硫键，利于保持其活性。但现有技术的纯化方法应用于所述G-CSF 多肽（15-75)，纯度较低。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种重组粒细胞刺激因子G-CSF(15_75)多肽的纯化方法，该方法包 括以下步骤：
[0005] 1)选用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115工程菌做菌株进行发酵培养；
[0006] 2)发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0? 45 y m滤膜；
[0007] 3)对过滤上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；
[0008] 4)对疏水层析产物阴离子交换，得到阴离子交换液；
[0009] 5)对阴离子交换液进行凝胶过滤，得到重组人粒细胞刺激因子多肽。
[0010] 所述步骤1)的工程菌为保藏号为CGMCC N0:10713的巴斯德毕赤酵母菌，保藏单 位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年4月13日，分类命名：巴斯 德毕赤酵母Pichia pastoris。
[0011] 所述步骤3)的疏水层析其柱填料为phenyl sepharose 6 fast flow (high sub)， 具体实施步骤为：
[0012] 样品预处理：接收步骤2)所得过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5. 0,加固体 NaCl或者硫酸铵调节cd至50ms/cm。
[0013] 平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时栗流速为 20. 0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
[0014] 上样：上样时栗流速为8. 0-18. 5ml/min，上样结束后用平衡缓冲液复平衡5个柱 床体积；
[0015] 洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节栗流速为5. 5-10. 2ml/min，根据UV值 的变化收集主峰。
[0016] 步骤3)所述的平衡缓冲液为10mmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0,加固体NaCl调节cd 50ms/cm ;所述的洗脱缓冲液为 10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 5。
[0017] 所述步骤4)的阴离子交换其柱填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯，具体实施步骤为：
[0018] 样品预处理：接收步骤3)所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8. 5,加 水稀释至cd为l_4ms/cm。
[0019] 平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时栗流速为 20.0 ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
[0020] 上样：将疏水层析峰直接上样，上样时栗流速为8. 5-19. 8ml/min，上样结束后用 平衡缓冲液复平衡5个柱床体积；
[0021] 洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节栗流速为5. 5-10. 2ml/min，根据UV值 的变化收集目的峰。
[0022] 所述步骤4)的平衡缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 5 ;所述的洗脱缓冲液为 100mmol/L HAc-NaAc，pH5. 0。
[0023] 所述步骤5)的凝胶过滤其柱填料为Sephacryl S-100HR，具体操作步骤为：
[0024] 平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液平衡5-10个柱体积，平衡时栗流 速为0. 3-1. 17ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
[0025] 上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样。上样时栗流速为0.3-1. 17ml/ min，样品上样量为柱体积的0. 5% -4%。；
[0026] 洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc缓冲液洗脱，调节栗流速为0. 3-1. 17ml/min，根据 UV值的变化收集目的蛋白溶液。
[0027]所述步骤 5)的HAc-NaAc缓冲液为10mmol/L HAc-NaAc，pH5.0。
[0028] 本发明取得的有益效果：
[0029](1)本发明的纯化方法主要用于G-CSF(15-75)多肽的纯化。
[0030] (2)采用了层析柱纯化处理，操作简单，且优选的填料和流速等参数提高了生产效 率，大大降低生产成本，最后所得的G-CSF (15-75)多肽纯度达到99. 8%以上，比活性达到 了 7.3X107IU/mg〇
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实施例对本发明做进一步的详述，但具体实施例并不对本发明做 任何限制。选用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115作为工程菌进行发酵培养，收集发酵上清， 12000rpm，离心10min，上清液过0? 45 y m滤膜后进行纯化。
[0032] 实施例1:
[0033]疏水柱层析CKK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)填料） 具体实施步骤为：
[0034] 样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5. 0,加固体Nacl调节cd50ms/ cm；
[0035]平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液（10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5. 0， 加固体Nacl调节cd 50ms/cm)，调节栗流速为20.0 ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳 定后，紫外校零；
[0036] 上样：以15ml/min流速上样，上样结束后，用平衡缓冲液（10mmol/L HAc-NaAc缓 冲液，pH5. 0,加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
[0037] 洗脱：使用洗脱液（10mm〇l/L Tris-HCl缓冲液，pH 8. 5)洗脱，调节栗流速为 10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
[0038] 阴离子柱层析（XK50/30层析柱，聚苯乙烯-二乙烯苯（SKI-10)填料）具体实施 步骤为：
[0039] 样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5,加水稀释至cd 为3ms/cm〇
[0040] 平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 5)平衡8 倍柱体积，平衡时栗流速为20. 0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
[0041] 上样：将疏水层析峰直接上样，上样时栗流速为l〇ml/min，上样结束后用平衡缓 冲液（10mm〇l/L Tris-HCl，pH 8. 5)复平衡5个柱床体积；
[0042]洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱（100mm〇l/L HAc-NaAc，pH5. 0)，调节栗流速 为8ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
[0043] 凝胶过滤层析（HR16/70层析柱Sephacryl S-100HR填料）具体实施步骤为：
[0044]平衡：设置检测波长 280nm，用 HAc-NaAc 缓冲液（10mmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0)平 衡5-10个柱体积，平衡时栗流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
[0045] 上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样，上样时栗流速为1.0ml/min，样品 上样量为柱体积的2% ;
[0046] 洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc液洗脱（10mmol/L HAc-NaAc，pH 5. 0)，调节栗流 速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
[0047] 实施例2 :
[0048]疏水柱层析CKK5