专利名称：重组人粒细胞集落刺激因子的复性纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，涉及重组人粒细胞集落刺激因子(recombinanthuman granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的制备方法。
背景技术：
人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)属于造血生长因子家族，主要产生细胞有单核一巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞及某些肿瘤细胞如5637、CHU-2、ST-1等。hG-CSF是造血生长因子中特异地作用于粒系组细胞，促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化的一种细胞因子。已经报道的hG-CSF没有种属特异性，它可以增强中性粒细胞的功能，增加成熟粒细胞数，促进中性粒细胞和祖细胞由骨髓释放入外周血中，并可以增加多种早期祖细胞，从而促进造血干细胞由静止期进入循环。
hG-CSF在各种原因造成的粒细胞减少症中得到了非常广泛的临床应用，但是体内含量甚微，主要的生产途径是通过基因工程方法。1980年，日本东京大学医学研究所新药研究实验室的Shigekazu Nagata等通过测定纯化的G-CSF的部分氨基酸序列，构建了寡核苷酸探针，从CHU-2细胞mRNA所构建的cDNA文库中得到了含有G-CSF片断的cDNA，并用COS细胞表达出有活性的G-CSF蛋白(Nagata S，et al，Nature，1986，319415-418)。L.M.Souza等在人膀胱癌细胞系5637的培养液中也分离到了人G-CSF的基因，并通过E.Coli表达得到了具有多潜能生物活性的rhG-CSF蛋白(Souza L M，et al，Sicense，1986，23261-65)。
大肠杆菌(E.coli)表达系统是生产外源蛋白的主要方法，但是外源蛋白的高表达，往往使蛋白不能折叠成为具有一定空间结构和特定生物学功能的蛋白质，而是聚集成直径为0.5～1μm的不可溶的致密颗粒，称为包涵体(InclusionBody，IB)。包涵体形成的主要原因是因为外源蛋白在表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或者是因为表达宿主的环境不合适，在表达过程中无法折叠形成正确的高级结构(Li lie H，et al，Curr OpinBiot，1998，9442)。以E.Coli为表达系统生产rhG-CSF，表达时也形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽然能够有效的防止细胞内蛋白酶的水解，使表达蛋白易于与其它杂蛋白分离，但是表达蛋白必须经过变性和复性过程，使包涵体折叠成为正确的高级结构，才能具有生物活性。包涵体在蛋白变性剂的作用下，成为可溶性的伸展状态，在去除变性剂或者变性剂的浓度降低时，蛋白自发的从变性的热不稳状态向稳定状态转换，形成具有生物活性的天然结构。然而在去除变性剂的同时，分子内部的二硫键、疏水键等往往来不及形成，从而导致分子间存在大量错误的折叠和聚合，以至蛋白沉淀，使复性收率大大降低，平均只有20％左右。
目前，蛋白质的复性方法主要有稀释复性法、透吸、超滤、凝胶过滤色谱等溶剂交换法，以及将变性蛋白吸附至固相支持物上的柱复性方法等等(US5849883、CN1083488、US2005159589、《军事医学科学院院刊》2000年第3、4期)。但上述方法存在设备要求高、收率低、操作繁琐、存在异构体、易产生沉淀等诸多问题。因此，把rhG-CSF包涵体复性为有生物活性的蛋白质，并尽可能提高复性收率，对生物工作者来说，是一个很大的挑战。
发明内容
本发明提供了一种能够工业化生产的重组人粒细胞集落刺激因子的复性方法。针对重组人粒细胞集落刺激因子在生产中存在的制备过程复杂、存在异构体和复性收率低的问题，本发明设计了能够显著提高复性收率、减少异构体，设备要求简单、成本低的复性液配方和复性方案。
本发明通过改变复性液组成中的离子强度、氧化还原剂比例、增加添加剂等，并使用合适的裂解和复性方法进行包涵体的裂解和复性，使重组人粒细胞集落刺激因子的复性质量收率高于50％；复性液基本不含异构体，而且复性溶液完全澄清，没有沉淀，不需离心和透析即可以进行下一步的层析分离；经进一步层析纯化后，RP-HPLC的纯度即可达97％以上，高于《中华人民共和国药典2005版》第三部的要求。
本发明利用rhG-CSF基因工程菌，按照常规发酵技术发酵后，取湿菌体，用常规中性PBS缓冲液洗去菌体中夹带的未利用的培养基。洗涤后的菌体再重新置于同样的PBS缓冲液中，用高压匀浆法或超声破碎法破碎菌体，收获包涵体粗品。包涵体粗品用含有Urea和Triton的Tris-HCl缓冲液洗涤，获得高纯度包涵体。
将洗涤后的包涵体用含有Urea的裂解液进行裂解，得到均一澄清的裂解液，离心，并使用SephadexG-25层析除去裂解液中过量的还原剂。利用本发明的复性液将rhG-CSF包涵体的裂解上清液稀释、复性。
本发明的rhG-CSF包涵体复性液由盐酸胍(Guanidine-HCl)30-150mmol/L，尿素(Urea)0.3-2.5mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20-150mmol/L(pH7.0-9.0)，半胱氨酸(Cysteine)0.2-5mmol/L，胱氨酸(Cystine)0.04-1mmol/L甘油(Glycerol)1-6％和适量的去离子水组成。优选Guanidine-HCl为50-130mmol/L，Urea为0.6-2.0mol/L，Tris-HCl为40-120mmol/L(pH7.2-8.8)，Cysteine为0.5-3mmol/L，Cystine为0.1-0.6mmol/L，Glycerol为2-5％。更优选Guanidine-HCl为60-100mmol/L，Urea为0.8-1.2mol/L，Tris-HCl为60-100mmol/L(7.5-8.5)，Cysteine为1-2mmol/L，Cystine为0.2-0.4mmol/L，Glycerol为3-4％。
将rhG-CSF复性液直接进行SP-Sepharose Fast Flow等阳离子层析和Superdex 75等凝胶过滤层析，收集得到rhG-CSF产品。活性检测、电泳检测、HPLC检测表明，本发明获得的rhG-CSF的质量超过了《中华人民共和国药典2005版》第三部的要求。
图1为复性并纯化后的rhG-CSF还原SDS-PAGE检测结果图2为复性并纯化后的rhG-CSF非还原SDS-PAGE检测结果图3为复性并纯化后rhG-CSF的RP-HPLC检测结果图4为复性并纯化后rhG-CSF的GF-HPLC检测结果具体实施方式
实施例实施例1rhG-CSF高纯度包涵体的获取rhG-CSF基因工程菌(华北制药金坦生物技术股份有限公司提供)发酵后，取湿菌体1kg，用PBS缓冲液(60mmol/L PB，150mmol/L NaCl，1mmol/LEDTA，pH 7.0)洗涤，洗去菌体中夹带的未利用的培养基等杂质，8000g离心(Avanti J-25，Beckman公司)，收集沉淀，再重新置于以上溶液中，在固液比为1∶10的条件下，混合成均一的悬液，泵入高压匀浆泵中进行高压匀浆破碎(APV30-30CD，APV GAULIN公司)，继而通过离心分离得到湿的包涵体粗品120g。
将上述得到的粗包涵体用缓冲液A(urea 4mol/L，Tris-HCl 20mmol/L，EDTA10mmol/L，TritonX-100 0.2％，pH8.0)和缓冲液B(Tris-HCl 50mmol/L，EDTA10mmol/L，pH8.0)依次洗涤，得高纯度包涵体102g。
实施例2rhG-CSF包涵体的裂解取5g高纯度包涵体，以固液比1∶100的比例用裂解液(8mol/L Urea，100mmol/L Tris-HCl，5mmol/L DTT，2mmol/L EDTA)裂解，室温温和搅拌2-3小时，离心得上清液510ml，并用Lowry法测定蛋白浓度。
将裂解液进行SephadexG-25分离，去除多余的还原剂DTT。
实施例3rhG-CSF包涵体的复性将实施例2获得的去除还原剂的rhG-CSF包涵体的裂解液，分别利用复性液A、B、C、D连续流加稀释5-6小时，最终浓度控制在0.12mg/ml。流加结束后，在4-8℃下，温和搅拌10-12小时。然后在10-15℃下，温和搅拌6-8小时，进行复性。该实施例所用的四种复性液如下
实施例4rhG-CSF的纯化将复性后的rhG-CSF溶液用0.5mol/L盐酸调pH4.0，上样于SP-SepharoseFast Flow阳离子层析交换介质，在50mmol/L醋酸钠-醋酸，柠檬酸钠-柠檬酸的缓冲系统中进行进一步分离，用NaCl的盐梯度洗脱吸附的rhG-CSF。
将离子层析后收集的活性组份进行进一步的分子筛层析精制，层析介质选用高分辨率的Superdex-75，缓冲液选用pH4.0，50mmol/L的醋酸钠-醋酸缓冲液系统。
实验例实验例1rhG-CSF包涵体复性液的蛋白含量和活性检测用Lowry法测定rhG-CSF包涵体复性后的rhG-CSF浓度，用小鼠骨髓白血病细胞(NSF-60)/MTT比色法测定rhG-CSF的活性，测定结果见下表
实验例2rhG-CSF纯化后的比活性和纯度检测用NSF-60/MTT比色法检测用复性液A复性并纯化后的rhG-CSF的比活性，高于1×108IU/mg；还原和非还原SDS-PAGE检测为一条带(附图1、2)，扫描纯度大于99％；RP-HPLC检测(附图3)和GF-HPLC检测(附图4)纯度均高于97％。发明人针对用复性液B、C和D复性并纯化后的rhG-CSF也进行了同样的活性和纯度检测，得到了相同的结论。具体检测结果见下表
实验例3rhG-CSF的稳定性考察对上述4种复性液制备的rhG-CSF产品分别进行常温和加速稳定性考察。结果表明，本发明制备的rhG-CSF产品稳定好，不仅在4℃下0-24个月的活性、电泳、HPLC等结果没有明显变化，而且25℃保存6个月后的活性、电泳、HPLC也没有明显变化。
4℃条件下0-24个月的rhG-CSF比活性(108IU/mg)考察结果 4℃、25℃条件下6个月的hG-CSF稳定性(％)、活性(108IU/mg)考察结果
权利要求
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子包涵体复性液，由下列组分组成盐酸胍30-150mmol/L，尿素0.3-2.5mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐20-150mmol/L，pH7.0-9.0，半胱氨酸0.2-5mmol/L，胱氨酸0.04-1mmol/L，甘油质量体积百分比1-6％和适量去离子水。
2.权利要求1的重组人粒细胞集落刺激因子包涵体复性液，其中盐酸胍50-130mmol/L，尿素0.6-2.0mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40-120mmol/L，pH7.2-8.8，半胱氨酸0.5-3mmol/L，胱氨酸0.1-0.6mmol/L，甘油2-5％。
3.权利要求1的重组人粒细胞集落刺激因子包涵体复性液，其中盐酸胍60-100mmol/L，尿素0.8-1.2mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐60-100mmol/L，pH7.5-8.5，半胱氨酸1-2mmol/L，胱氨酸0.2-0.4mmol/L，甘油3-4％。
4.一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的裂解、复性和纯化，其特征在于，复性步骤采用权利要求1-3所述任一复性液。
5.权利要求4的制备方法，其中复性步骤为复性液连续流加稀释后，在4-8℃下搅拌10-12小时，然后在10-15℃下搅拌6-8小时。
6.权利要求5的制备方法，其中复性液连续流加稀释5-6小时，最终浓度控制在0.12mg/ml。
7.权利要求4-6的任一制备方法，其特征在于，所述裂解步骤包括最后将裂解液分离去除还原剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant humangranulocyte colony stimulating factor，rhG－CSF)的制备方法，包括包涵体的裂解液、复性液组成和裂解、复性方法。复性液由盐酸胍(Guanidine－HCl)、尿素(Urea)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris－HCl)、半胱氨酸(Cysteine)、胱氨酸(Cystine)和甘油(Glycerol)等组成。利用该复性液复性rhG－CSF包涵体，复性工艺简单，成品纯度高，稳定性好。
文档编号C07K1/06GK101045742SQ200610012520
公开日2007年10月3日 申请日期2006年3月27日 优先权日2006年3月27日
发明者郝爱鱼, 董爱华, 黄晓兰, 梁倩, 张卫婷, 宋欣, 孔德清, 高文利, 赵军强, 暴娜, 周兴军, 王惠欣, 任乐民, 姜杨 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 华北制药金坦生物技术股份有限公司