专利名称：一种重组人粒细胞集落刺激因子的rp-hplc检测方法
技术领域：
本发明涉及蛋白分析领域，具体地说，涉及一种精确测定重组人粒细胞集落刺激 因子化学稳定性的RP-HPLC方法。
背景技术：
DNA重组技术的出现使得大量的重组蛋白质成功应用于治疗各种疾病，其中细胞 因子类就包括促红细胞生成素(EPO)、干扰素(IFN-α，IFN-β、IFN-γ )、粒细胞集落刺激 因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白细胞介素(IL)等。与小分子化学药 相比，重组药物蛋白质在较低浓度下就具有较高的活性和特异性。但是由于重组蛋白质本 身的物理及化学不稳定性，一般都采用注射给药的方式。为了确保一定的有效期，药用蛋白 质一般需要冷藏或者冷冻干燥以固体形式存放。蛋白质长期保藏中的不稳定性的主要原因是脱酰胺作用[Robinson NE. Protein deamidation[J], Proc Natl Acad Sci U S A. 2002,99(8) :5283_5288.]、氧化作 用[Stadtman, E R, Levine, R L Protein Oxidation[J].Ann. N. Y. Acad. Sci.,2000, 899 :191-208]禾口蛋白质聚集[Wang W. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics[J]. Int J Pharm. 2005，289 :1-30]。蛋白质氨基酸组成中的天冬酰胺 和谷氨酰胺都会发生脱酰胺作用，而且天冬酰胺比谷氨酰胺更容易发生脱酰胺作用。由于 rhG-CSF不含天冬酰胺(Asn)但含有17个谷氨酰胺，因此脱酰胺作用发生在谷氨酰胺上， 但是由于其制剂长期保存于PH4.0的微酸环境，脱酰胺作用相对不明显。据Stadtman，E R 报道，蛋白质组成中的组氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸残基容易被氧化，尤 其是甲硫氨酸和半胱氨酸更容易被氧化。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)只有一个游离的半胱氨酸(Cys17)，含有4 个甲硫氨酸残基，因此氧化主要发生在是Met上，四个甲硫氨酸被氧化的容易程度为=Met1 > Met138 > Met127 > Met122 [Reubsaet J L, Beijnen J H, Bult A. Oxidation of recombinant methionyl human granulocyte colony stimulating factor[J]. J Pharm Biomed Anal.， 1998，17 (2) =283-289]。各种环境条件，如曝光、储藏温度和活性氧对氧化作用影响较大，而 且制剂中吐温80等辅料中含有的微量过氧化氢也是甲硫氨酸氧化的原因之一。在重组蛋 白制剂生产过程中可能混入少量的过渡态金属离子也有可能导致蛋白质中氨基酸的氧化。 因此，有必要采用准确灵敏的分析方法来测定重组蛋白如重组人粒细胞集落刺激因子及其 注射液中在各种环境下稳定性情况。基于C4柱和C18柱的反相色谱法常用于检测重组人粒细胞集落刺激因子及其注 射液中有效成分纯度。已知重组人粒细胞集落刺激因子在稳定性试验中主要是甲硫氨酸 残基等发生氧化，已经知道有Met1，Met138, Met127, Met122都容易被氧化，因此有多种氧化形 式产生，但彼此间疏水性差异很小，由于C4柱的疏水性比C18柱弱，C4柱可能更适合用于 rhG-CSF 产品纯度测定。《欧洲药典》6. 3 版[European Pharmacopoeia 6. 3. Filgrastim concentrated solution[S]. 01/2009 :2206，EDQM]首先采用的 C18 柱，现行 6. 8 版[European Pharmacopoeia 6.8. Filgrastim concentrated solution[S]· 07/2010 :2206, EDQM]，反映出C4柱检测具有更高的灵敏度。但是《中国药典》2010版还是采用C18柱的方法。其他公开文献中关于稳定性试验采用的液相色谱法主要有分子筛HPLC[谢异泓， 钟英，黄建宏.中国医药工业杂志，2000，31 (03) :123-124;赵先亮，黄玉录，王春雨，等.齐 鲁药事，2007，26 (06) :342-344]、反相层析C4柱[谢异泓，钟英，黄建宏.中国医药工业杂 志，2000，31 (03) 123-124;钟英.中国现代应用药学，2000，17 (03) :220_222]，都不能灵敏 准确的检测其氧化产物。Dalmora SL[Dalmora SL, Massiero S, Oliveira P, et al. Journal of liquid chromatography & related technologies，2006，29 1753-1767]采用了反相色谱法研 究rhG-CSF分子结构与生物活性分析之间的关系，采用的反相柱为Jupiter C4柱，规格为 4. 6 X 250mm,流速为0. 5mL/min,但是柱温为25度，主峰保留时间为32min，并指出脱酰胺产 物在氧化峰与原型rhG-CSF之前出峰。这一结果不仅与《欧洲药典》6. 8版相矛盾(脱酰胺 作用产物在原型rhG-CSF的1. 1倍保留时间处出峰)，也与我们的实验结果相矛盾(采用 Vydac C4柱在主峰保留时间的1. 07处出峰)。
发明内容
本发明提供了一种重组人粒细胞集落刺激因子的RP-HPLC检测方法，该方法包括 以下步骤(1)将重组人粒细胞集落刺激因子上样于反相色谱柱，所述的重组人粒细胞集落 刺激因子的上样量不低于6 μ g，所述的反相色谱柱为碳载量小于4%的C4柱，选自Vydac 柱子、Jupiter柱子或Devosil柱子；(2)进行梯度洗脱，洗脱流动相的乙腈梯度为0-30min内从25%提高至8075%，其 中流动相A为含三氟乙酸的水溶液，三氟乙酸浓度为0. 05-0. 1% ；流动相B为含三氟乙酸 的乙腈水溶液，三氟乙酸浓度为0. 05-0. 1%，乙腈浓度为72-100%;检测波长为214nm或者 215nm，系统运行过程柱子温度为60士3度。上述方法中，参照药典要求，所述的重组人粒细胞集落刺激因子的上样量优选不 低于10 μ go上述方法中，C4反相色谱柱可从商业渠道购买，例如Vydac柱子来自Grace公司， Jupiter柱子来自phenomenex公司，Devosil柱子来自Nomura公司；其中反相色谱柱优选 Grace 公司的 Vydac214TP5415，规格为 4. 6mmX 150mm,粒径 5um,孔径为 300nm。上述方法中，优选流动相A为含0. 1 %三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0. 1 %三 氟乙酸的90%乙腈水溶液。上述方法中，乙腈梯度优选为0-30min内从36%提高至72%。上述方法中，系统运行过程中柱子温度优选为60士 1度(°C)，最优为60度(。C)。上述方法中，洗脱流速为0. 6-lml/min，较优流速为0. 8ml/min。上述方法中，色谱仪可根据实际情况选用，优选使用安捷伦公司或岛津公司制造的色谱仪。作为一种较为优选的测定重组人粒细胞集落刺激因子化学稳定性的RP-HPLC方法，该方法包括以下步骤(1)将重组人粒细胞集落刺激因子上样于反相色谱柱，样品上样量不低于IOyg; 所述的反相色谱柱为Vydac 214TP5415,规格4. 6mmX 150mm,粒径5um，孔径为300nm ；(2)进行梯度洗脱，洗脱流动相的乙腈梯度为0-30min内从36 %提高至72 %，其中 流动相A为含0. 三氟乙酸的水溶液，所述的流动相B为含0. 三氟乙酸的90%乙腈水 溶液；流速为0. 6-lml/min，检测波长为214nm，系统运行过程柱子温度为60士 1度。目前已经报道了多种分析测定重组人粒细胞集落刺激因子化学稳定性的方法，例 如钟英等[谢异泓，钟英，黄建宏.中国医药工业杂志，2000,31(03) :123-124;钟英.中国 现代应用药学，2000，17(03) =220-222]的方法(A)如下色谱柱为C4柱(4. 6mmX 150mm)， 填料粒度为5 μ m,孔径为300nm。流动相A 0. 1 %三氟醋酸(W/V)在注射用水中；流动相B
0.三氟醋酸(W/V)在乙腈水(9 1)混合液中；流速设定0. Sml/min，梯度为30分钟 流动相B由25%至80%，检测波长214nm，系统运行过程柱子温度为25度。本发明方法(B)的典型操作如下色谱仪为来自安捷伦公司的1100或1200，DAD 或者VWD检测 器。采用自动进样器，色谱柱为C4柱，来自Grace公司的Vydac 214TP5415， 规格4. 6mmX 150mm,粒径5um，孔径为300nm。柱温为60度，检测波长为214nm。流动相 A为含0. 1 % TFA的水溶液，流动相B为含0. 1 % TFA的90%乙腈水溶液。流速为0. 8mL/ min,梯度为0-30min从36 %到72 %乙腈梯度对应B相含量从40到80 %。上样量为不低于 10 μ g0欧洲药典6. 8版质量标准(C)如下色谱柱采用C4 ( 丁烷基)硅烷键合硅胶)为 填充剂，规格为4. 6mmX 250mm，粒径5um，孔径为300nm。流动相A 在IOOml的色谱级乙腈 中，加入899ml超纯水(R)混合均勻，再加入Iml三氟乙酸，混勻。流动相B 在199ml的超 纯水中，加入800ml色谱级乙腈，再加入Iml三氟乙酸，混勻。在60°C温度下进行梯度洗脱， 梯度0-35min 66 % B-73 % B, 35_50min 73 % B-90 % B, 50_60min 90 % B-66 % B0 上样 量不低于10 μ g，流速为0. 6mL/min,于波长215nm处检测。rhG_CSF保留时间大约在28分 钟，rhG-CSF氧化峰1 =约0. 85倍；rhG_CSF氧化峰2 =约0. 95倍；脱酰胺作用产物=约
1.1倍。氧化峰1和2的分离度大于1. 5。每个单杂的比例均不大于2. 0%，总杂质不大于 3. 5%。欧洲药典6. 3版质量标准(D)如下色谱柱采用C18 (十八烷基硅烷)键合硅胶为 填充剂，规格为4. 6mmX 150mm,粒径3um，孔径为200nm。流动相A 在499ml的色谱级乙腈 中，加入500ml超纯水(R)混合均勻，再加入Iml三氟乙酸，混勻。流动相B 在49ml的超 纯水中，加入950ml色谱级乙腈，再加入Iml三氟乙酸，混勻。在65°C温度下进行梯度洗脱， 梯度如下:0-4min 8% B，4_19min 8~28% B, 19-19. Imin 28-100% B, 19. l_21min 100% B,21-21. Imin 100-8% B,21. l_25min 8% B。上样量不低于 10 μ g,流速为 1. OmL/min, 于波长215nm处检测。rhG-CSF保留时间大约在12分钟，rhG-CSF氧化峰1 =约0. 90倍； rhG-CSF氧化峰2 =约0. 95倍。每个单杂的比例均不大于2. 0%，总杂质不大于3. 5%。中国药典2010版质量校准(E)如下色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 齐U;以A相(三氟乙酸-水溶液取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、B相(三氟 乙酸_乙腈溶液取1. Oml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混勻)为流动相，在室 温条件下，进行梯度洗脱(0 70%B相)。上样量不低于10yg，于波长214nm处检测，以G-CSF色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算，重组人G-CSF主峰面积 应不低于总面积的95.0%。以上5个方法采用欧洲药典标准品分别进行系统适应性试验，统计结果如表1所 示。典型图谱如
图1所示。表1.五种不同的分析方法结果汇总
权利要求
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子的RP-HPLC检测方法，该方法包括以下步骤(1)、将重组人粒细胞集落刺激因子上样于反相色谱柱，所述的重组人粒细胞集落刺激 因子的上样量不低于6 μ g，所述的反相色谱柱为碳载量小于4%的C4柱，选自Vydac柱子、 Jupiter柱子或Devosil柱子；(2)、进行梯度洗脱，洗脱流动相的乙腈梯度为0-30min内从25%提高至75%，其中流 动相A为含三氟乙酸的水溶液，三氟乙酸浓度为0. 05-0. 1 % ；流动相B为含三氟乙酸的乙腈 水溶液，三氟乙酸浓度为0. 05-0. 1 %，乙腈浓度为72-100 % ；检测波长为214nm或者215nm， 系统运行过程柱子温度为60士3度；
2.根据权利要求1所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤(1)中，重组 人粒细胞集落刺激因子的上样量不低于10 μ g。
3.根据权利要求1所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤(1)中的反相 色谱柱为 Vydac 214TP5415,规格为 4. 6mmX 150mm,粒径 5um，孔径为 300nm。
4.根据权利要求1所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤O)中，流动 相A为含0. 三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0. 三氟乙酸的90%乙腈水溶液。
5.根据权利要求1所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤O)中，乙腈 梯度为0-30min内从36%提高至72%。
6.根据权利要求1所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤O)中，系统 运行过程中柱子温度为60士 1度。
7.根据权利要求6所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤O)中，系统 运行过程中柱子温度为60度。
8.根据权利要求1所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤O)中，洗脱 流速为 0. 6-lml/min。
9.根据权利要求8所述的RP-HPLC检测方法，其特征在于，所述方法步骤O)中，洗脱 流速为 0. 8ml/min。
10.一种重组人粒细胞集落刺激因子的RP-HPLC检测方法，该方法包括以下步骤(1)、将重组人粒细胞集落刺激因子上样于反相色谱柱，所述的重组人粒细胞集落刺激 因子上样量不低于 ο μ g ；所述的反相色谱柱为Vydac 214TP5415，规格4. 6mmX 150mm,粒 径5um,孔径为300nm ；(2)进行梯度洗脱，洗脱流动相的乙腈梯度为0-30min内从36%提高至72%，其中流 动相A为含0. 三氟乙酸的水溶液，所述的流动相B为含0. 三氟乙酸的90%乙腈水溶 液；洗脱流速为0. 6-lml/min，检测波长为214nm，系统运行过程柱子温度为60士 1度。
全文摘要
本发明涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子的RP-HPLC检测方法。该方法采用Vydac C4柱，乙腈梯度洗脱，柱温为60±3度。本方法使用的C4柱与中国药典2010版使用的C18柱不同，但是检测灵敏度和准确度更高。而欧洲药典虽然采用C4柱，但是其所使用的乙腈梯度范围较小，分离时间较长，因此新方法比欧洲药典能够更快捷、更准确的测定重组人粒细胞集落刺激因子在不同存储条件下的稳定性。本发明对现有药典记载的重组人粒细胞集落刺激因子的检测分析方法进行了改进，使之更适用于rhG-CSF产品纯度检测，检测灵敏度和准确度更高。该方法对其他重组蛋白的稳定性试验方法的发展亦具有重要的参考意义。
文档编号G01N30/89GK102128907SQ20101052364
公开日2011年7月20日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者方井晋, 李辉, 沈玲, 郭旺明, 陈海红 申请人:杭州九源基因工程有限公司