长效凝固因子及产生其的方法

专利名称：长效凝固因子及产生其的方法
技术领域：
公开了包含附着至凝固因子C末端(羧基末端)的至少ー个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽及编码其的多核苷酸。还公开了包含本发明多肽和多核苷酸的药物组合物及其使用方法。发明背景 多肽在血液、肝或者肾中易于变性或者被酶降解。因此，多肽典型具有几小时的短循环半衰期。由于其低稳定性，肽药物通常以持续的频率(sustained frequency)递送，以維持活性肽的有效血浆浓度。此外，由于肽药物通常通过输注方式施用，频繁注射肽药物导致对象相当不舒适。因此，需要延长治疗性多肽半衰期且同时維持其高药学功效的技木。这种希望的肽药物在注射进人体时也应满足如下需要增强的血清稳定性、高活性及诱导不希望的免疫应答的低可能性。不利的药物动力学如短的血清半衰期可以阻止许多原本是有希望的药物候选物的药物开发。血清半衰期是分子的经验特征，并且对于每种新的潜在药物必须进行实验确定。例如，使用较低分子量的多肽药物，生理学清除机制如肾过滤可以使得难以维持药物的治疗水平，这是由于所需的给药方案的成本或者频率。相反，在药物或者其代谢物具有毒性副作用时，病不希望其具有较长的血清半衰期。发明概述在一个实施方案中，本发明提供了多肽，其由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的一至五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另ー个实施方案中，本发明还提供了多核苷酸分子，其包含编码由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的一至五个促性腺激素羧基末端肽组成的多肽的编码部分。在另ー个实施方案中，本发明还提供了延长凝固因子的生物学半衰期的方法，所述方法包括将一至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着于所述凝固因子的羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的生物学半衰期。在另ー个实施方案中，本发明还提供了改善凝固因子曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括将一至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着于所述凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的曲线下面积(AUC)。在另ー个实施方案中，本发明还提供了降低凝固因子给药频率的方法，包括将ー至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着于所述凝固因子羧基末端的步骤，由此降低凝固因子的给药频率。在另ー个实施方案中，本发明还提供了在凝固因子治疗的使用中提高顺应性的方法，包括向有需要的对象提供多肽，所述多肽包含凝固因子、附着于所述凝固因子羧基末端的一至五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此在凝固因子治疗的使用中提高顺应性。
附图简述图 I 是 rFVII-CTP 构建体(A) ,rFV 11-CTP-CTP 构建体(B)、rFIX_CTP 构建体(C)、和rFIX-CTP-CTP构建体(D)的图示。图2A是柱状图，其显示了在5μ g/ml维生素K3的存在下，由FVII-CTP变体限制稀释的克隆转染的和选择的细胞的收获物。FVII水平使用FVIIElisa(AssayPro)来量化。图2Β是柱状图，其显示了在5μ g维生素Κ3的存在下，由FVII-CTP变体限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。FVII活性使用FVII生色活性测定(AssayPro)来量化。图2C是柱状图，其显示了在5μ g维生素K3的存在下，由FVII-CTP变体限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。通过以活性值除以收获物FVII浓度计算。图2D的图，显示了由与正常集合(poll)的人血浆凝固活性相比的FVII、FVII-CTP和FVII-(CTP)2的凝固活性限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。图2E 的图，显示了 FVII、FVII-CTP-CTP 和 FVII-CTP 收获物的 PK 谱。图3A是柱状图，其显示了在5μ g/ml维生素K3的存在下，由FIX-CTP和FIX-CTP-CTP变体限制稀释转染的和选择的细胞的收获物。FIX水平使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals ；cat. No. FIX-AG RU。)量化,计算的蛋白质浓度(μ g/ml)是两个独立实验的平均值。图3B显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片A示出在Western-印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片B示出在Western-印迹中抗-Y羧化抗体的识别。A-B中的泳道I加载了含有重组FIX的样品。A-B中的泳道2加载了含有FIX-CTP收获物的样品。A-B中的泳道3加载了含有FIX- (CTP) 2收获物的样品。图4 的图显不了与;rhFIX (American Diagnostics)相比 FIX-CTP 和 FIX-(CTP) 2 收获物的对比生色活性(通过EC5tl.浓度测量)。图5 的图显不了与 rhFIX (American Diagnostics)凝固活性相比 FIX-CTP 和FIX-(CTP)收获物的凝固活性。图6的图显示了 rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物、和FIX-CTP收获物的PK谱。图7是柱状图，其分别显示了 FIX-CTP收获物和FIX-CTP-CTPM0D-3011及FIX-CTP-CTP_M0D-3012收获物以及M0D3012纯化的蛋白质FIX抗原水平，这是使用HumanFIX ELISA 试剂盒(Affinity Biologicals ；cat. No. FIX-AG RU。)确定的，计算的蛋白质浓度(μ g/ml)是两个独立实验的平均值。图8显示了 FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片A示出考马斯蓝染色；显微照片B示出在Western-印迹中的抗-FIX抗体的识别；显微照片C示出在Western-印迹中抗-Y羧化抗体的识别。A-C中泳道I加载了含有FIX-(CTP) 2 (M0D-3012)的样品。A-C中泳道2加载了含有未结合的FIX-(CTP)2的样品。A-C中泳道3加载了含有FIX- (CTP) 2 (M0D-3012)的浓缩洗脱液的样品。图9的图显不了与人正常集合血衆和 rhFIX (American Diagnostics)相比M0D3012的对比生色活性(样品浓度/0. D.)。

图10的图显示了与人正常集合血浆和rhFIX相比M0D3012的对比凝固活性。图11的图显示了纯化的M0D3012、rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物以及FIX-CTP的收获物的PK谱。
发明详述在一个实施方案中，本发明提供了长效凝固因子以及生产和使用其的方法。在另一个实施方案中，长效凝固因子包含羧基末端肽(CTP，也称作CTP単位)。在另ー个实施方案中，包含凝固因子的长效多肽还包含人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。在另ー个实施方案中，CTP作为对抗凝固 因子降解的保护剂。在另ー个实施方案中，CTP扩展了凝固因子的cmax。在另ー个实施方案中，CTP扩展了凝固因子的Tmax。在另ー个实施方案中，CTP扩展了凝固因子的循环半衰期。在一些实施方案中，CTP增强了凝固因子的效力。在另ー个实施方案中，本发明提供了延长凝固因子生物学半衰期的方法，所述方法包括将一至十个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的生物学半衰期。在另ー个实施方案中，本发明提供了延长凝固因子生物学半衰期的方法，包括将一至五个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，由此改善了凝固因子的生物学半衰期。在另ー个实施方案中，本发明提供了改善凝固因子曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括将一至十个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的曲线下面积(AUC)。在另ー个实施方案中，本发明提供了改善凝固因子曲线下面积(AUC)的方法，包括将一至五个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的曲线下面积(AUC)。在另ー个实施方案中，本发明的凝固因子是蛋白质。在另ー个实施方案中，本发明的凝固因子是肽。在另ー个实施方案中，本发明的凝固因子是多肽。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是丝氨酸蛋白酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是糖蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是转谷氨酰胺酶(transglutaminase)。在另ー个实施方案中,所述凝固因子是无活性的酶原。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是本领域技术人员已知的任何凝固因子。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FVIII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FV。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是因子XIII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是因子X。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是凝血酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是纤维蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FVIIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FVII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FIX。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FX。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FXIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FXII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是Fxa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是Fva。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是凝血酶原。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是凝血酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FV。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FXI。在另一个实施方案中，所述凝固因子是vWF。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FVIIIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是B-缺失的结构域FVIII (FVIIIBDD)。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FIXa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是前激肽释放酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是激肽释放酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FXIIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是纤维蛋白原。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是血栓调节蛋白(thrombomodulin)。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是FII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是糖蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是维生素K依赖性糖蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是维生素K非依赖性糖蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组蛋白质。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组糖蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组糖蛋白FV。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FVI。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FVII。在另一个实施方案中，所述凝固因子是重组FVIII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FIX。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FX。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FXI。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FXII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FvW。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FII。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FIXa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FXIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组纤维蛋白。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FVIIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组Fxa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组Fva。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组凝血酶原。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组凝血酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FVIIIa。在另一个实施方案中，所述凝固因子是重组前激肽释放酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组激肽释放酶。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是重组FXIIa。在另ー个实施方案中，所述凝固因子是任何已知的重组凝固因子。在另ー个实施方案中，包含信号肽的凝固因子是任何已知的重组凝固因子。在另ー个实施方案中，凝固因子包含附着于C末端的1-10个CTP重复而N末端无CTP附着。在另ー个实施方案中，包含信号肽的凝固因子是任何已知的重组凝固因子。在另ー个实施方案中，凝固因子包含附着于C末端的至少ー个CTP而无CTP附着于N末端。在另ー个实施方案中，包含附着于C末端的1-10个CTP而N末端无CTP附着的凝固因子是改造的凝固因子。在另ー个实施方案中，包含附着于C末端的至少ー个CTP而N末端无CTP附着的凝固因子是改造的凝固因子。在另ー个实施方案中，包含附着于C末端的1-10个CTP而N末端无CTP附着的凝固因子是缀合的凝固因子。在另ー个实施方案中，包含附着于C末端的至少ー个CTP而N末端无CTP附着的凝固因子是缀合的凝固因子。 在另ー个实施方案中，所述凝固因子包含与FIX、FVII、因子X、蛋白质C和凝血酶原的结构域组织相似或相同的结构域组织。在另ー个实施方案中，所述凝固因子被合成为具有N末端前肽(prop印tide)的前体。在另ー个实施方案中，本文所用凝固因子是无活性的酶原形式。在另ー个实施方案中，所述凝固因子在肝细胞中产生。在另ー个实施方案中，所述凝固因子包含Y羧化酶的停靠位点(docking site)，所述Y羧化酶将谷氨酸(Glu)转变为Y羧基谷氨酸(Gla)。在另ー个实施方案中，本文所用凝固因子是可商购的凝固因子。在另ー个实施方案中，因子VII的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLT
GIVSWGQG CATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP(SEQ ID NO :9)在另ー个实施方案中，因子VII的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR(SEQID NO :10).在另ー个实施方案中，编码因子VII的核酸序列包含如下核酸序列CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACGGGCATCGTCAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCAACCGTGGGCCACTTTGGGGTGTACACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCACGCCCAGGAGTCCTCCTGCGAGCCCCATTTCCCTGAGGATGCGGCCGC(SEQ IDNO : 11)·在另ー个实施方案中，编码因子VII-CTP(附着于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCAGCGACACCCCCATCCTGCCCCAGTGAGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO :12).在另ー个实施方案中，因子VII-CTP (附着于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO 13).在另ー个实施方案中，编码因子VII-CTP-CTP(附着于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCAGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO : 14) ·在另ー个实施方案中，因子VII-CTP-CTP (附着于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSD⑶QCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHD⑶EQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPR LMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSL
PSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO :15).在另ー个实施方案中，编码因子IX的核酸序列包含如下核酸序列GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATC
ACCATTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTCCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTGAACGCGGCCGC(SEQ ID NO :16).在另ー个实施方案中，因子IX的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVD⑶QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT*(SEQ ID NO :17).在另ー个实施方案中，编码因子IX_CTP(附着于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列GCGATCGCCA TGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATT
GGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAAC
CAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACT
GAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO :18).在另ー个实施方案中，因子IX-CTP(附着于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVD⑶QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAATNKYNHDLALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEK
TKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO :19).在另ー个实施方案中，编码因子IX-CTP-CTP(附着于羧基末端)的核酸序列包含如下核酸序列GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCA A AGAGGTATAATTCAGGTAAATT
GGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAG
TTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGG
AGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO :20).在另ー个实施方案中，因子IX-CTP-CTP(附着于羧基末端)的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVD⑶QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVV
GGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**
(SEQ ID NO :21).在另ー个实施方案中，将弗林蛋白酶(furin)加入到表达本发明凝固因子-CTP的细胞中。在另ー个实施方案中，弗林蛋白酶提高细胞中本发明凝固因子-CTP的生产效率。在另ー个实施方案中，将弗林蛋白酶与包含本发明凝固因子-CTP的编码序列的载体共转染。在另ー个实施方案中，弗林蛋白酶由单独载体编码。在另ー个实施方案中，弗林蛋白酶和凝固因子-CTP由一个载体编码。在另ー个实施方案中，弗林蛋白酶的编码序列被插入PCI-DHFR中。在另ー个实施方案中，弗林蛋白酶的编码序列被改造至pCI-dhfr/smal+Notl、Furin/AsisI F. I. +NotI 中。在另ー个实施方案中，编码弗林蛋白酶的核酸序列包含如下核酸序列tctagagtcgacccCGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGCTATGGGTGGTAGCAGCAACA
GGAACCTTGGTCCTGCTAGCAGCTGATGCTCAGGGCCAGAAGGTCTTCACCAACACGTGGGCTGTGCGCATCCCTGGAGGCCCAGCGGTGGCCAACAGTGTGGCACGGAAGCATGGGTTCCTCAACCTGGGCCAGATCTTCGGGGACTATTACCACTTCTGGCATCGAGGAGTGACGAAGCGGTCCCTGTCGCCTCACCGCCCGCGGCACAGCCGGCTGCAGAGGGAGCCTCAAGTACAGTGGCTGGAACAGCAGGTGGCAAAGCGACGGACTAAACGGGACGTGTACCAGGAGCCCACAGACCCCAAGTTTCCTCAGCAGTGGTACCTGTCTGGTGTCACTCAGCGGGACCTGAATGTGAAGGCGGCCTGGGCGCAGGGCTACACAGGGCACGGCATTGTGGTCTCCATTCTGGACGATGGCATCGAGAAGAACCACCCGGACTTGGCAGGCAATTATGATCCTGGGGCCAGTTTTGATGTCAATGACCAGGACCCTGACCCCCAGCCTCGGTACACACAGATGAATGACAACAGGCACGGCACACGGTGTGCGGGGGAAGTGGCTGCGGTGGCCAACAACGGTGTCTGTGGTGTAGGTGTGGCCTACAACGCCCGCATTGGAGGGGTGCGCATGCTGGATGGCGAGGTGACAGATGCAGTGGAGGCACGCTCGCTGGGCCTGAACCCCAACCACATCCACATCTACAGTGCCAGCTGGGGCCCCGAGGATGACGGCAAGACAGTGGATGGGCCAGCCCGCCTCGCCGAGGAGGCCTTCTTCCGTGGGGTTAGCCAGGGCCGAGGGGGGCTGGGCTCCATCTTTGTCTGGGCCTCGGGGAACGGGGGCCGGGAACATGACAGCTGCAACTGCGACGGCTACACCAACAGTATCTACACGCTGTCCATCAGCAGCGCCACGCAGTTTGGCAACGTGCCGTGGTACAGCGAGGCCTGCTCGTCCACACTGGCCACGACCTACAGCAGTGGCAACCAGAATGAGAAGCAGATCGTGACGACTGACTTGCGGCAGAAGTGCACGGAGTCTCACACGGGCACCTCAGCCTCTGCCCCCTTAGCAGCCG
GCATCATTGCTCTCACCCTGGAGGCCAATAAGAACCTCACATGGCGGGACATGCAACACCTGGTGGTACAGACCTCGAAGCCAGCCCACCTCAATGCCAACGACTGGGCCACCAATGGTGTGGGCCGGAAAGTGAGCCACTCATATGGCTACGGGCTTTTGGACGCAGGCGCCATGGTGGCCCTGGCCCAGAATTGGACCACAGTGGCCCCCCAGC
GGAAGTGCATCATCGACATCCTCACCGAGCCCAAAGACATCGGGAAACGGCTCGAGGTGCGGAAGACCGTGACCGCGTGCCTGGGCGAGCCCAACCACATCACTCGGCTGGAGCACGCTCAGGCGCGGCTCACCCTGTCCTATAATCGCCGTGGCGACCTGGC
CATCCACCTGGTCAGCCCCATGGGCACCCGCTCCACCCTGCTGGCAGCCAGGCCACATGACTACTCCGCAGATGGGTTTAATGACTGGGCCTTCATGACAACTCATTCCTGGGATGAGGATCCCTCTGGCGAGTGGGTCCTAGAGATTGAAAACACCAGCGAAG
CCAACAACTATGGGACGCTGACCAAGTTCACCCTCGTACTCTATGGCACCGCCCCTGAGGGGCTGCCCGTACCTCCAGAAAGCAGTGGCTGCAAGACCCTCACGTCCAGTCAGGCCTGTGTGGTGTGCGAGGAAGGCTTCTCCCTGCACCAGAAGAGCTGTGTCCAGCACTGCCCTCCAGGCTTCGCCCCCCAAGTCCTCGATACGCACTATAGCACCGAGAATGACGTGGAGACCATCCGGGCCAGCGTCTGCGCCCCCTGCCACGCCTCATGTGCCACATGCCAGGGGCCGGCCCTGACAGACTGCCTCAGCTGCCCCAGCCACGCCTCCTTGGACCCTGTGGAGCAGACTTGCTCCCGGCAAAGCCAGAGCAGCCGAGAGTCCCCGCCACAGCAGCAGCCACCTCGGCTGCCCCCGGAGGTGGAGGCGGGGCAACGGCTGCGGGCAGGGCTGCTGCCCTCACACCTGCCTGAGGTGGTGGCCGGCCTCAGCTGCGCCTTCATCGTGCTGGTCTTCGTCACTGTCTTCCTGGTCCTGCAGCTG
CGCTCTGGCTTTAGTTTTCGGGGGGTGAAGGTGTACACCATGGACCGTGGCCTCATCTCCTACAAGGGGCTGCCCCCTGAAGCCTGGCAGGAGGAGTGCCCGTCTGACTCAGAAGAGGACGAGGGCCGGGGCGAGAGGACCGCCTTTATCAAAGACCAGAGCGCCCTCTGAACGCGGCCGC(SEQID NO :22).在另ー个实施方案中，弗林蛋白酶的氨基酸序列包含如下氨基酸序列MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL* (SEQ ID NO : 23).在一些实施方案中，术语凝固因子还包括具有凝固活性的已知凝固因子的同源物。在一些实施方案中，本发明的同源性还涵盖缺失、插入或者取代变体，包括其氨基酸取代，及其生物活性多肽片段。
在另ー个实施方案中，本发明包括具有凝固活性的凝固因子同源物。在另ー个实施方案中，本发明包括本文所述的具有凝固活性的凝固因子同源物。在另ー个实施方案中，同源物例如是使用国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件以默认參数确定的与凝固因子具有至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少87 %、至少89 %、至少91%、至少93 %、至少95 %或者99 %以上同源性的多肽。在另ー个实施方案中，本发明包括弗林蛋白酶的同源物。在另ー个实施方案中，同源物例如是使用国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件以默认參数确定的与弗林蛋白酶具有至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少87 %、至少89 %、至少91%、至少93 %、至少95 %或者99 %以上同源性的多肽。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的1-10个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的2-8个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，其包含凝固因子及附着 于所述凝固因子的羧基末端的1-3个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的1-5个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的1-5个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的1-5个CTP。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含在凝固因子的氨基末端无CTP的凝固因子。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含在凝固因子的羧基末端具有至少ー个CTP的凝固因子。在另ー个实施方案中，本发明提供了多肽，所述多肽包含在凝固因子的羧基末端具有至少ー个CTP而在氨基末端无CTP的凝固因子。在其它实施方案中，改造的凝固因子是这样的多肽，其包含在羧基末端具有至少ー个CTP的凝固因子。在其它实施方案中，改造的凝固因子是这样的多肽，其包含在羧基末端具有ー个CTP的凝固因子。在其它实施方案中，改造的凝固因子是这样的多肽，其由在羧基末端具有ー个CTP的凝固因子組成。在其它实施方案中，改造的凝固因子包含两个以串联形式附着于羧基末端的CTP肽。在另ー个实施方案中，本文所述的改造的凝固因子与非CTP修饰的凝固因子在生物活性方面是等价的。在另ー个实施方案中，本文所述的改造的凝固因子与非CTP修饰的凝固因子在药学测量如药物动力学和/或药效学方面至少是等价的。在其它实施方案中，改造的凝固因子要用于治疗B型血友病患者。在另ー个实施方案中，在羧基末端包含串联的2个CTP的凝固因子IX(M0D-3012)要用于治疗B型血友病患者。在另ー个实施方案中，在羧基末端包含I个CTP重复的凝固因子IX(M0D-3011)要用于治疗B型血友病患者。在其它实施方案中，改造的凝固因子可以降低输注速度、降低所需剂量或者其组合。在另ー个实施方案中，在羧基末端包含串联的2个CTP的凝固因子IX(M0D_3012)与FIX-CTP收获物或者rhFIX相比呈现出改善的PK谱(profile)，同时保留其凝固活性。在另ー个实施方案中，在羧基末端包含串联的2个CTP的凝固因子IX(M0D-3012)与rhFIX相比呈现出半衰期提高3倍及AUC提高4. 5倍。在另ー个实施方案中，术语“CTP肽”、“羧基末端肽”和“CTP序列”在本文可互換使用。在另ー个实施方案中，所述羧基末端肽是全长CTP。在另ー个实施方案中，所述羧基末端肽是截短的CTP。每种可能性均代表本发明单独 的实施方案。在其它实施方案中，术语改造的凝固因子包含成熟凝固因子的氨基酸序列。在其它实施方案中，术语改造的凝固因子包含凝固因子的氨基酸序列，包括其信号序列或者信号肽。在另ー个实施方案中，“信号序列”和“信号肽”在本文可互換使用。在另ー个实施方案中，“序列”当用于多核苷酸分子时可以是指编码部分。每种可能性均代表本发明单独的实施方案。在另ー个实施方案中，如本文所述包含至少ー个CTP的改造的凝固因子与不具有至少ー个CTP的凝固因子相比具有增强的体内生物学活性。在一些实施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー个CTP序列提供了针对凝固因子降解的增强的保护作用。在一些实施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー个CTP序列提供了对抗清除的增强的保护作用。在一些实施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー个CTP提供了延长的清除时间。在一些实施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー个CTP序列増加其cmax。在一些实施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー个CTP提供了提高的保护作用对抗提高其!1-。在一些实施方案中，在凝固因子羧基末端的至少ー个CTP序列延长其T1/2。在另ー个实施方案中，本发明的缀合的凝固因子以与未修饰的缀合凝固因子相同的方式应用。在另ー个实施方案中，本发明的缀合的凝固因子具有延长的循环半衰期和血浆保留时间、降低的清除率以及提高的体内临床活性。在另ー个实施方案中，由于本文所述缀合的凝固因子的改善的性质，此缀合物与未修饰形式的相同凝固因子相比以较低的频率施用。在另ー个实施方案中，降低的施用频率使得患者顺应性改善，导致了治疗结果的改善以及患者生存质量的改善。在另ー个实施方案中，与常规凝固因子缀合物相比，发现具有本发明缀合物的分子量和接头序列的缀合物具有改善的效力、改善的稳定性、提高的AUC水平以及延长的循环半衰期。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含本文所述的缀合凝固因子的组合物。在另ー个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的缀合凝固因子。在另ー个实施方案中，缀合的凝固因子的治疗有效量根据治疗的病症的精确类型、治疗的患者的状况以及该组合物中的其它成分等因素确定。在另ー个实施方案中，缀合的凝固因子的治疗有效量在50-500IU每kg体重之间，一天一次至一周一次施用。在另ー个实施方案中，缀合的凝固因子的治疗有效量为150-250IU/kg体重，一天一次施用。在另ー个实施方案中，包含缀合的凝固因子的药物组合物以强效配制用以通过各种方式向人类患者施用。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗患有血友病的对象。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于预防性治疗血友病，因此降低出血及相关并发症的风险。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗患有血友病的对象，同时降低产生针对外源施用的凝固因子的抑制性抗体的风险。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗患有血友病的对象，因此诱导内稳态(homeostasis)。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗经历过量出血或者瘀伤(bruising)或者具有的凝血酶原时间(PT)或者部分促凝血酶原激酶时间(PartialThromboplastin Time7PTT)的对象。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗具有导致出血的获得性病症如维生素K缺乏症或者肝脏疾病的对象。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗凝固因子缺乏的对象，所述凝固因子缺乏是获得性的(由于其它疾病所致)或者遗传性的、轻度或者严重的、长期或者暂时的。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗患有A型血友病的对 象。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗患有B型血友病的对象。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗具有获得性缺陷的对象，所述获得性缺陷是由于慢性疾病如肝病或者癌症所致；由于急性病症如弥散性血管内凝血(DIC)所致，其迅速用光凝血因子；或者由于维生素K缺乏或者使用维生素K拮抗剂如华法林(warfarin)(因子II、VII、IX和X的产生需要维生素K)进行治疗所致。在另ー个实施方案中，如本文所述的缀合的凝固因子可用于治疗患有导致凝血失衡的疾病的对象，例如但不限于肝病、尿毒症、癌症、骨髄病、暴露于蛇毒、维生素K缺乏、抗凝治疗、抗凝剂华法林的意外摄取、多次输血(贮存的血单位丧失ー些凝血因子)。在另ー个实施方案中，本文所用对象是人。在另ー个实施方案中，对象是宠物(pet)。在另ー个实施方案中，对象是哺乳动物。在另ー个实施方案中，对象是农畜动物。在另ー个实施方案中，对象是猴子。在另ー个实施方案中，对象是马。在另ー个实施方案中，对象是牛。在另ー个实施方案中，对象是小鼠。在另ー个实施方案中，对象是大鼠。在另ー个实施方案中，如本文所述[(CTP)n>1_凝固因子]包含全长凝固因子或者其活性片段，在其羧基末端通过肽键连接至少ー个CTP単位，在其氨基末端无CTP。在另ー个实施方案中，如本文所述[(CTP)n>1-凝固因子]包含凝固因子或者其活性片段，其通过肽键结合至少ー个CTP单位，在其氨基末端无CTP，所述CTP单位通过肽键与另ー CTP单位连接。在另ー个实施方案中，ー种核酸分子编码改造的凝固因子，所述凝固因子包含在其C末端附着的至少ー个CTP而在其氨基末端无CTP。在另ー个实施方案中，所述CTP通过接头附着至凝固因子。在另ー个实施方案中，连接CTP序列与凝固因子的接头是共价键。在另ー个实施方案中，连接CTP序列与凝固因子的接头是肽键。在另ー个实施方案中，连接CTP序列与凝固因子的接头是取代的肽键。在另ー个实施方案中，所述CTP序列包含选自SEQ ID NO :I和SEQ ID NO 2中所列的氨基酸序列。在另ー个实施方案中，SEQ ID NO :I包含如下氨基酸(AA)序列DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO :1)。在另ー个实施方案中，SEQ ID NO :2包含如下氨基酸(AA)序列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO :2)。在另ー个实施方案中，本发明的羧基末端肽(CTP)包含人绒毛膜促性腺激素的第112至145位的氨基酸序列，如SEQ ID N0:1所示。在另ー个实施方案中，本发明的CTP序列包含人绒毛膜促性腺激素的第118至145位氨基酸序列，如SEQ ID N0:2所示。在另ー个实施方案中，所述CTP序列也从在人绒毛膜促性腺激素第112-118位之间任何位置开始并在第145位结束。在一些实施方案中，所述CTP序列肽的长度为28、29、30、31、32、33或者34个氨基酸，并从CTP氨基酸序列的第112、113、114、115、116、117或者118位开始。在另ー 个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相比因1-5个保守氨基酸取代而不同，如并入本文作參考的美国专利No. 5，712，122所述。在另ー个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相比因I个保守氨基酸取代而不同。在另ー个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相比因2个保守氨基酸取代而不同。在另ー个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相比因3个保守氨基酸取代而不同。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相比因4个保守氨基酸取代而不同。在另ー个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相比因5个保守氨基酸取代而不同。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少70%同源性。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少80%同源性。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少90%同源性。另ー个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或者其肽具有至少95%同源性。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少70%同源性。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少80%同源性。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少90%同源性。在另ー个实施方案中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人CTP DNA序列或者其肽具有至少95%同源性。在一个实施方案中，至少ー个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另一个实施方案中，两个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是截短的。在另ー个实施方案中，有2个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另ー个实施方案中，有2或多个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是截短的。在另ー个实施方案中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是截短的。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :3的前10个氨基酸。在另ー个实施方案中，SEQ ID NO :3包含如下氨基酸(AA)序列SSSSKAPPPSLP。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前10个氨基酸。在另ー个实施方案中，SEQ ID NO :4包含如下氨基酸(AA)序列SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO 4的前11个氨基酸。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前12个氨基酸。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :3的前8个氨基酸。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前13个氨基酸。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO :4的前14个氨基酸。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO 4或者SEQ ID NO 3的前6个氨基酸。在一个实施方案中，截短的CTP包含SEQ ID NO 4或者SEQ ID NO 3的前5个氨基酸。在一个实施方案中，至少ー个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另ー个实施方案中，两个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是糖基化的。在另ー个实施方案中，有2个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另ー个实施方案中，有2或多个绒毛膜 促性腺激素CTP氨基酸序列是糖基化的。在另ー个实施方案中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是糖基化的。在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含至少ー个糖基化位点。在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含2个糖基化位点。在ー个实施方案中，本发明的CTP序列包含3个糖基化位点。在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含4个糖基化位点。在一些实施方案中，所述CTP序列修饰在允许以较低剂量使用方面是有利的。在一些实施方案中，所述CTP序列修饰在允许以较少给药方面是有利的。在一些实施方案中，所述CTP序列修饰在允许安全长效作用方面是有利的。在一些实施方案中，如本文所用“多肽”、“改造的凝固因子(engineereedcoagulation factor) ”或者“蛋白质”涵盖了天然多肽(降解产物、合成的多肽或者重组多肽)和肽模拟物(典型为合成的多肽)、以及是多肽类似物的类肽(peptoid)和半类肽(semipeptoid)，其在一些实施方案中具有修饰使得所述含凝固因子的多肽在体内更稳定或者更加能够进入细胞。在一些实施方案中，修饰包括但不限于C末端修饰，多肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = O、O = C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C-NH、CH = CH 或者 CF = CH,主链修饰，以及残基修饰。制备肽模拟化合物的方法为本领域熟知，例如在QuantitativeDrug Design,C. A. Ramsden Gd. , Chapter 17.2,F. Choplin Pergamon Press (1992)中有具体描述，所述文献以其全部内容并入本文作參考。关于这方面的进ー步详述在后文提供。在一些实施方案中，多肽内的多肽键(-C0-NH-)被取代。在一些实施方案中，所述多肽键由N-甲基化键(-N(CH3)-C0_)取代。在一些实施方案中，所述多肽键由酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在一些实施方案中，所述多肽键由酮甲基键(ketomethylen bond)(-C0-CH2-)取代。在一些实施方案中，所述多肽键由α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如甲基，carba键(-CH2-NH-)。在一些实施方案中，所述多肽键由羟基こ烯键(-CH(OH)-CH2-)取代。在一些实施方案中，所述多肽键由硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在一些实施方案中，所述多肽键由烯烃(olefinic)双键(-CH = CH-)取代。在ー些实施方案中，所述多肽键由反酰胺(retix) amide)键(-NH-C0-)取代。在一些实施方案中，所述多肽键由多肽衍生物(_N(R)-CH2-C0-)取代，其中R是“正常的”侧链，天然存在于碳原子上。在一些实施方案中，这些修饰发生在沿多肽链的任何键，甚至同时在几个键(2-3个键)发生。在一些实施方案中，所述多肽的天然芳族氨基酸如Trp、Tyr和Phe由合成的非天然氨基酸取代，所述合成的非天然氨基酸如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或者ο-甲基-Tyr。在一些实施方案中，本发明的多肽包括一或多个修饰的氨基酸或者一或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合的碳水化合物等)。在一个实施方案中，“氨基酸”或者“氨基酸序列”应被理解为包括20种天然发生的氨基酸；通常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨；以及其它非寻常氨基酸包括但不限于2-氨基脂肪酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素(isodesmosine)、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，“氨基酸”既包括D-氨基酸也包括L-氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的多肽用于治疗中，其要求所述多肽包含溶解形式的凝固因子。在一些实施方案中，本发明的多肽包括一或多个非天然或者天然的极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，由于其包含羟基的侧链而能増加所述多肽的溶解性。在一些实施方案中，本发明的改造的凝固因子以线性形式使用，但是本领域技术人员意识到在环化不明显干扰改造的凝固因子特性的情况中也可以使用环状形式的改造凝固因子。
在一些实施方案中，本发明的改造的凝固因子是经生物化学方式合成的，例如通过使用标准固相技术合成。在一些实施方案中，这些生物化学方法包括全(exclusive)固相合成法、部分固相合成法、片段缩合法，或者传统的溶液合成法。在一些实施方案中，重组蛋白质技术用于产生本发明的改造的凝固因子。在ー些实施方案中，重组蛋白质技术用于产生相对较长的多肽(例如长于18-25个氨基酸)。在一些实施方案中，重组蛋白质技术用于产生大量的本发明的改造的凝固因子。在一些实施方案中，重组技术由 Bitter et al. , (1987)Methods in Enzymol. 153 516-544> Studier etal. (1990)Methods in Enzymol. 185 :60-89、Brisson et al. (1984)Nature 310 :511_514、Takamatsu et al. (1987)EMBO J. 6 :307_311、Coruzzi et al. (1984)EMBO J. 3 :1671-1680及Brogli et al.，(1984)Science 224 :838-843,Gurley et al. (1986)Mol. Cell. Biol. 6 :559-565 以及 Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 描述。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含编码多肽的编码部分的多核苷酸分子，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的ι- ο个促性腺激素羧基末端肽。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含编码多肽的编码部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的1-10个促性腺激素羧基末端肽组成。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含编码多肽的编码部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的1-7个促性腺激素羧基末端肽组成。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含编码多肽的编码部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的2-8个促性腺激素羧基末端肽组成。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含编码多肽的编码部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的1-5个促性腺激素羧基末端肽组成。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述多核苷酸分子的表达载体。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述表达载体的细胞。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述表达载体的组合物。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述细胞的组合物。在另ー个实施方案中，所述细胞是真核细胞。在另ー个实施方案中，所述细胞是原核细胞。在另ー个实施方案中，本发明的改造的凝固因子是使用编码本发明多肽的多核苷酸分子合成的。在一些实施方案中，编码本发明改造的凝固因子的多核苷酸分子被连接进表达载体中，所述载体包含顺式调节序列的转录控制(例如启动子序列)。在一些实施方案中，所述顺式调节序列适于指导本发明改造的凝固因子的组成型表达。在一些实施方案中，所述顺式调节序列适于指导本发明改造的凝固因子的组织特异性表达。在一些实施方案中，所述顺式调节序列适于指导本发明改造的凝固因子的可诱导表达。
在一些实施方案中，适用于本发明的组织特异性启动子包括在特定细胞群中起作用的序列，例如包括但不限于如肝特异性的白蛋白的启动子[Pinkert et al. , (1987)Genes Dev. I :268-277]、淋巴特异性启动子[Calame et al. , (1988) Adv. Immunol. 43 235-275];特别是 T 细胞受体的启动子[ffinoto et al.，(1989)EMBO J. 8 =729-733]及免疫球蛋白的启动子[Banerji et al. (1983) Cell33729_740]，神经元特异性启动子如神经丝启动子[Byrne et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :5473-5477]，胰腺特异性启云カ子[Edlunch et al. (1985) Science 230 :912-916]或者乳腺特异性启动子如乳清蛋白启动子(美国专利 No. 4，873，316 和 European Application Publication No. 264，166)。适用于本发明的可诱导启动子包括例如四环素可诱导启动子(Srour, M. A. , et al. ,2003.Thromb. Haemost. 90 :398-405)。 在一个实施方案中，短语“多核苷酸分子”是指单链或者双链核酸序列，其是分离的或者以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或组合的多核苷酸序列(例如上述形式的组合)形式提供。在一个实施方案中，“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或者任何其它RNA依赖性DNA聚合酶得自信使RNA的逆转录的序列。在一个实施方案中，上述序列随后可以在体内或者体外使用DNA聚合酶扩增。在一个实施方案中，“基因组多核苷酸序列”是指衍生自染色体及因此表示染色体ー连续部分的序列。在一个实施方案中，“组合的(composite)多核苷酸序列”是指这样的序列，其至少是部分互补的及至少部分基因组的。在一个实施方案中，组合的序列可包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及插入之间的ー些内含子序列。在一个实施方案中，所述内含子序列可以是任何来源的，包括源于其它基因，典型包括保守剪接的信号序列。在一个实施方案中，内含子序列包括顺式作用表达调节元件。在一个实施方案中，在表达和分泌之后，信号肽被从前体改造凝固因子中切除，获得成熟的改造凝固因子。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸是使用PCR技术或者本领域技术人员已知的任何其它方法或程序制备的。在一些实施方案中，所述程序包括连接两个不同的DNA序列(见例如“ Current Protocols in MolecularBiologyeds. Ausubel et al. ,John Wiley& Sons,1992)。在一个实施方案中，编码所述改造的凝固因子的本发明的多核苷酸被插入表达载体(即核酸构建体)中，以使得重组多肽表达。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括额外的序列，该序列使得这个载体适于在原核生物中复制和整合。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括额外的序列，该序列使得这个载体适于在真核生物中复制和整合。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括穿梭载体，其使得这个载体在原核生物和真核生物中均适于复制和整合。在一些实施方案中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)及转录和翻译终止子(例如聚腺苷酸化信号)。在一个实施方案中，许多原核细胞或者真核细胞均可用作宿主表达系统，以表达本发明的凝固因子。在一些实施方案中，这些宿主表达系统包括但不限于微生物，如用含有所述多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或者粘粒DNA表达载体转化的细菌，用含有所述多肽编码序列的重组酵母表达系统转化的酵母，用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)感染的或者用含有所述多肽编码序列的重组质粒表达载体如Ti质粒转化的植物细胞系统。在一些实施方案中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统如CHO细胞)，以表达本发明凝固因子。在一个实施方案中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明多核苷酸的表达载体是pCI-DHFR载体，其包含CMV启动子和新霉素抗性基因。pCI-dhfr载体的构建根据实施例I所述实施方案进行。在一些实施方案中，在本发明的细菌系统中，根据希望表达的多肽的用途而可以有利地选择许多表达载体。在一个实施方案中，需要大量的多肽。在一个实施方案中，需要指导蛋白质产物高水平表达的载体，可以是作为与疏水性信号序列的融合体，其指导表达产物进入细菌或者培养基的外周，在此蛋白质产物易于被纯化。在一个实施方案中，用特异性裂解位点改造的某融合蛋白有助于所述多肽的回收。在一个实施方案中，适合这种操作的载体包括但不限于pET系列大肠杆菌表达载体[Studier et al. , Methods inEnzymol. 185 :60-89(1990)]。在一个实施方案中，使用酵母表达系统。在一个实施方案中，含有组成型或者可诱导启动子的许多载体可用于酵母中，如美国专利申请No :5，932，447所掲示的。在另ー个实施方案中，使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体中的载体。在一个实施方案中，本发明的表达载体可进ー步包括额外的多核苷酸序列，如内部核糖体进入位点(IRES)及用于启动子嵌合多肽的基因组整合的序列，其使得例如从单个mRNA中翻译ー些蛋白质。在一些实施方案中，哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA3、pcDNA3. I (+/-)、pGL3、pZeoSV2 (+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3. I、pSinR印5、DH26S、DHBB, pNMTl、pNMT41、pNMT81,这些载体可得自 Invitrogen ;及 pCI，其可得自 Promega ;pMbac、pPbac、pBK-RSV 和 pBK-CMV,其可得自 Strategene ；以及 pTRES,其可得自Clontech ;以及这些载体的衍生物。在一些实施方案中，本发明使用含有来自真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方案中，衍生自牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-lMTHA，衍生自Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p205。其它举例的载体包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及使得蛋白质在启动子指导下表达的任何其它载体，所述启动子是SV-40早期启动子、SV-40晩期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子,或者示出在真核细胞中有效表达的其它启动子。在一些实施方案中，重组病毒载体可用于在体内表达本发明的凝固因子，因为其呈现出如横向(lateral)感染和祀向特异性等优势。在一个实施方案中，横向感染是如逆转录病毒生命周期中固有的，是单个感染的细胞产生许多后代病毒颗粒及其出芽及感染相邻细胞的过程。在一个实施方案中，结果是大面积被迅速感染，其中大部分最初不是被原始病毒颗粒感染的。在一个实施方案中，产生不能横向传播的病毒载体。在一个实施方案中， 如果希望的目的是将指定基因导入仅局限数目的靶细胞，则可以使用这个特性。在一个实施方案中，可以使用不同方法将本发明表达载体导入细胞中。这种方法通Vf在 Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringsHarbor Laboratory, New York(1989,1992)、Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley and Sons,Baltimore,Md. (1989)、Chang et al. , SomaticGene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al. , Gene Targeting, CRCPress,Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses,Butterworths,Boston Mass. (1988)及Gilboa et at. [Biotechniques 4(6)504-512,1986]中描述，包括例如稳定或者瞬时转染、脂染、电穿孔以及用重组病毒载体感染。此外，见美国专利No. 5，464，764和5，487，992所述关于阳性_阴性选择方法。在一些实施方案中，通过病毒感染导入核酸呈现出优于其它方法如脂染和电穿孔方法的优势，优于病毒的感染性质可以获得较高的转染效率。在一个实施方案中，意识到本发明的改造凝固因子也可以从核酸构建体中表达， 所述核酸构建体通过使用任何合适的施用模式来提供给个体，如上文所述(即体内基因治疗方法)。在一个实施方案中，所述核酸构建体通过适当的基因输送载体/方法(转染、转导、同源重组等)并且在需要时的表达系统被导入合适细胞中，然后使修饰的细胞培养扩增并重新输送至所述个体中(即离体基因治疗方法)。在一个实施方案中，使用植物表达载体。在一个实施方案中，多肽编码序列的表达通过许多启动子驱动。在一些实施方案中，使用病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA 启动子[Brisson et al. , Nature 310 :511-514 (1984)]，或者使用 TMV 的外壳蛋白启动子[Takamatsu et al.，EMBO J. 6 :307-311 (1987)]。在另ー个实施方案中，使用植物启动子，如 RUBISC0 的小亚基[Coruzzi et al.，EMBO J. 3 :1671-1680 (1984);Brogli et al.，Science224 :838-843 (1984)]，或者热休克启动子，例如大豆 hspl7. 5-E或 hspl7. 3-B[Gurley et al.，Mol. Cell. Biol. 6 :559-565 (1986)]。在一个实施方案中，使用如下方式方法将构建体导入植物细胞中，如使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔及本领域技术人员熟知的其它技术。见例如Weissbach &WeissDach[Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY,Section VIII,PP 421-463(1988)]。本领域熟知的其它表达系统如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统也可以用于本发明中。应意识到除了含有插入的编码序列(编码所述多肽)转录和翻译的必需元件之夕卜，本发明的表达构建体也可以包含改造为优化表达的多肽的稳定性、产生、纯化、产量或者活性的序列。在一些实施方案中，可以使用不同方法将本发明的表达载体导入宿主细胞系统中。在一些实施方案中，这种方法通常在Sambrook et al. , Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989,1992)、Ausube丄et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore,Md. (1989)、Chang et al. , Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al. , Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors A Surveyof Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass. (1988)以及Gilboa et at. [Biotechniques 4(6) :504-512,1986]中描述,包括例如稳定或者瞬时转染、脂染、电穿孔及重组病毒载体感染。此外，见美国专利No. 5，464，764和5，487，992所述阳性-阴性选择方法。在一些实施方案中，转化的细胞在有效条件下培养，所述条件使得重组改造凝固因子以较高量表达。在一些实施方案中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质产生的有效的培养基、生物反应器、温度、PH和氧条件。在一个实施方案中，有效培养基是指在其中培养细胞以产生本发明重组多肽的任何培养基。在一些实施方案中，培养基典型包括水溶液，其具有可同化的碳、氮和磷酸盐来源，以及合适的盐、矿物质、金属及其它营养素如维生素。在一些实施方案中，本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定平板和培养皿中培养。在一些实施方案中，培养是在适合重组细胞的温度、pH和氧含量条件下进行。在一些实施方案中，培养条件在本领域技术人员专业范围内。在一些实施方案中，根据用于生产的载体和宿主系统，所得的本发明的改造的凝固因子保留在所述重组细胞内、分泌进发酵培养基中、分泌进两个细胞膜之间的空间如大肠杆菌壁膜间隙内，或者保留在细胞或者病毒膜外表面上。
在一个实施方案中，在预定培养时间之后，进行重组改造凝固因子的回收。在一个实施方案中，本文所用短语“回收重组改造凝固因子”是指收集含有所述多肽的全部发酵培养基而无需包括额外的分离或者纯化步骤。在一个实施方案中，使用多种标准蛋白质纯化技术纯化本发明的改造凝固因子，所述技术例如但不限于亲和性层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水性相互作用层析、凝胶过滤层析、反向层析、伴刀豆球蛋白A层析、色谱聚焦以及不同溶解度。在一个实施方案中，为了便于回收，所述表达的编码序列可以被改造为编码本发明的改造凝固因子及融合的可裂解部分。在一个实施方案中，可以设计融合蛋白以便所述多肽可易于通过亲和性层析分离，例如通过固定在特异于所述可裂解部分的柱上。在一个实施方案中，裂解位点改造在所述改造凝固因子与可裂解部分之间，所述多肽通过用合适的酶或者在此位点特异性裂解所述融合蛋白的物质处理而从层析柱中释放[例如见Booth et al. , Immunol. Lett. 19 :65-70 (1988)以及 Gardella et al. , J. Biol. Chem. 265 15854-15859(1990)]ο在一个实施方案中，本发明的改造凝固因子是以“基本纯的”形式回收的。在一个实施方案中，短语“基本纯的”是指所述蛋白质在本文所述的应用中可以有效使用的纯度。在一个实施方案中，本发明的改造凝固因子也可以通过使用体外表达系统合成。在一个实施方案中，体外合成方法为本领域熟知，所述系统的成分可以商购。在一些实施方案中，所述重组的改造凝固因子是合成及纯化的，其治疗效カ可以在体内或者体外測定。在一个实施方案中，本发明的重组改造凝固因子可以使用本领域技术人员已知的各种测定法确定。在另ー个实施方案中，本发明的改造凝固因子可以提供给个体。在一个实施方案中，本发明的改造凝固因子可以作为药物组合物的一部分提供给个体，其在所述药物混合物中与药物可接受的载体混合。在另ー个实施方案中，“药物组合物”是指ー或多种本文所述活性成分与其它化学成分如生理学合适的载体和赋形剂的制备物。药物组合物的目的是便于将化合物施用给生物体。
在另一个实施方案中，“活性成分”是指感兴趣的多肽序列，其可以发挥相应生物学作用。在另一个实施方案中，本发明的任何组合物将包含至少一个CTP序列，所述序列以任何形式仅结合感兴趣的改造凝固因子的羧基末端。在一个实施方案中，本发明提供了组合的制备物。在一个实施方案中，“组合的制备物”特别是指“试剂盒部分”，其中上述 组合成分可以单独施用或者通过使用与不同量的组合成分的不同的固定组合施用，即同时施用、单独或者相继施用。在一些实施方案中，试剂盒部分可以同时或者相继交错施用，即在不同时间点及与所述试剂盒的其它任何部分以相等或不同时间间隔施用。在一些实施方案中，所述组合成分的总量的比率可以在所述组合制备物中施用。在一个实施方案中，所述组合的制备物可以变化，例如以应付治疗的患者亚群的需要或者由于特殊疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或者体重等而有不同需要的单个患者的需要，这些改变可以由本领域技术人员实现。在另一个实施方案中，短语“生理学可接受的载体”和“药物可接受的载体”可互换使用，是指对于生物体不引起明显刺激作用且不削弱所施用的化合物的生物学活性和性质的载体或者稀释剂。佐剂包含在这些短语范畴内。在一个实施方案中，所述药物可接受的载体中包含的成分之一可以例如是聚乙二醇(PEG)，这是在有机和水溶液介质中均具有广泛溶解性的生物相容聚合物(Mutter et al. (1979)。在另一个实施方案中，“赋形剂”是指加入药物组合物中以进一步便于施用活性成分的惰性物质。在一个实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖以及淀粉、纤维素衍生物、凝胶、植物油及聚乙二醇。配制和施用药物的技术可见于最新版本的"Remington’ sPharmaceuticalSciences, " Mack Publishing Co. , Easton, PA,所述文献并入本文作参考。在另一个实施方案中，合适的施用途径例如包括口服、经直肠、经粘膜、经鼻、肠道或者肠道外施用，包括肌内、皮下和骨髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或者眼内注射。在另一个实施方案中，所述制备物是以局部而不是全身方式施用，例如通过将所述制备物直接注射进患者身体的指定区域。本发明涵盖各种不同的施用剂量实施方案。在一个实施方案中，本发明的改造凝固因子的剂量是在O. 005-100mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. 005-5mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量在O. 01-50mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. l_20mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. I-IOmg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. 01-5mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. 001-0. Olmg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. 001-0. Img/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. l-5mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. 5-50mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在O. 2-15mg/天的范围。在另一个实施方案中,所述剂量是在O. 8-65mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在l_50mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-1Omg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在8-15mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在10-20mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在20-40mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在60-120mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在12-40mg/天的范围在另一个实施方案中，所述剂量是在40-60mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-100mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在l_60mg/天的范围。在另一个实施方案中,所 述剂量是在15-25mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在55-65mg/天的范围。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以鼻内施用形式配制。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以注射形式配制。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以O. OOOlmg-O. 6mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以
O.00lmg-o. 005mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以O. 005mg-0. Olmg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以O. Olmg-O. 3mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以O. 2mg-0. 6mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，凝固因子的氨基末端没有CTP。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以I-IOOyg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以IO-SOyg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以20-60剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以10-50 yg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以40-80 yg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以KKBOyg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以30-60 μ g剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以O. 2mg_2mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以2mg-6mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以4mg-10mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽以5mg-15mg剂量范围施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽被注射进肌肉中(肌肉注射)。在另一个实施方案中，包含凝固因子及至少一个CTP单位的多肽被注射至皮下(皮下注射)。在另一个实施方案中，包含IFN蛋白及CTP单位的多肽被注射进肌肉中。在另一个实施方案中，包含IFN蛋白和CTP单位的多肽被注射至皮下。在另一个实施方案中，本发明的方法包括增加凝固因子治疗应用的顺应性，包括为需要治疗的对象提供多肽，所述多肽包含凝固因子、附着于所述凝固因子氨基末端的一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)以及附着于所述凝固因子羧基末端的两个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，从而增加凝固因子治疗应用的顺应性。在另一个实施方案中，本发明的方法包括增加患有慢性疾病的需要凝固因子治疗的患者的顺应性。在另一个实施方案中，本发明的方法使得可以降低凝固因子的施用频率，通过如上述用CTP修饰所述凝固因子而实现。在另一个实施方案中，术语顺应性(compliance)包括坚持性(adherence)。在另一个实施方案中，本发明的方法包括通过降低凝固因子的施用频率而增加需要凝固因子治疗的患者的顺应性。在另一个实施方案中，所述凝固因子的施用频率的降低是通过CTP修饰实现的，所述修饰使得CTP修饰的凝固因子更稳定。在另一个实施方案中，所述凝固因子的施用频率的降低作为延长所述凝固因子T1/2的结果而实现。在另一个实施方案中，降低所述凝固因子的施用频率是增加所述凝固因子的清除时间的结果。在另一个实施方案中，所述凝固因子的施用频率的降低作为增加所述凝固因子的AUC量度的结果而实现。在另一个实施方案中，提供了降低凝固因子给药频率的方法，所述方法包括将1-10个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，由此降低凝固因子的给药频率。在另一个实施方案中，提供了降低凝固因子给药频率的方法，所述方法包括将1-5个CTP附着至凝固因子羧基末端的步骤，从而降低凝固因子的给药频率。
在另一个实施方案中，提供了在使用凝固因子治疗中提高顺应性的方法，所述方法包括为需要治疗的对象提供多肽，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的1-10个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，从而在使用凝固因子治疗中提高顺应性。在另一个实施方案中，提供了在使用凝固因子治疗中提高顺应性的方法，所述方法包括为需要治疗的对象提供多肽，所述多肽包含凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的1-5个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，从而在使用凝固因子治疗中提高顺应性。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每两天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每三天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每四天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每五天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每六天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每周一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每7-14天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每10-20天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每5-15天一次施用给对象。在另一个实施方案中，包含凝固因子和至少一个CTP单位的多肽每15-30天一次施用给对象。在另一个实施方案中，所述剂量是在50_500mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-150mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在100-200mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在150-250mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在200-300mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在250-400mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在300-500mg/天的范围。在另一个实施方案中，所述剂量是在350-500mg/天的范围。在一个实施方案中，所述剂量是20mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是30mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是40mg/天。在一个实施方案中,所述剂量是50mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是O. Olmg/天。在另一个实施方案中,所述剂量是O. Img/天。在另一个实施方案中，所述剂量是Img/天。在另一个实施方案中，所述剂量是O. 530mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是O. 05mg/天。在另一个实施方案中,所述剂量是50mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是IOmg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是20-70mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是5mg/天。
在另一个实施方案中,所述剂量是l_90mg/天。在另一个实施方案中,所述剂量是l-90mg/2天。在另一个实施方案中，所述剂量是l_90mg/3天。在另一个实施方案中，所述剂量是l-90mg/4天。在另一个实施方案中，所述剂量是l_90mg/5天。在另一个实施方案中，所述剂量是l-90mg/6天。在另一个实施方案中，所述剂量是l_90mg/周。在另一个实施方案中，所述剂量是l-90mg/9天。在另一个实施方案中，所述剂量是l_90mg/ll天。在另一个实施方案中，所述剂量是l_90mg/14天。在另一个实施方案中，所述凝固因子的剂量是10_50mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/2天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/3天。在另一个实施方案中，所述剂量是10_50mg/4天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/5天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/6天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/周。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/9天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/ll天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/14天。在一个实施方案中，口服施用包括单位剂量形式，包括片剂、胶囊剂、锭剂、咀嚼片齐U、悬浮剂、乳剂(emulsion)等。这种单位剂量形式包含安全且有效量的希望的本发明的凝固因子，在一个实施方案中，其剂量从大约O. 7或3. 5mg至大约280mg/70kg，或者在另一个实施方案中，其剂量为大约O. 5或IOmg至大约210mg/70kg。适于口服单位剂量形式制备的药物可接受的载体为本领域熟知。在一些实施方案中，片剂典型包含常规制药学相容的佐剂如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；结合剂如淀粉、凝胶和蔗糖；崩解剂如淀粉、褐藻酸和交联羧甲纤维素(croscarmelose);润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施方案中，助流剂如二氧化硅可用于改善粉末混合物的流动特性。在一个实施方案中，从外观而言可以加入着色剂如FD&C染料。甜味剂和香味剂如天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甲醇、薄荷及果味调料可用于咀嚼片剂的佐剂。胶囊剂典型包含上述一或多种固体稀释剂。在一些实施方案中，载体成分的选择依赖于接下来的考虑事项，如味道、成本和贮存稳定性，其对于本发明的目的不是关键因素，可由本领域技术人员选择。在一个实施方案中，口服剂型包含预定的释放模式。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含持续释放片剂、胶囊剂、锭剂或者咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含缓释片剂、胶囊剂、锭剂或者咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含立即释放片剂、胶囊剂、锭剂或者咀嚼片剂。在一个实施方案中，所述口服剂型根据所述药物活性成分的希望释放模式配制，如本领域技术人员已知。在一些实施方案中，口服组合物包含液体溶液、乳剂、悬浮剂等。在一些实施方案中，适于制备这种组合物的药物可接受的载体为本领域熟知。在一些实施方案中，液体口服组合物包含大约O. 001%至大约O. 933%的希望的化合物，或者在另一个实施方案中，包含大约O. 01%至大约10%的希望的化合物。在一些实施方案中，用于本发明方法中的组合物包含溶液或者乳剂，在一些实施方案中是包含安全且有效量的本发明化合物的水性溶液或者乳剂，及任选含有用于局部鼻内施用的其它化合物。在一些实施方案中，所述组合物包含大约O. 001%至大约10. 0% w/V的所述化合物，更优选包含大约00. 1%至大约2. O %的所述化合物，用于通过鼻内途径系统性输送所述化合物。在另一个实施方案中，所述药物组合物通过静脉内、动脉内或者肌内注射液体制备物的方式施用。在一些实施方案中，液体配制物包括溶液、悬浮剂、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施方案中，所述药物组合物经静脉内施用，因此配制成适于静脉内施用的形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物经动脉内施用，因此配制成适于动脉内施用的形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物经肌内施用，因此配制成适于肌施用的形式。进一步地，在另一个实施方案中，所述药物组合物局部施用于身体表面，因此配制成适于局部施用的形式。合适的局部配制物包括凝胶、软膏(ointments)、乳膏(creams)、洗剂(lotions)、滴剂(drops)等。对于局部施用，本发明的化合物与另外的适当治疗剂组 合、制备及作为在有或无药物载体的生理学可接受的稀释剂中的溶液、悬浮剂或者乳剂形式应用。在一个实施方案中，本发明的药物组合物通过本领域熟知的方法生产，例如通过常规混合、溶解、粒化(granulating)、包衣(dragee-making)、水磨(levigating)、乳化、胶囊化、包入(entrapping)或者冻干等方法。在一个实施方案中，用于本发明中的药物组合物以常规方式配制，配制时使用一或多种生理学可接受的载体，包括赋形剂和辅助剂，其便于将所述活性成分加工成可以药物学应用的制备物。在一个实施方案中，配制依赖于选择的施用途径。在一个实施方案中，本发明的注射剂在水溶液中配制。在一个实施方案中，本发明的注射剂在生理学相容的缓冲液如中Hank' s溶液、Ringer' s溶液或者生理盐水缓冲液中配制。在一些实施方案中，对于经粘膜施用，在配制中使用适于渗透通过屏障的渗透剂。这种渗透剂为本领域已知。在一个实施方案中，本文所述制备物配制为肠道外施用形式，例如通过推注(bolus injection)或者连续输注形式。在一些实施方案中，注射用配制物是单位剂量形式，例如在安瓿或者在多剂量容器中，任选具有加入的防腐剂。在一些实施方案中，组合物是在油相或者水溶液载体中的悬浮剂、溶液或者乳剂，且含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含防腐剂，如苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)和硫柳萊(thimerosal)等；螯合剂如乙二胺四乙酸钠(edetate sodium)等；缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液；张度剂如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂如抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂、粘性调节剂如聚合物，包括纤维素及其衍生物；以及聚乙烯醇和酸及碱，以根据需要调节这些水相组合物的PH值。在一些实施方案中，所述组合物还包含局部麻醉剂或者其它活性成分。所述组合物可用作喷雾剂、合剂(mist)、滴剂等。在一些实施方案中，肠道外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制备物的水溶液。此外，在一些实施方案中，活性成分的悬浮液制备成适当的基于油或水的注射悬浮液。在一些实施方案中，合适的亲脂性溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酸酯或者脂质体。在一些实施方案中，水相注射悬浮液含有增加该悬浮液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或者葡聚糖。在另一个实施方案中，所述悬浮液含有合适的稳定剂或者增加活性成分溶解性的制剂，以使得可以制备高浓缩的溶液。在另一个实施方案中，所述活性化合物可以在运载体、特别是在脂质体中输送(见 Langer, Science 249:1527-1533(1990) ；Treat et al. , in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.),Liss,New York,pp. 353-365(1989) ；Lopez-Berestein,ibid. ,pp. 317-327 ；see generallyibid)。 在另一个实施方案中，在控制释放系统中输送的药物组合物配制成静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或者其它施用模式。在一个实施方案中，使用泵(见Langer, supra ;Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14201 (1987) ；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980) ；Saudek et al.，N. Engl. J. Med. 321 :574 (1989)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。在另一实施方案中，可以将控制释放系统置于治疗靶位的附近，即脑部，因此仅需要全身剂量的一部分(见例如Goodson, in Medical Applicationsof Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)。其它控制释放系统参见Langer (Science 249:1527-1533(1990)论述。在一些实施方案中，所述活性成分是粉末形式，在使用之前用合适的运载体如无菌无热原的基于水的溶液重建。在一些实施方案中，组合物配制成以雾化和吸入方式施用。在另一个实施方案中，组合物包含在具有附带的雾化装置的容器中。在一个实施方案中，本发明的制备物配制成直肠施用形式的组合物如栓剂或者保留灌肠剂，使用例如常规的栓剂基质如可可油或者其它甘油酯配制。在一些实施方案中，适用于本发明的药物组合物包括其中包含以有效实现指定目的的量的所述活性成分。在一些实施方案中，治疗有效量是指活性成分有效预防、减轻或者改善疾病症状或者延长治疗对象生存时间的量。在一个实施方案中，治疗有效量的确定为本领域技术人员熟知。可以作为药物可接受的载体的物质或者其成分的一些实例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；凝胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油及可可油(theotooma);多元醇如聚乙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇及聚乙二醇；褐藻酸；乳化剂，如Tween 乳化剂；湿润剂，如十二烧基硫酸钠；着色剂；香味剂；成片剂，稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；以及磷酸盐缓冲溶液。与所述化合物联合使用的药物可接受的载体的选择基本上由施用所述化合物的方式决定。在一个实施方案中，如果所述化合物是通过注射施用，则所述药物可接受的载体是无菌生理盐水，血液相容的悬浮剂，其PH已经调节为大约7. 4。此外，所述组合物进一步包含粘合剂(例如阿拉伯树胶、玉米淀粉、凝胶、carbomer、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚烯吡酮)，崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸、二氧化娃、croscarmelose sodium、crospovidone、瓜尔胶、羟基乙酸淀粉钠)，不同PH和离子浓度的缓冲液(例如Tris-HCl，乙酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液)，添加剂如白蛋白或者凝胶以防止吸附于表面，洗涤剂(例如Tween 20，Tween80, Pluronic F68,胆酸盐)，蛋白酶抑制剂,表面活性剂(例如十二烧基硫酸钠)，渗透增强剂，增溶剂(例如甘油、聚乙烯甘油)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，焦亚硫酸钠，丁基轻基苯甲醚)，稳定剂(例如轻丙基纤维素，轻丙基甲基纤维素)，增粘剂(例如carbomer,胶状二氧化硅，乙基纤维素，瓜尔胶)，甜味剂(例如天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，柠檬酸)，防腐剂(例如Thimerosal,苯甲醇，parabens),润滑剂(例如硬脂酸,硬脂酸镁,聚乙二醇，十二烷基硫酸钠)，助流剂(例如胶态二氧化硅)，增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯，柠檬酸三乙酯)，乳化剂(例如carbomer、轻丙基纤维素、十二烧基硫酸钠,聚合物包衣(例如poloxamers或poloxamines),包衣和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。糖浆、酏剂、乳状液和悬浮液的载体的典型成分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于悬浮液，典型的悬浮剂包括甲基纤维素、羧 甲基纤维素钠、纤维素(例如Avicel ，RC-591)、黄芪胶和藻酸钠；典型的湿润剂包括卵磷脂和聚环氧乙烧山梨聚糖(例如polysorbate 80)。典型的防腐剂包括轻苯甲酯(methyl paraben)和苯甲酸钠。在另一个实施方案中，口服液体组合物还含有一或多种成分如上述甜味剂、香味剂及着色剂。所述组合物还包括将所述活性成分掺入在特定的聚合化合物制备物之中或之上，所述聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸(polglycolic acid)、水凝胶等，或者掺入在脂质体、微乳状液、微团、单层(unilamellar)或多层(multilamelIar)小泡、红细胞影(erythrocyte ghosts)或者原生质球)之上。这种组合物将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。本发明还涵盖了用聚合物(例如poloxamers或者poloxamines)包被的特殊组合物，及与组织特异性受体、配体或者抗原的抗体结合的或者与组织特异性受体的配体结合的化合物。在一些实施方案中，通过共价附着水溶性聚合物修饰化合物，所述水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或者聚脯氨酸。在另一个实施方案中，所述修饰的化合物呈现出与相应未修饰的化合物相比在静脉内注射之后在血液中较长的半衰期。在一个实施方案中，修饰也增加所述化合物在水溶液中的稳定性，消除聚集，增强所述化合物的物理和化学稳定性，以及极大地降低了所述化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施方案中，通过与未修饰的化合物相比以较低频率或者较低剂量施用这种聚合物-化合物而实现希望的体内生物活性。在一些实施方案中，有效量或剂量的制备最初可以从体外测定中估算。在一个实施方案中，可以在动物模型中确定剂量，这种信息可用于更精确地确定在人体中的可用剂量。在一个实施方案中，如本文所述活性成分的毒性和治疗效力可以通过标准制药程序在体外、细胞培养或者实验动物研究中确定。在一个实施方案中，得自这些体外和细胞培养测定及动物实验研究的数据可用于配置用于人体的剂量范围。在一个实施方案中，剂量根据使用的剂量形式和施用途径而不同。在一个实施方案中，精确的配制物、施用途径和剂量可以由主治医生根据患者状况选择[见例如Fingl，et al.，(1975)" ThePharmacological Basis of Therapeutics" , Ch. Ip. I]。
在一个实施方案中，根据所治疗的疾病的严重性及反应性，可以单次或者多次施用，治疗时程从几天至几周或者直至治愈或者实现疾病状态减轻。在一个实施方案中，组合物的施用量当然根据治疗对象、疾病严重性、施用方式、主治医生的判断等因素确定。在一个实施方案中，也可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明制备物的组合物，置于合适容器中，及标示治疗指征。在另一个实施方案中，如本文所述凝固因子通过全身施用方式施用。在另一个实施方案中，如本文所述凝固因子通过静脉内、肌内或者皮下注射方式施用。在另一个实施方案中，如本文所述凝固因子是冻干的(即冷冻干燥的)制备物，组合复合的有机赋形剂和稳定剂如非离子表面活性物质(即表面活性剂)、各种糖、有机多元醇和/或人血清白蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含在无菌注射水中冻干的如本文所述凝固因子。在另一个实施方案中，药物组合物包含在注射用无菌PBS中冻干的如本文所述凝固因子。在另一 个实施方案中，药物组合物包含在注射用无菌0.9% NaCl中冻干的如本文所述凝固因子。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述凝固因子及复合载体如人血清白蛋白、多元醇、糖及阴离子表面活性稳定剂。见例如W089/10756 (Hara et al.-含有多元醇及P-羟基苯甲酸酯)。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述凝固因子及乳糖酸和乙酸盐/甘氨酸缓冲液。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述凝固因子和氨基酸，如精氨酸或者谷氨酰胺，其增加干扰素成分在水中的溶解性。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述冻干的凝固因子及甘氨酸或者人血清白蛋白(HSA)、缓冲液(例如乙酸盐缓冲液)和等渗剂(例如NaCl)。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述冻干的凝固因子及磷酸盐缓冲液、甘氨酸和HAS。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物置于pH在大约4-7. 2之间的缓冲溶液中是稳定的。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物是用氨基酸作为稳定剂稳定的，在一些情况中用盐作为稳定剂(如果所述氨基酸不含有带电荷侧链的情况)。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物是液体组合物，其包含重量在大约O. 3% -5%之间的稳定剂，所述稳定剂是氨基酸。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物提供了剂量准确性和产品安全性。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物提供了生物活性的稳定的液体配制物，用于注射应用中。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述非冻干的凝固因子。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物提供了这样的液体配制物，其使得可以长期以液态形式贮存，便于在施用之前贮存和运输。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的注射用药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施方案中，通过喷雾冷凝的脂质微粒的产生由Speiser (Speiser and al. , Pharm. Res. 8 (1991) 47-54)所述，随后脂质纳米球通过口服施用(Speiser EP 0167825(1990))。在另一个实施方案中，使用的脂质为机体良好耐受(例如由存在于肠道外营养乳状液中的脂肪酸组成的甘油酯)。
在另一个实施方 案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物是脂质体形式(J. E. Diederichs and al.，Pharm. /nd. 56 (1994) 267-275)。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含聚合的微粒。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的注射用药物组合物包含聚合的微粒。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含纳米粒子。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含脂质体。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含脂质乳状液。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含微球。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含脂质纳米粒子。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含具有两亲性脂质的脂质纳米粒子。在另一个实施方案中，包含如本文所述凝固因子的药物组合物包含脂质纳米粒子，所述脂质纳米粒子包含药物、脂质基质和表面活性剂。在另一个实施方案中，所述脂质基质具有至少50% w/w的甘油一酸酯含量。在一个实施方案中，本发明的组合物存在于包装(pack)或者分配器(dispenser)中，如FDA批准的试剂盒，其含有一或多个单位剂量形式，所述单位剂量形式含有所述活性成分。在一个实施方案中，所述包装例如包含金属或者塑料薄片，如发泡包装。在一个实施方案中，所述包装或者分配器附带使用说明书。在一个实施方案中，所述包装或分配器在容器中附带声明，所述声明的形式按照管理药品制造、使用或销售的政府机构规定，该声明反映所述机构批准人用或兽用组合物形式。在一个实施方案中，这个声明是由美国食品和药品管理局批准的关于处方药的标签或者许可的产品插页。在一个实施方案中，应意识到本发明的凝固因子可以与其它活性药剂一起提供给个体，以实现与用单一药剂自身治疗相比改善的治疗效力。在另一个实施方案中，测量与组合治疗相关的副作用(例如互补药剂的施用和选择)。本发明的其它目的、优势和新特征根据如下非限制性实施例的实验将为本领域技术人员显而易见。此外，如上文描述以及在下文权利要求书中所述的本发明的各个实施方案和各个方面在如下实施例中得到实验支持。
实施例通常地，本文所用命名法及在本发明中使用的实验程序包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分阐述。见例如"Molecular Cloning A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989) ； " Current Protocols in MolecularBiology " Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994) ；Ausubel et al. , " CurrentProtocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland (1989)；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning " , John Wiley & Sons, NewYork(1988) ；ffatson et al. , " Recombinant DNA " , Scientific American Books,New York ；Birren et al. (eds)" Genome Analysis A Laboratory Manual Series",Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);方法学见如美国专利 No. 4，666，828 ;4，683，202 ;4，801，531 ;5，192，659 及 5，272，057 ; " Cell Biology A Laboratory Handbook " , Volumes I-III Cellis, J. E. , ed. (1994) ； " Culture ofAnimal Cells-AManual of Basic Technique" by Freshney, ffiley-Liss, N. Y. (1994),Third Edition ； " Current Protocols in Immunology " Volumes I-III ColiganJ. E. , ed. (1994) ；Stites et al. (eds), " Basic and Clinical Immunology " (8thEdition),Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994) ；Mishell and Shiigi (eds)," SelectedMethods in Cellular Immunology " , W H. Freeman and Co. , New York(1980)；可利用的免疫测定在专利和学术论文中充分描述，见例如美国专利No. 3，791,932 ；3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ;3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ；3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ;4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 和5,281,521 ； " Oligonucleotide Synthesis " Gait, M. J.，ed. (1984) ;“Nucleic AcidHybridization " Hames, B.D. , and Higgins S. J. , eds. (1985) ； " Transcriptionand Translation " Hames, B.D., and Higgins S. J. , eds. (1984) ； " Animal CellCulture " Freshney, R. I. , ed. (1986) ； " Immobilized Cells and Enzymes " IRLPress, (1986) ； " A Practical Guide to Molecular Cloning " Perbal, B. , (1984)and" Methods in Enzymology" Vol.1-317,Academic Press ； " PCR Protocols A GuideTo Methods And Applications" , Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak etal. , " Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual" CSHL Press (1996);所有这些文献均并入本文作参考。其它一般的参考文献在文中提供。实施例I凝固因子IX的产生和应用因子IX(FIX)是具有415个氨基酸(55KDa)的糖蛋白，其属于与凝血系统相关的维生素K依赖型糖蛋白。FIX具有与因子FVII、因子X、蛋白质C和凝血酶原相似的结构域 组构，这些因子以前体被合成，具有N末端前肽及随后的成熟氨基酸序列。FIX作为单链分子分泌，其经历复杂的转录后修饰，许多修饰对于其生物化学和药动学性质是关键的。在所有的转录后修饰中，在FIX氨基末端附近的12个谷氨酸残基是最关键的残基，其被维生素K依赖性Y羧化酶Y羧化。羧化是FIX与磷脂表面相互作用及最佳FIX活性所需的。所述氨基末端前肽作为Y羧化酶的识别位点，因此在Y羧化之后由已知称作成对的碱性氨基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleave Enzyme) (PACE/Furin)的高尔基复合体丝氨酸蛋白酶(Golgi apparatus serine protease)裂解除去。在高尔基复合体发生四个额外的转录后修饰，即第155位酪氨酸硫酸化、第158位丝氨酸磷酸化、第63和61位Ser的O-糖基化，及最后在第157位和16位的N-糖基化。FIX作为单链无活性酶原在血浆中循环(平均浓度为5 μ g/ml)。当由一或两种生理学激活物FVIIa-TF复合物或FIXa在两个肽键Arg 145和Arg 180进行蛋白酶解时，激活肽被除去，将FIX转变为由单个二硫键连接的轻链和重链组成的完全活性的酶。所述N末端轻链含有非催化性Y-羧基谷氨酸(Gla)及两个表皮生长因子样结构域，而C末端重链含有该分子的胰蛋白酶样催化结构域。单独的FIXa特征在于不佳的催化活性。然而，当与FVIII复合时，其对于其天然底物FX的蛋白酶解活性增加4-5个量级。B型血友病是一种X连锁的由因子IX(FIX)基因突变所致的出血性疾病，导致FIX的促凝固活性缺陷。B型血友病患者具有自发的软组织出血及反复发作的关节血肿(hemarthroses),通常导致严重的关节病(Arthoathy)。目前治疗这些患者的方法包括静脉内施用重组FIX。然而FIX的成本及从循环中相对快速的清除的问题使得需要开发一种长效 FIX。CTP技术用于开发长效FIX。特别地，重组rFIX分子的延长的半衰期通过将至少一个人CTP与FIX融合而进行。所述重组的FIX-CTP在哺乳动物细胞中表达并在体外和体内进行鉴定。经证实rFIX-CTP的体外活性与rFIX相当。在大鼠中进行药动学和药效研究，证实rFIX-CTP的改善的性质。这项研究的结果证实开发具有与野生型酶相似的止血性质但半衰期延长的rFIX分子是可行的。重组FIX分子的克隆与表达将Dg44细胞铺板于IOOmm组织培养皿中并生长至50_60%铺满。使用在无蛋白质培养基中的 FuGene 试剂(Roche) (Invitrogene CD Dg44)，将总共 2 μ g (微克)FIX cDNA用于转染一个IOOmm平板。在转染后48小时除去培养基，更换为无核苷及存在800 μ g/mlG418 (Neomycin)的无蛋白质培养基(Invitrogene CD Dg44)。14天后,将转染的细胞群转移至T25组织培养瓶中，持续选择10-14天，直至细胞开始生长为稳定克隆。选择高表达的克隆。将大约2xl07个细胞用于接种在1700cm2滚瓶(Corning,Corning NY)中的300ml生长培养基，其中补加了 5ng/ml维生素K3(甲基萘醌亚硫酸氢钠；Sigma)。在细胞存活力迅速下降至大约70%之后，收集生产培养基(收获物)。首先澄清所述生产培养基，然后浓缩大约20倍，使用流式过滤盒(IOKDa MWCO ；Millipore Corp.)用PBS透析。FIX抗原水平的确定FIX-CTP收获物的抗原水平通过使用AssayMax Human FIX ELISA试剂盒(AssayPro-EF1009-l)确定,计算的蛋白质浓度是在两个单独实验运转中三个不同稀释度的平均值(图3A)。表I :计算的蛋白质浓度
权利要求
1.一种多肽，其由凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的1-5个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。
2.权利要求I的多肽，其中所述肽由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的I或.2个促性腺激素羧基末端肽组成。
3.权利要求I的多肽，其中至少一个CTP的序列包含选自含有SEQIDNO 1和SEQ IDNO 2的组的氨基酸序列。
4.权利要求I的多肽，其中所述至少一个CTP是糖基化的。
5.权利要求I的多肽，其中所述至少一个CTP是截短的。
6.权利要求I的多肽，其中所述至少一个CTP通过接头附着至所述凝固因子。
7.权利要求6的多肽，其中所述接头是肽键。
8.权利要求I的多肽，其中所述凝固因子是维生素K依赖性糖蛋白。
9.权利要求I的多肽，其中所述凝固因子是因子IX。
10.权利要求I的多肽，其中所述凝固因子是因子VII。
11.权利要求I的多肽，其中所述凝固因子是因子Vila、因子VIII、重组B-结构域-缺失的因子 VIII (rFVIIIBDD)。
12.包含权利要求I的多肽的药物组合物。
13.包含编码多肽的编码部分的多核苷酸分子，所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子羧基末端的1-5个促性腺激素羧基末端肽组成。
14.权利要求13的多核苷酸分子，其中所述多肽由凝固因子及附着于所述凝固因子的羧基末端的I或2个促性腺激素羧基末端肽组成。
15.权利要求13的多核苷酸分子，其中所述至少一个CTP是截短的。
16.权利要求13的多核苷酸分子，其中至少一个CTP由选自含有SEQIDNO :1和SEQID NO 2的组的氨基酸序列编码。
17.权利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是维生素K依赖性糖蛋白。
18.权利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是因子IX。
19.权利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是因子VII。
20.权利要求13的多核苷酸分子，其中所述凝固因子是因子Vila、因子VIII、重组B-结构域-缺失的因子VIII (rFVIIIBDD)。
21.表达载体,其包含权利要求13的多核苷酸分子。
22.包含权利要求21的表达载体的细胞。
23.包含权利要求21的表达载体的组合物。
24.延长凝固因子生物学半衰期的方法，所述方法包括将至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的生物学半衰期。
25.改善凝固因子曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括将至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述凝固因子羧基末端的步骤，由此改善凝固因子的曲线下面积(AUC)。
26.减少凝固因子给药频率的方法，所述方法包括将至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述凝固因子羧基末端的步骤，由此减少凝固因子的给药频率。
27.在使用凝固因子治疗中提高顺应性的方法，所述方法包括向有需要的对象提供一种多肽，所述多肽包含凝固因子、附着于所述凝固因子羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此在使用凝固因子治疗中提高顺应性。
28.治疗患有血友病的对象的方法，所述方法包括向所述对象提供一种多肽，所述多肽包含凝固因子、附着于所述凝固因子羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽，由此治疗患有血友病的对象。
29.权利要求24-28的方法，包括将I或2个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽附着至所述凝固因子羧基末端的步骤。
30.权利要求24-28的方法，其中至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的序列由选自含有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的组的氨基酸序列所编码。
全文摘要
多肽及编码其的多核苷酸，所述多肽包含附着至凝固因子羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素的羧基末端肽(CTP)。还公开了包含本发明多肽和多核苷酸的药物组合物以及使用其的方法。
文档编号C07K14/59GK102639144SQ201080040296
公开日2012年8月15日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月9日
发明者G·哈特, U·E·菲马 申请人:波洛尔生物科技有限公司