专利名称：提纯凝固因子Ⅷ的方法
提纯凝固因子Vl I I的方法本发明涉及提纯凝固因子VIII (简称FVIII)的方法和通过本发明的方法获得的 含有FVIII的级分。
背景技术：
血友病是一种遗传性疾病，其降低人体控制血液凝结或凝固的能力。在其最普通 的形式，血友病A中，凝固FVIII是缺失的，血友病A在5，000-10, 000名男婴中约出现1 例。FVIII蛋白质是血液凝固中具有多功能性质的重要协同因子。可以用FVIII的血浆 源性浓缩液或用重组产生的FVIII来治疗FVIII的缺失。使用FVIII浓缩液的治疗已经 使血友病患者过上了正常的生活。在历史上，已经使用源自人类血浆的FVIII来治疗血友 病A。在血浆中，在正常条件下，FVIII分子通常与其协同因子、血管假性血友病因子(von Willebrandt factor) (vfff)有关，所述血管假性血友病因子使不同退化形式的FVIII分子 稳定。血浆源性FVIII产品以不同的纯度出现在市场上，并且存在或多或少量的vWf。通 常，具有低含量vWf的产品含有附加的人血白蛋白和/或其他稳定剂(包括增加的盐浓度 以使FVIII分子稳定)。提纯FVIII的方法通常是不同沉淀法与色谱法步骤的组合，所述沉 淀法例如冷沉淀法、氢氧化铝沉淀法等，所述色谱法主要例如离子交换步骤、亲和过滤步骤 和凝胶过滤步骤。为了改善FVIII产品，使用亲合色谱法，亲合色谱法有效地去除污染物达到高度 的FVIII纯度，包括同时降低vWf的可能性(Farrugia等，Biotechnology and plasma fractionation industry ；The impact of advances in the production of coagulation FVIII. Biotechnology, Vol. 3，No. 1，1993年2月)。免疫亲和色谱法的缺点在于其比较昂 贵以及用作亲和配体的单克隆抗体源自动物。在20世纪80年代中期，发生了与血浆源性FVIII产品有关的一些病毒传染。即 使通过进行特定的病毒降低步骤解决了这一问题，这依然是开发重组FVIII产品(rFVIII) 的出发点。在20世纪90年代，第一个rFVIII产品上市，到现在有三种不同的具有高纯度 的(全部不含有vWf) rFVIII产品(两种全长分子和一种B-结构域剔除分子，在所述B-结 构域剔除分子中FVIII分子的非活性部分被去除，从而增加宿主细胞的生产力(Eriksson 等，The manufacturing process for B-domain deleted recombinant FVIII. Seminars in Hematology, Vol 38，No 2，Suppl. 4(April)，20001 :24-31 页))。用于提纯rFVIII的提纯方法都是不同色谱技术的组合(参见Miattacharyya等， Review article ；Recombinant FVIII for Haemophilia “An overview of production technologies”· CRIPS Vol. 4，No. 3，2003年6月_9月)。一种方法是已知的免疫亲和技术 (虽然有解决这一问题的产品，例如使用肽亲合力(Kelly等，Development md validation of an affinity chromatography step using a peptide ligand for cGMP production of FVIII)或像用于血浆FVIII —样使用的酵母源性抗体片段(VIIISelect FVIII亲和树 脂-GE Health care公司，商品目录号17-5450正在进入市场)。
由于在所有rFVIII产品中都不含有vWf，因此必须采取特定的措施以使FVIII分 子稳定而不丧失活性(聚集、蛋白酶、表面吸附等)。在这些产品中的一个中，加入了螯合剂 (EDTA等)从而保护FVIII防止金属蛋白酶的退化(US-A-5, 831,026).为了增加rFVIII分 子的稳定性，已经采取的方法有加入白蛋白、抑肽酶、胰岛素或甚至使rFVIII与vWf共表达 (并在提纯周期后阶段将其去除)(参见Bhattacharyya等，Review article ；Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies，，· CRIPS Vol. 4, No. 3，2003 年 7 月-9 月)。在EP-A-I 707 634中描述了另一种方法(保持没有哺乳动物添加剂和螯 合剂的方法)，其中增加的盐量的组合对rFVIII产品的稳定性和高回收率做出贡献 (Wang 等，Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003)，1-15.)。然而，这一技术具有特定的缺点。例如，较高的盐含 量使得其不适于在不稀释的情况下直接用离子交换器处理(并可能不稳定化，Parti等，In vitro stability of recombinant FVIII. Haemophilia(2000),6, 513-522. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87，No. 3，2004 年 8 月 5 日·)。W0-A-2009/007451公开了一种使用混合模态或多模态树脂的FVIII提纯方法。该 提纯方法基于使FVIII蛋白质与含有配体的多模态或混合模态树脂接触，并用洗脱缓冲液 洗脱所述FVIII蛋白质，所述配体包含疏水部分和带负电部分，所述洗脱缓冲液含有至少 1.5M盐和至少40% (W/V)的乙二醇、丙二醇或其混合物以及钙离子。EP-A-1707634公开了一种重组制备的蛋白质的分离方法，即通过各种方法，例如 免疫亲和色谱法、亲和色谱法、蛋白质沉淀法、缓冲液交换法、离子交换色谱法、疏水作用色 谱法、混合模态疏水/离子交换色谱介质、螯合色谱法、糖亲和类凝集素或肝素亲和色谱 法、尺寸排除色谱法、电泳、渗析，不同的沉淀剂，例如乙聚二醇、硫酸铵、乙醇，羟基磷灰石 吸附、过滤膜吸附、与磁性颗粒结合的配体等。然而，其确定特殊的色谱提纯步骤。W0-A-2005-08M83公开了一种从液体中的一种或多种杂质中提纯抗体的方法，所 述方法包括使所述液体与由支撑物构成的第一色谱树脂接触，在所述支撑物上固定有多模 态配体从而使抗体吸附在树脂上，其中每种多模态配体包含至少一个阳离子交换基团和至 少一个芳香族或杂芳族环体系。加入洗脱液以使抗体从树脂中释放出来，并使洗出液与第 二色谱树脂接触。TO-A-2005/121163公开了一种从蛋白质溶液中分离一种或多种蛋白质的方法。所 述方法包括提供蛋白质溶液的步骤，所述蛋白质溶液含有一种或多种特定蛋白质，并且具 有预定的PH值和预定的离子强度或电导率，
发明内容
本发明的一个目的在于通过提供新方法来避免现有技术中提纯方法的缺点。本发 明的另一目的在于提供一种具体从具有高盐含量的原料中提纯FVIII的方法，特别是在重 组FVIII的制造中使用它们时。这通过采用色谱法的在提纯顺序中提纯凝固FVIII的方法来实现，其中至少一个 色谱法使用多模态树脂来进行。本文所用术语“多模态树脂，，是指具有支撑体和与支撑体 结合的配体(moiety)的色谱材料，其中所述配体与待分离的物质的化学基团相互作用。在本发明的具体实施方案中，多模态树脂包含与基体结合的配体并且所述配体能够通过离子 相互作用或诸如氢键和/或疏水作用的其他类型的相互作用来与混合物中的FVIII相互作用。根据本发明，提供一种采用色谱法的提纯或浓缩凝固FVIII的方法，所述方法包 括以下步骤在具有高离子强度的水性溶液中提供含有FVIII的级分；使含有FVIII的级 分与多模态树脂接触；任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附有FVIII的多模态树脂；通过水 性洗脱缓冲液洗脱含有FVIII的级分，所述洗脱缓冲液含有至少一种在pH值为6-8的条件 下带正电的氨基酸；以及任选地收集提纯形式或浓缩形式的含有FVIII的级分。多模态(或混合模态)色谱是一种提纯蛋白质的工具。例如，在GE Health Care公 司的制造商数据清单(11-0035-45AA)Capto Adhere,GE Health Care公司的制造商数据清 单(28-9078-88AA)Capto MMC 和专利申请 EP 07114856. 3"A process for the isolation and purification of a target protein, free of prion proteins"中进 了描述。这些技术具有某些的优点和缺点。与更常用的离子交换色谱相比，一个优点是在 高盐浓度的条件下结合蛋白质的可能性。缺点在于洗脱通常包括比较苛刻的条件，例如低 于或高于中性的PH值，单独或与其他洗脱参数组合。例如就中性值pH值6-8以外的pH值 而言，而言，FVIII是相对不稳定的蛋白质(Wang等，Coagulation FVIII，structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals，259 (2003)，1—15)。^在中性附近PH范围的温和洗脱条件来解决这一问题，所述条件保持FVIII分子的活性并且 使例如在EP-A-1707634中描述的与增加的盐浓度的稳定化作用组合的多模态色谱法的使 用更容易。根据本发明的一个实施方案，可以在色谱柱中进行所述多模态色谱法。这可以称 为第一捕获步骤。本发明的方法还可以在分批模式下进行。本发明还使得在不加入人体或 动物源性稳定剂的提纯方法变得容易，并使得没有其(基于单克隆抗体的免疫亲和树脂) 存在的整个方法的使用变得容易。特别是对于捕获步骤，与常规离子交换器相比，多模态树 脂的使用还使高结合能力变得容易，这导致从该步骤中得到更加浓缩的产物洗出液，这有 利于产物的稳定性。本发明的方法通常涉及重组FVIII (FVIII)的提纯，所述重组FVIII特别是B-结 构域剔除的重组FVIII。通常FVIII溶液含有在高盐浓度溶液中的FVIII，所述高盐浓度溶液在25°C下电 导率为约25至200mS/cm。在本发明的另一个实施方案中，将FVIII应用于多模态树脂，并且在与多模态树 脂结合之后，用合适的缓冲液洗脱。在将含有FVIII和结合FVIII的混合物应用于多模态树脂之后，使用洗脱缓冲液 将FVIII分子从多模态树脂洗脱，所述洗脱缓冲液含有至少一种在pH值6至8的条件下带 正电的氨基酸，所述在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸具体是赖氨酸、精氨酸和/或
组氨酸。另外，所述缓冲液可以含有至少一种含羟基的有机化合物，如醇；至少一种含氨基 的有机化合物，如氨基酸；Ca2+离子源；至少一种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐， 例如特别是浓度< IM的NaCl ；非离子洗涤剂以及缓冲物质，所述缓冲物质将pH值调节为
6约6至约8，特别是调节至大约中性的值。在本发明方法的另一实施方案中，所述醇可以选自甲醇、丙醇和乙二醇；所述氨基 酸可以选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸；所述Ca2+离子源可以是CaCl2;所述无机盐可以选自 KCl和NaCl ；所述非离子洗涤剂可以选自Tween 20、Tween 80和Pluronic F68 ；所述缓冲 物质可以选自PH值在6至8之间的柠檬酸钠、组氨酸、HEPES, MES和乙酸钠。具体而言，在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸的浓度为至少> 0. 4M，特别是 >0.5M。如果使用浓度大于IM的特殊的氨基酸，则不会导致其他优点。典型地，精氨酸的 量在约ο. 4M至约1. OM的范围内，特别是在约0. 7M至0. 9M的范围内。所述诸如醇的含羟 基的有机化合物，例如乙二醇的量具体为0% (ν/ν)至30% (ν/ν)，特别是约5%至15%。 钙离子浓度应当在0. 0001Μ至约0. IM的范围内，特别是约0. OOlM至约0. 03Μ。调节缓冲液 的离子强度的化合物浓度应在提供25°C下约15至约200mS/cm电导率的范围内。非离子洗 涤剂的量典型地在约0. 001%至的范围内。在本发明方法的实施方案中，对多模态树脂使用清洗缓冲液。其可以用于在释放 FVIII之前将污染物洗去并保留FVIII。在本发明方法的另一实施方案中，所述“多模态”色谱树脂含有以下基团中的至少 一种i)带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体ii)带负电的2_(苯甲酰胺基)丁酸配体，iii)苯基丙基配体，iv)正己基配体，ν) 4-巯基-乙基-吡啶配体，vi) 3- ((3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)-苯基)-氨基)-苯甲酸配 体或其组合。具体而言，在本发明的方法中，所述“多模态”色谱树脂选自以下市售的树脂ΗΕΡ Hypercel ；PPA Hypercel ；Capto Adhere ；Capto MMC ；MEP Hypercel 。在本发明方法的另一实施方案中，将所述多模态色谱法步骤与FVIII亲和色谱法 步骤组合，其中亲和由蛋白质配体提供，所述蛋白质配体是例如在酵母中表达的抗体片段。根据本发明的方法，提纯顺序还包括病原体移除/失活步骤，所述病原体移除/失 活步骤包括基于化学方法的失活步骤、基于尺寸的移除步骤、色谱法步骤或其组合，这些步 骤基于待移除病原体的不同生理性质。在本发明方法的一个具体实施方案中，提纯顺序还包括以下步骤i.阴离子膜的使用，如Sartobind Q，所述阴离子膜具体用于DNA削减；ii.阳离子多模态树脂，如Capto MMC ；iii.阳离子交换树脂，如 SP Sepharose FF;iv.第二阴离子膜的使用，如Sartobind Q，所述第二阴离子膜具体用于进一步的 DNA削减；v.脂质包膜病毒的基于化学方法的失活步骤，特别是如EP-A-131 740中描述的 使用磷酸三正丁酯和Triton X-100的溶剂/洗涤剂失活；vi.基于在酵母中表达的蛋白质配体的亲和树脂；如VlIIklect或阴离子多模态色谱树脂，如Capto Adhere ；vii.使用约20nm的平均孔径的病原体过滤移除步骤，例如使用Planova 20N ；viii.阴离子交换树脂，如 Q Sepharose FF;ix.尺寸排除色谱树脂，如Superdex 200pg。具体而言，在本发明的方法中，阳离子交换步骤的洗脱条件基于Ca2+-离子，浓度 在0. 15-0. 25M的范围内并且25°C下洗脱缓冲液的总电导率不增加25mS/cm。如果采用本发明的方法，则在最终提纯步骤之后获得的产品的纯度> 4000IU/ mg蛋白质，优选> 9000IU/mg蛋白质，并且更优选> 10000IU/mg蛋白质，并且DNA污染物 < 1000pg/1000IU FVIII，优选< 100pg/1000IUFVIII，更优选< 10pg/1000IU FVIII。因此，本发明还涉及组合物，所述组合物包含可通过本发明的方法获得的提纯的 重组FVIII (不添加或使用任何人类或动物添加剂，例如白蛋白或基于单克隆抗体的免疫 亲和配体)。附录1表示本发明方法的流程图，其中在多模态树脂上进行捕获步骤。通过加 入盐来处理细胞悬液，分离细胞然后优选在Q膜上进行DNA削减步骤。所述Q膜(例如 Sartorious公司的Sartobind Q)是强碱性阴离子交换器，其具有作为阴离子交换基团的 季铵基团。在特定的PH值和电导率范围内，所述Q膜与特定的DNA结合，而产物(和宿主 细胞蛋白质)保留在通过的液流中。与常规离子交换柱色谱法相反，带电配体与膜支撑体 结合，这提高了生产率并且易于使用。捕获步骤包括使用多模态树脂的本发明的方法。在 捕获步骤之后用阳离子交换器SP Sepharose FF (GE HealtCare公司)进行分离，然后在Q 膜上进行进一步DNA削减。进行例如在EP-A-131740中公开的通过溶剂洗涤剂法(S/D法) 进行的病毒失活处理，并用例如VIII klect 亲和树脂进行进一步提纯。在阴离子交换柱 上，例如在Q Sepharose FF (GE HealtCare公司)上进行进一步浓缩/精制步骤。然后在 凝胶过滤柱(例如Superdex 200p. g. (GE HealtCare公司))上处理浓缩的产品，从而交 换缓冲液并移除潜在的聚集体和片段。收集所得产物，所得产物为GF洗出液。在实施例中 更详细地对各步骤进行解释。附录2和附录3表示备选的实施方案，其中用多模态色谱，Capto Adhere (GE HealtCare公司)代替如在附录1中描述的具体亲和步骤(VIIIkleCtTM(GE HealtCare公 司))。出乎意料地，如在附录2中所描述的提纯顺序达到与在附录1中描述的提纯顺序(包 括基于特定抗体的亲和步骤)相同的纯度。如附录3中所述，使用相同的起始物重复了这 一结果。这表明，根据本发明，使用多模态提纯技术一次以上(在捕获步骤，Capto MMC (GE HealtCare公司)中和在附录2和附录3中所描述的用Capto Adhere (GE HealtCare公 司)的其他后阶段提纯中)潜力巨大，所述多模态提纯技术使用特定的FVIII洗脱条件。通过以下非限定性实施例进一步描述本发明。
实施例在全部实施例中，M(摩尔)的实际值是mol/Kg(即，将10克盐加入到1000克水 中，而不是向10克盐加水至IOOOmL)实施例1 含有FVIII的细胞悬液的制备。细胞
8
所使用的细胞系是人类胚胎肾细胞四3 (HEK 293)的衍生物，所述细胞系适于无 血清生长。在强启动子的控制下，用携带B-结构域剔除的人类FVIII基因的表达盒稳定地 转染该宿主，HEK 293F(EP-A-1739179)。培养方法在常用仪器中根据本领域熟知的常用方法将细胞在无血清基质中培养，例 如以分批形式、间歇形式、灌注形式或连续恒化器培养形式在烧瓶、震荡瓶和生物反 应器(一次性系统和常规搅拌罐)中的进行震荡或搅拌培养(Freshney，R 1(2000)， Culture of animal cells :a manual of basic technique，4th ed, Wiley-Liss ；Spier, R E ed(2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York ；Enfors, S-O and Haggstrom, L (2000)， Bioprocess technology fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm5Vinci, V A and Parekh, S R(2003), Handbook of industrial cell culture :mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA) 0典型地，使用基质的灌注来提高细胞数量和产物效价， 产物效价超过标准批次培养水平。产物收率和宿主细胞蛋白质的量随培养模式变化-产物浓度通常随着细胞数量的增加而增加-总蛋白质含量和DNA含量通常随着细胞数量的增加而增加
-总蛋白质含量和DNA含量也可以随着培养时间的增加而增加-分批培养积累蛋白质和DNA；不从外部加入任何物质，也不移除任何物质-灌注过程将代谢物、蛋白质、DNA和其他杂质从细胞培养物中洗掉；通常使用过滤器或细胞离心机来保留细胞。由于重组产物与细胞有关，因此细胞悬液就是收取物。所述收取物的性质(上述 的产物效价和杂质)根据采用的培养模式而变化。实施例2 制备无细胞FVIII起始物用于色谱提纯的无细胞FVIII起始物获得如下。向根据实施例1制备的细胞悬 液中加入氯化钠和氯化钙的原液，使最终浓度分别为0. 3M和30mM，使25°C下电导率为 30-40mS/cm。将溶液混合约30分钟，通过离心将细胞移除之后进行过滤步骤，以除去任何 残留的细胞碎片(以防止以下色谱柱步骤的堵塞)。实施例3 多模态阳离子树脂Capto MMC的洗脱条件进行下面一系列试验来比较多模态阳离子树脂Capto MMC的不同洗脱条件。实施例3a，对从Capto MMC树脂中洗脱FVIII的不同盐浓度和pH值的评价(参考例)。代谱柱和树脂在C10/20色谱柱(1色谱柱的体积(CV) =8mL)中将Capto MMC树脂填充至IOcm 的滤层高度。所述Capto MMC树脂购自GE Healthcare公司(商品目录号17-5317)。起始物使用的起始物是按照实施例2中的描述所获得的含有rFVIII的蛋白质溶液。平衡缓冲液0. OlM 的 L-组氨酸，0. OlM 的 CaCl2,0.3M 的 NaCl，0.02% (w/w)的聚山梨酯 80， pH 值 7. 0，25°C下电导率 31 士3mS/cm。
使用平衡缓冲液平衡色谱柱，然后以5mL/min的流量填充起始物。在这些缓冲条 件下FVIII与树脂结合(在通过液流中检测不到FVIII)。然后使树脂经历表1中描述的不 同洗脱条件并用FVIII:C法分析从色谱柱中洗出的FVIII的量，并计算为相对于FVIII使 用量的％。表 权利要求
1.一种使用色谱法提纯或浓缩凝固FVIII的方法，包括以下步骤-在具有高离子强度的水溶液中提供含有FVIII的级分；-使所述含有FVIII的级分与多模态树脂接触；-任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附了 FVIII的多模态树脂；-用水性洗脱缓冲液洗脱含有FVIII的级分，所述水性洗脱缓冲液包含至少一种在pH 值6至8的条件下带正电的氨基酸；以及-任选地收集提纯形式的或浓缩形式的含有FVIII的级分。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多模态树脂包含与基体结合的基团，并且所 述基团可以在水性环境中通过离子相互作用和诸如氢键和疏水作用的其他相互作用来与 FVIII相互作用。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，所述FVIII是重组FVIII，特 别是B-结构域剔除FVIII。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述水性溶液包含在高盐溶液 中的FVIII，所述高盐溶液在25°C下的电导率为约25至约200mS/cm。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在pH值6至8的条件下带正 电的所述氨基酸选自含氨基的氨基酸及其组合，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸的，所述氨基酸 特别是浓度为> 0. 4M，特别是> 0. 5M。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗脱液还包含至少一种含有羟基的有 机化合物，如醇；至少一种含有氨基的有机化合物，如氨基酸；至少一种Ca2+离子源；至少一 种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐；至少一种非离子洗涤剂；以及至少一种将PH 值调节为约6至约8的缓冲物质，特别是将pH值调节至约中性值的缓冲物质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述醇选自甲醇、丙醇、乙二醇和丙二醇；所 述Ca2+离子源是CaCl2 ；所述无机盐选自KCl和NaCl ；所述非离子洗涤剂选自Tween 20、 Tween 80和Pluronic F68 ；所述缓冲物质选自pH值在6至8之间的柠檬酸钠、组氨酸、 HEPES、MES禾口乙酸钠。
8.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，将所述清洗缓冲液应用于所述 多模态树脂，来在FVIII被释放之前清洗掉污染物并保留FVIII。
9.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，“多模态”色谱树脂包含以下 基团中的至少一种a.带正电的N-苄基-N甲基乙醇胺配体，b.带负电的2-苯甲酰胺基丁酸配体，c.苯基丙基配体，d.正己基配体，e.4-巯基-乙基-吡啶配体，f.3- ((3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)苯基)-氨基)-苯甲酸配体或其纟口口。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，多模态”色谱树脂选自以下市 售的树脂HEP Hypercel 、PPA Hypercel 、Capto Adhere 、Capto MMC 、MEP Hypercel 。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，多模态色谱法步骤与FVIII亲和色谱法步骤组合，其中通过基于在酵母中表达的蛋白质的配体提供亲和力。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，提纯顺序还包括病原体移 除/失活步骤，所述病原体移除/失活步骤包括基于化学法的失活步骤、基于尺寸的移除步 骤、色谱法步骤或其结合，这些步骤基于待移除的病原体的生理性质。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，提纯顺序还包括以下步骤i.阴离子膜，如SartobindQ，特别是用于DNA削减;ii.阳离子多模态树脂，如CaptoMMC ；iii.阳离子交换树脂，如SPSepharose FF;iv.阴离子膜，如SartobindQ，特别是用于进一步DNA削减；v.基于化学方法的脂质包膜病毒失活步骤，所述失活步骤特别是使用磷酸三正丁酯和 Triton X-100的溶剂/洗涤剂失活；vi.基于诸如VIIIklect的蛋白质配体的亲和树脂，所述VIIIklect配体由在酵母中 表达的抗体片段或阴离子多模态色谱树脂如Capto Adhere组成；vii.使用约20nm的平均孔径的病原体过滤移除步骤，如使用Plan0va20N ；viii.阳离子交换树脂，如QSepharose FF;ix.尺寸排除色谱树脂，如Superdex200pg。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换步骤中FVIII的洗脱条 件基于Ca，所述Ca浓度在0. 15M-0. 25M的范围内，25°C下洗脱缓冲液的总电导率不超过 25mS/cm。
15.如权利要求13和/或14所述的方法，其特征在于，在最后提纯步骤之后的纯度> 4000IU/mg蛋白质，优选> 9000IU/mg蛋白质，更优选> 10000IU/mg蛋白质，并且DNA含量 < 1000pg/1000IU FVIII，优选< 100pg/1000IU FVIII，更优选< 10pg/1000IU FVIIIo
16.一种包含提纯的重组FVIII的组合物，所述重组FVIII可通过根据权利要求1至 15中任一项所述的方法来获得。
全文摘要
本发明提供一种使用色谱法的提纯或浓缩凝固FVIII的方法，包括以下步骤在具有高离子强度的水性溶液中提供含有FVIII的级分；使所述含有FVIII的级分与多模态树脂接触；任选地用水性清洗缓冲液清洗吸附了FVIII的多模态树脂；用水性洗脱缓冲液洗脱含有FVIII的级分，所述洗脱缓冲液包含至少一种在pH值6至8的条件下带正电的氨基酸；以及任选地收集提纯形式的或浓缩形式的含有FVIII的级分。
文档编号C07K14/755GK102066417SQ200980123974
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者乌尔里卡·埃里克松, 卡里恩·博里瓦尔, 古斯塔夫·吉尔加姆, 斯特凡·温厄, 麦特斯·耶恩贝里 申请人:奥克塔法马股份有限公司