利用ToF－SIMS的细胞代谢产物的直接检测方法

专利名称：利用ToF－SIMS的细胞代谢产物的直接检测方法
技术领域：
本发明是微生物学领域。更具体地说，本发明涉及通过时间飞行质谱检测细胞产物的方法。
背景技术：
目前，对于筛选具有不同的或期望的特征的那些个体的生物样品或标本、和突变体或基因表达文库有很多不同的技术。大多数操作要求将样品、标本或文库生长的个体菌落从培养皿取出到微量滴定皿形式，然后温育一段时间让生长，接着是重要的样品处理和制备，所有这些都在分析步骤之前进行。当要分析很多个体时，这些步骤是不期望的。对于在大量样品筛选中使用，已经开发出要求较少样品制备的分析方法。
WO 00/48004描述了用于很多样品高通量筛选的质谱样品筛选方法的改进方法。该方法去除了柱分离步骤，而该步骤是在通过使用例如加入挥发性缓冲剂，有机溶剂，或离子交换树脂这样的方法纯化感兴趣的成分而将样品注射到质谱仪中之前一般所必须的。另外，通过接触固体载体能纯化成分。然而，该方法仍然要求在分析之前进行一些感兴趣成分的纯化，然后将纯化的样品注射到质谱仪中。
US 5914245描述了在筛选方法中去除样品成分纯化步骤。在该方法中，对基质上的细胞微菌落光学监测一段时间光学可检测信号的变化。光学可检测信号来自细胞与光学信号底物的接触，由光学信号底物通过酶促反应产生光学可检测信号。随时间进行的光学可检测信号的监测允许表征微生物菌落产生的酶的活性。在该方法中，细胞可以被溶解并渗透，使光学信号底物接触细胞成分。尽管通过这种方法确实去除了分析之前的样品纯化步骤，但其局限性在于分析是以光学检测为基础，这使得该方法仅适用于对于要分析的酶可获得具有合适的吸光度或荧光性质的光学底物的情况。
在US 6472163中，通过使用不同类型的作为基底的微孔膜改进了US 5914245的方法，容易操作并且具有化学抗性。另外的改进包括更好的温度控制，更致密的照明系统，和对于直接和间接测定或双测定使用不同的指示剂。存在的缺陷是所有的测定都通过吸光度或荧光技术监测。
Braun等(Anal.Chem.(1999)713318-3324)描述了使用高密度阵列样品形式的飞行时间第二离子质谱(ToF-SIMS)检测有机分子。在该方法中，将样品注射到硅纳米小瓶中，将其提供给飞升至皮升样品体积分析，化合物浓度是×10-2至1×10-4摩尔，可检测渺摩尔至飞摩尔量的分子。当映射手段仅通过一级离子束光栅时要求这种方法，其将视野范围限制在小于1000×1000μm2。因此，在高通量微型化检测系统中使用极端灵敏能力的ToF-SIMS检测方法，然而只能分析含有纯化合物的溶液。因此，所描述的这种检测系统适用于要求在分析之前将飞升转移到一列小分析室中的简单溶液。扩展到筛选微生物样品仍然要求培养时间和相当的样品操作，将大量复合物和/或过滤的溶液转移到阵列中。
在此之前，在很多类型的生物样品的分析中使用过ToF-SIMS分析技术，所有这些都要求在将样品放置到ToF-SIMS仪器中之前的样品制备操作。ToF-SIMS可分析的生物样品类型包括从纯化蛋白质制备的肽(Jabs和Assmann；Journal of Chromatography(1987)414(2)323-333)，与金属表面结合的蛋白质和其他细胞成分(Michel等，Languir(2002)18(8)3281-3287；Sjoevall等，Analytical Chemistry(2003)75(14)3429-3434)，冻干制剂中的微生物细胞壁(Tyler等，Proceedings of the International Conference on Secondary Ion MassSpectrometry，12th，(2000)pp 943-946，编辑Benninghoven，Alfred，出版Elsevier Science B.V.，Amsterdam，Neth.)，冷冻破碎之后的模型磷脂膜(Cannon等，Journal of the American Chemical Society(2000)，122(4)603-610)，冷冻破碎的和冷冻水合的脂质体和血红细胞(Pacholski等，Rapid Communications in Mass Spectrometry(1998)，12(181232-1235)，冷冻破碎的和冷冻水合的草履虫(Colliyer等，Analytical Chemistry(1997)，69(13)2225-2231)，和分级分离细胞中的放射性同位素标记的化合物(Glassgen等，PesticideBiochemistry and Physiology(1999)，63(2)97-113)。
上文所述所有的方法和生物样品类型在从大量样品筛选鉴定稀少的期望的样品方面具有局限性，因为有样品操作和/或检测过程。因此，为了解决问题开发直接分析各个生物体而不用样品操作和制备并且没有对吸光度和荧光技术的限制的方法。
申请人通过开发针对完整微生物使用时间飞行第二质谱(ToF-SIMS)的快速而有效的方法解决了所述问题。利用该方法，通过表面分析表征各种生物体来筛选加入到ToF-SIMS仪器中时是完整的生物体的生物样品。各种生物体在膜表面上生长，或者转移到膜表面，使得它们形成阵列。此外，可以原位处理完整生物体阵列并且直接加入到ToF-SIMS仪器中。利用该方法能快速筛选混合的微生物种群阵列，鉴定具有不同细胞内含物的各种微生物。因此，这种方法提供了对鉴定各种感兴趣的个体而筛选大量生物标本的可利用的方法的实质性改进。
发明概述本发明提供利用ToF-SIMS检测生物有机体差异的方法。在一个实施方案中，在真空适合载体上提供生物体，以导入ToF-SIMS仪器中。在第二个实施方案中，生物体在真空适合载体上形成阵列，并且在放入ToF-SIMS仪器中时生物体是完整的。在第三个实施方案中，在初级培养基中生长的生物体阵列接触次级培养基，产生ToF-SIMS可检测产物。在第四个实施方案中，生物体阵列接触一种物质，产生ToF-SIMS可检测产物。对生物体阵列映射，校正阵列中的个体的ToF-SIMS数据。生物体阵列可以复制，提供与活样品相关的被测样品。
因此，本发明提供一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供生物有机体组成的菌落，其中菌落的生物有机体产生ToF-SIMS可检测的产物；b)对(a)的菌落进行ToF-SIMS分析，得到数据；和c)将(a)的菌落与(b)的数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供以二维阵列存在的生物有机体的混合种群，其中至少一种生物有机体产生ToF-SIMS可检测的产物；b)对(a)的生物体阵列进行ToF-SIMS分析，得到数据；和c)对所述阵列进行映射，其中为每个生物体提供在阵列上的独特位置；d)鉴定阵列上存在ToF-SIMS可检测产物的至少一个位置；和e)将(c)的独特生物体位置与所述数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物体。
类似地，本发明提供一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供以二维阵列存在的生物有机体的混合种群，其中至少一种生物有机体产生一级产物；b)在一级产物反应生成ToF-SIMS可检测的产物的条件下，(a)的阵列接触一种物质；c)对(a)的生物体阵列进行ToF-SIMS分析，得到数据；d)对所述阵列映射，其中对各个生物体提供在阵列上的独特位置；e)鉴定阵列上存在ToF-SIMS可检测产物的至少一个位置；和f)将(d)的独特生物体位置与所述数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供以二维阵列存在的生物有机体的混合种群；b)将阵列转移到二级培养基中，其中在二级培养基上培养的至少一种生物有机体产生ToF-SIMS可检测产物；c)对(a)的生物体阵列进行ToF-SIMS分析，得到ToF-SIMS数据；d)对所述阵列映射，其中对各个生物体提供在阵列上的独特位置；e)鉴定阵列上存在ToF-SIMS可检测产物的至少一个位置；和f)将(d)的独特生物体位置与所述数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物体。
附图简述和序列描述

图1A，1B，1C，和1D给出从白色的供给X-Gal的大肠杆菌菌落(A，C)和蓝色的供给X-Gal的大肠杆菌菌落获得的正(A，B)和负(C，D)ToF-SIMS谱图。
图2给出根据各种菌落样品的位置坐标对栅格作图，各组菌落数据的靛蓝色衍生物的ToF-SIMS正分子二级离子特征的强度与总的二级离子输出(yield)之比的灰白衡量图。
图3A和3B显示对从供给X-Gal的大肠杆菌菌落获得的组合的正和负ToF-SIMS数据的主要成分分析和多元曲线解析的结果。A给出计算机处理过的图谱和特征的空间分布共同特征；和B靛蓝色产物。
图4A和B给出X-Gal培养大肠杆菌菌落的ToF-SIMS负二级离子图，其中使用金Au1和Au3离子束。
图5A，B，和C给出菌落阵列的各个像素ToF-SIMS质谱数据的具体峰强产生的空间分布图。A氯的分布；B[磷酸根+酰胺/CNO]二级离子的分布；C溴加靛蓝分子二级离子的分布。
图6给出给水(A，C)或苯丙氨酸(B，D)6小时(A，B)或24小时(C，D)之后大肠杆菌的负ToF-SIMS数据图7A，B，和C给出对从pEtal和pET-24d大肠杆菌的混合物的11个菌落获得的正和负ToF-SIMS数据进行的主要成分分析和多元曲线解析的结果。A各个菌落中因子1和因子2的浓度；B计算机处理过的与因子1、因子2相关的正ToF-SIMS谱；C计算机处理过的与因子1、因子2相关的负ToF-SIMS谱。
图8给出大肠杆菌β-半乳糖苷酶/MUG样品的ToF-SIMS数据产生的主要成分得分图。
图9给出大肠杆菌β-半乳糖苷酶/NPG样品的ToF-SIMS数据产生的主要成分得分图。
图10给出对从大肠杆菌β-半乳糖苷酶+反应物样品获得的ToF-SIMS数据进行主要成分分析和多元曲线解析的结果。所示是数据分析形成的5个因子的每一个的浓度和计算机图谱。
图11A-D显示来自菌落阵列的各个像素的ToF-SIMS质谱数据的特异峰强度产生的空间分布图。三个图板显示来自两种不同菌落类型(Q，Q+4)的混合物的磷酸根图(11A)，图的比例(m/z 279)/(m/z281)图(11B)，和图的比例(m/z 281)/(m/z 279)(11C)。图D给出图11A的图上″A″和″B″指示的两种不同类型菌落(Q，Q+4)构成的像素的负二级离子图谱。
图12给出从Yarrowia菌落的ToF-SIMS数据分析产生的主要成分1和主要成分2的位置图和图谱。
图13给出负ToF-SIMS数据Supor上生长的Q+4菌落和进行皂化步骤后Supor上的Q+4菌落。
下面的序列符合37C.F.R.1.821-1.825(″包含核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请公开要求-序列规律″)，并且符合国际知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)，以及EPO和PCT的序列表要求(Rules5.2和49.5(a-bis)，和行政指令208章和附件C)。核苷酸和氨基酸序列数据使用的符号和格式遵守37C.F.R.1.822中提出的规则。
SEQ ID NO1所示用于表达四个基因的Q+4 Yarrowia lipolytica菌株的10.3kb DNA片段高山被孢霉(Mortierella alpina)高亲和性PUFA延长酶，高山被孢霉Δ5去饱和酶，异丝水霉(Saprolegniadiclina)Δ17去饱和酶和高山被孢霉Δ6去饱和酶。
发明详述本发明描述利用ToF-SIMS数据收集和分析对微生物内含物进行分析的方法，其中不要求被分析细胞的事先制备，但是在放到ToF-SIMS仪器中时是完整的。本发明进一步描述在真空适合膜上生长的微生物菌落的ToF-SIMS分析，微生物被直接转移到ToF-SIMS仪器。菌落存在于膜上的阵列中，并且利用ToF-SIMS数据的一方面对菌落阵列制图。使用ToF-SIMS数据的其他方面鉴定膜上阵列中菌落之间细胞内含物的差异。先复制菌落阵列使具有期望的或不同的细胞内含物的单个菌落被挽救。通过这种方法能快速筛选大量的各种菌落，例如生物样品或标本中存在的菌落，和突变体或基因表达文库。权利要求书和说明书中可以使用下面的定义。
″飞行时间二级离子质谱″缩写为ToF-SIMS。
术语″ToF-SIMS可检测产物″意思是通过飞行时间二级离子质谱检测方法能检测的任何化合物或物质。ToF-SIMS可检测产物可以是从提供的反应物产生的已知的具体化合物或者从细胞中存在的反应物产生的已知的具体化合物。另外，ToF-SIMS可检测产物可以不是所定义的，但是能引起相比较的样品之间ToF-SIMS数据差异。
″ToF-SIMS筛选″指使用ToF-SIMS仪器从样品收集数据的方法。
″ToF-SIMS分析″包括从ToF-SIMS仪器收集数据，另外，处理这个数据，得到表征被分析样品的信息。ToF-SIMS分析可以包括主要成分分析(PCA)和多元曲线解析(MCR)。
″混合种群″或″混合的细胞种群″是包括多种类型个体的生物细胞种群。个体是由于细胞内含物的差异是不同类型的。混合种群可以包括多种生物菌株，突变体种群，或者个体之间存在差异的其他种群。
关于基片上生物有机体的取向使用时，术语″阵列″意思是生物体的二维分布，其中保持生物体的空间取向。
″光栅″意思是控制跨越样品区域的像素阵列的ToF-SIMS仪器的一级离子束，或者根据跨越样品区域的像素阵列在(静止的)一级离子束下移动样品。
术语″真空适合载体″指能经得起非常低的大气压而不损坏的材料组成的表面或膜。另外，真空适合载体必须是其上可以以保持生物体空间完整性的方式放置生物有机体阵列的膜。合适的材料包括但不限于纸材料，和聚合物材料，例如尼龙，硝基纤维素，聚醚砜，聚砜类，聚碳酸酯，聚苯乙烯和硅/二氧化硅，和玻璃碳。
ToF-SIMS数据的一个“方面”是整个ToF-SIMS数据的一部分，其本身提供一组能用来表征被分析样品的信息。
″对阵列进行映射″意思是提供给阵列中的各个个体提供确定的位置。所谓确定的位置称作部位，能以映射图来表示。ToF-SIMS数据可以与各个部位相关联，从而与制图阵列中的每个个体相关联。
″化学计量方法″指用来使化学系统上进行的测量与系统的状态相关联的数学或统计学方法。化学计量方法用来将复杂的数据组去卷积以表征采集数据的样品。化学计量方法的例子包括主要成分分析(PCA)和多元曲线解析(MCR)。
″一级产物″是其本身能转变成，或者能将反应物转化为ToF-SIMS可检测产物的一种物质。
通过与另一种物质接触可以转化一级产物，例如通过酸解或碱解对细胞成分的转化。是酶的一级产物可以对反应物起作用，产生ToF-SIMS可检测产物。
术语″脂肪酸″指大约C12-C22不同链长的长链脂肪酸(链烷酸)(虽然较长和较短链长酸都是已知的)。优选的链长在C16和C22之间。脂肪酸的结构通过简单的符号″X:Y″表示，其中X是碳原子总数，而Y是双键数目。
术语″嵌合基因″指包含下面的任何基因1.)DNA序列，包括自然界没有发现在一起的调控序列和编码序列；或者2.)编码自然界没有连接的蛋白质部分的序列；或者，3.)自然界没有连接的启动子部分。因此，嵌合基因可以包括从不同来源得到的调控序列和编码序列，或者包括从相同来源得到的但是以和自然界发现的不同的方式排列的调控序列和编码序列。″转化″指外来基因转移到宿主生物体的基因组中。
″启动子″指核苷酸序列，通常是编码序列的上游(5′)，其通过提供对RNA聚合酶和适当转录所要求的其他因子的识别来控制编码序列的表达。″启动子″包括最小启动子，它是由TATA-盒和用来指定转录起始位点的其他序列构成的短的DNA序列，其连接控制表达的调控元件。″启动子″还指包括最小启动子加能控制mRNA或功能RNA表达的调控元件的核苷酸序列。
″转录终止子″指位于编码序列下游的3′非编码调控序列。这包括聚腺苷酸化识别序列和能影响mRNA加工或基因表达的其他序列编码调控信号。聚腺苷酸化信号通常特征在于影响向mRNA前体的3′端加聚腺苷酸序列。3′区能影响转录，RNA加工或稳定性，或者相关编码序列的翻译(例如靶基因等)。
这里使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，并且描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，NY(1989)(下文称作″Maniatis″)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，冷泉港实验出版社，冷泉港，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience(1987)出版。
飞行时间二级离子质谱(ToF-SIMS)在ToF-SIMS方法中，高能(8-25kV)，低电流(纳安培DC，脉冲皮安培)，脉冲一级离子束轰击材料表面。顶部单层(10-20埃)产生带正电荷和带负电荷二级离子。质谱仪分析和检测这些二级离子。质谱得到表面成分和结构的信息。本发明第一次将表面轰击分析应用于在ToF-SIMS仪器中放置时是完整的细胞。
在″静态″SIMS情状中，低的一级离子束流和随机束光栅确保在获得的时间过程中对没有受损的表面取样。这与″动态″SIMS相反，动态SIMS中使用一级离子束从表面打溅出/移出材料并且获得作为深度函数的数据。在静态SIMS中，能检测高质量分子二级离子，而在动态SIMS中，分子信息被破坏，只可获得基本的或低质量的分子信息。静态SIMS情况对于本发明是最有用的，因为获得的高质量分子信息能鉴别细胞中的很多产物，其中差异能用来区分细胞。
用于二级离子分析和检测的质谱类型包括四极质谱仪，扇形磁场质谱仪，和飞行时间质谱仪。四极质谱仪受到质量范围(一般小于2000m/z)和质量分辨率(一般围绕单位质量分辨率)的限制。扇形磁场质谱仪提供非常高的质量分辨率，但是需要具体协调为感兴趣的质量范围。为了扫描整个质量范围，必须对四极和扇形磁场质谱仪技术情报中心扫描。时间飞行质谱仪提供不依赖质量并且基本上平行检测质量的二级离子较高的转移，因为在微秒期内收集全部质量范围。按照依赖于质量的穿越没有场的飞行轨道需要的时间将离子分开。对于有机材料的静态SIMS分析，为了限制离子束损害，其分析时间必须短暂，时间飞行质谱仪是选择的质谱仪。
单独利用时间飞行原理只产生500(m/dm)左右的中等质量分辨率。这是因为从具有显著能量分布的样品发射二级离子。目前有两种不同类型的对SIMS使用的时间飞行质谱仪几何学，其使用不同的能量聚焦方法。这些是已知的离子反射器型和三极聚焦扇形型。虽然这里包括的实施例使用离子反射器型ToF-SIMS仪器，预期三极聚焦扇形型提供相同的结果，因此能用来实施本发明。对于两种类型的时间飞行质谱仪，一定要切换提取器的极性来收集带正电荷或带负电荷的二级离子。因此，分别收集获得″正ToF-SIMS″光谱，涉及来自带正电荷的二级离子的信号，和″负ToF-SIMS″光谱，涉及来自带负电荷的二级离子的信号。
本发明使用的膜中存在的绝缘材料例如陶瓷或聚合物的ToF-SIMS分析产生的问题是样品充电。一级离子束典型地带正电荷，绝缘样品也立即获得正电荷。如果没有补偿，这种充电将影响将二级离子提取到光谱计中。使用电子流枪补偿样品上带有的电荷。
如果使用时间飞行质谱仪，为了确定起始时间，一级离子束必须是脉冲的。绝缘材料分析的典型责任周期从一级离子束脉冲开始，接着是打开二级离子提取电压的时间。关闭提取电压，然后接通电子流枪。感兴趣的最高质量二级离子达到检测器的一段时间之后(典型地在100-200微秒)，另一个责任周期开始。
ToF-SIMS使用的一级离子源包括惰性气体(氩气，氙气)，铯，氧，五氟化硅和六氟化硅，和所谓″液体金属″，例如镓，铟和金。对于其中扫描一级离子束的映射实验，因为这些光源的强度/亮度而要求液体金属离子源，即使聚焦到亚微米大小时也是如此。最近开发了金源，它提供用增强的高质量二级离子信号映射的能力，因为这种信号随着一级离子的质量而增大。用这种光源可使用Au-1，Au-2，和Au-3。新的一级离子源，包括新的多原子一级离子源，处在不断开发当中。本发明可使用任何可获得的光源，其中使用铯，镓或Au-1作为一级离子源的光源是优选的。
ToF-SIMS是半定量技术。因为本发明中结合了电离作用和解吸附作用的物理现象，根据化学环境或者所谓″矩阵效应″得到二级离子。但是，通过使用峰面积之比有可能从一系列相关的样品获得半定量或相对信息(″更多″对″更少″或者与测量/终端使用性质相关联)。感兴趣的峰下面的面积(例如，已知的添加物或产物的分子二级离子)与作为参照的选择的峰下的面积相比。作为一个例子，通过将一系列Mylar*PET样品的m/z 147(C3H9SiO-C2H6Si+)的硅油峰面积与m/z104(C6H4CO+)的PET峰面积之比进行比较，可以获得MylarPET膜表面上硅油污染的相对量度。如果没有清楚的参照峰存在或者是已知的，则能使用对于那个谱图相同的总的正二级离子或负二级离子输出或者其部分作为参照。这种使用ToF-SIMS数据中的比例作为区分不同性质的样品的基础的方法对于本领域技术人员是公知的并且用于实施例2证明的本发明的实施中，其中靛蓝分子离子面积与总的正二级离子输出之比被用作被分析菌落数目的靛蓝产生的相对量度。
利用化学计量法能进一步评价ToF-SIMS数据。根据B.M.Wise和N.B.Gallagher在PLSToolbox参考手册(PLS Toolbox Version 2.0，1998版权，Eigenvector Research，Inc.，Manson，WA，page 31)″化学计量法是对化学系统进行的通过应用数学或统计学方法来陈述系统的相对测量科学″定义的，ToF-SIMS数据是多元的；″多元″描述每个样品的很多变量量度组成的数据。ToF-SIMS映射数据情况下，每个质量轨道可以认为是一个变量，对于映射阵列中的每一个像素收集这些很多变量的强度。ToF-SIMS的另一个多元性质是存在构成总的正或负ToF-SIMS谱的来自不同化学物质的多光谱图案。
SIMS技术中固有的两个因素使得使用对于本领域技术人员是公知的多元统计学技术，例如在SIMS数据解释和扩展中有帮助的主要成分分析(PCA)和多元曲线解析(MCR)。另一个因素是，不像其他涉及质谱的分析技术，例如GC-MS(气相色谱-质谱)，在二级离子进入质谱仪之前没有物质的分离。质谱数据是表面上共同存在的所有物质的二级离子图案的卷积，很多低质量碳氢化合物峰是属类的或者是很多物种共同的。第二个因素是，在其中表面范围扫描一级离子束的映射实验中，聚焦点中电流浓度引起带电荷和束受损较高发生率。最终结果是对于这种模式中获得的质谱数据低得多的信号噪音。
典型映射实验中，在跨越分析区域的256×256像素阵列的每一个像素获得ToF-SIMS谱数据。主要成分分析采纳这组65536图谱，并且试图第一次探究数据中什么构成差异，并且就成功捕获较小量的这种差异的主要成分重新归纳数据。在这样做时，PCA是本质上归在一起的具有相同图谱图案的像素。如较早指出的，能在分开的数据运行中获得正ToF-SIMS和负ToF-SIMS映射数据。通过主要成分分析可以分别分析负和正映射数据，或者，如果能实现正数据和负数据之间的像素记录，可以将图谱混合成一组来分析。
主要成分分析的结果依赖于数据的前期处理。使用中心平均值(mean-centered)数据是本领域技术人员常见的做法。在取中心平均值中，从那列的每一表列值减去代表所有像素的一个特定质量波道的强度的每列的平均值。另外，对于这里描述的所有的实施例使用主要成分分析，在取中心平均值之前将这组像素图谱(对于256×256阵列是65536)标准化。这一般意思是如实施例所指出的对总的离子输出或总的离子输出子集标准化。
多元曲线解析是将很多有贡献的因素的复杂体分离成各个因素的分开数据的一个途径。PCA输出可以用作进一步将ToF-SIMS数据还原为关于具体化学物质的信息的MCR的起始点。本领域技术人员熟悉这些技术，如PLS_Toolbox指导手册(PLS Toolbox，Version 2.0，Eigenvector Research，Inc.，Manson，WA)中讨论的，并且能将该项技术用于本发明的实施。
ToF-SIMS可检测产物ToF-SIMS技术本质要求对于要检测的化学物种按顺序设置一些条件·在极端真空中进行ToF-SIMS(＜1×10-9托压力)。要检测的物种必须是真空-相容的。
·感兴趣的化合物必须在被分析样品最远10-20埃处存在。
·化合物必须产生将其与对总的图谱有贡献的所有其他物种产生的信号区分出来的二级离子峰或者图谱图案。
在这些限制中，存在大量可以用ToF-SIMS检测的物质。可以检测的生物物质包括活细胞的很多成分。一些例子包括但不限于，脂肪酸，蛋白质，碳水化合物，和有机酸。对于利用本发明的方法检测，脂肪酸是优选的化合物，并且可以包括月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，或硬脂酸；油酸，亚油酸，亚麻酸，二-高-γ亚油酸，花生四烯酸，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸(eicosatetraeneoic acid)，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，羟基脂肪酸，过脂肪酸，支链脂肪酸，还有含有脂肪酸成分例如磷脂和磷脂片段、甘油三酯和甘油三酯片段的化合物。
一些细胞成分以它们自然状态不容易进行ToF-SIMS检测，但是可以通过外部提供的物质介导的反应转化为ToF-SIMS可检测产物。例如，可以容易地对细胞进行酸或碱处理，以转化一些细胞成分。一个例子是使用氢氧化钠对三酰基甘油酯和磷脂进行皂化。甲醇和氢氧化钾一起是常见的皂化处理。对于在本发明中使用，单独使用氢氧化钾是优选的皂化处理。在本发明的实施中，可以利用象这些可以用来保持菌落在膜上的菌落完整性的处理。
还有，ToF-SIMS可检测产物可以由活细胞从供给细胞的反应物产生。反应物可以是天然物质，例如氨基酸或各种糖，或者反应物可以特别是设计通过特异细胞过程被转化的合成的化合物。例如，X-Gal(Holt，S.J.，和P.W.Sadler.Proc.Royal Soc.(London)148B495(1958))设计通过β-半乳糖苷酶转化为肉眼可观察的产物。但是，ToF-SIMS能检测如上所述的肉眼不能观察的很多物质。
时间飞行质谱理论上没有质量限制。但是，因为表面的解吸附作用是该过程的部分，对一级离子束影响有有限半径，限制大小，从而限制能被解吸附的二级离子质量。因此，ToF-SIMS可检测产物一般等于或小于8kD。
ToF-SIMS分析的有机物本发明中使用ToF-SIMS分析的生物体包括能用于膜载体并且能放到ToF-SIMS仪器中的任何真核和原核生物体。优选的是将生物体放到膜载体上，使得各个生物体彼此分开。生长成菌落的生物体特别适合实施本发明，并且包括但不限于，酵母物种，例如酵母属，毕赤氏酵母属，和Yarrowia；革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，例如红球菌属，链霉菌属，放线菌，棒状杆菌属，芽孢杆菌属，大肠杆菌，假单胞菌属，沙门氏菌属，和欧文氏菌属。包括的还有真菌，例如青霉菌，镰孢属，曲霉属，束柄霉属，金孢子菌属，木霉属，和链孢霉属。根据上述标准能在培养中生长的真核生物体产生的细胞，包括哺乳动物细胞系和原始培养物，和植物细胞，例如玉米，稻，小麦，大豆，烟草，和拟南芥属细胞也可以用来实施本发明。
用于分析的生物体的样品可以来自环境，临床，食品，实验或其他来源。本发明的ToF-SIMS方法以污染物或病原体细胞中存在的ToF-SIMS可检测区分成分为基础，可以用来鉴别样品中存在的污染物或病原体。优选地，使用ToF-SIMS检测的脂肪酸成分来鉴别存在不同脂肪酸的细菌物种。
真空适合的载体在实施本发明所要求的真空适合载体(例如膜)的选择中，ToF-SIMS技术的真空环境和表面特异性是重要的考虑方面。膜必须适合低压真空环境，并且其必须没有表面活性剂或者其他表面易变试剂或添加剂。还优选，膜适合生物体的生长以及多孔，当放在培养基表面上时膜适合生物体的生长。能使用符合这些要求的任何膜，例如聚醚砜，聚砜，尼龙，聚碳酸酯，或硝基纤维素(用溶剂洗涤去除表面活性剂)的膜。还可以将菌落从培养基或支持生长的膜转移到适合ToF-SIMS仪器的其他类型膜上，例如硅片或玻璃碳板上。硅片应该具有低电阻率并且相当有传导性，取向和参杂剂厚度可以变化，例如具有硼或亚磷，并且是110或111取向。
复制生物体样品保持它们原来空间取向能复制培养基表面上生长的生物体菌落。放置在表面上菌落顶部的滤器或膜会从各个原始菌落摘取一些细胞。当在培养基上放置第二个滤器或膜并且在培养条件下温育时，细胞分裂并且形成原始菌落集合的复制体。从原始菌落集合可以获得任何数目的复制体。可以以相同方法将菌落从一个滤器或膜复制到另一个滤器或膜上。一组生物体的复制使一组维持，而另一组以毁坏的方式进行分析。只要能排列保留的和分析的菌落组的取向，就可以繁殖通过分析具有特异性性质的鉴定的个体。
混合种群中独特的生物体表面上生物体菌落的生长建立个体的空间分布或阵列。当菌落在滤器或膜载体上生长时，它们可以在被转移时保持它们的空间分布。转移到不同的培养基，转移到溶液和转移到实验仪器都对本发明的实施是有用的。
个体阵列保持在混合种群中允许鉴别具有不同特征的特异个体。混合种群可以由特征方面大部分相同的个体，和一种或几种不同个体组成。混合种群可以包含特征多方面不同的不同个体。
筛选种群在涉及诱变，基因改组或者改变生物体的遗传构成的其他方法的项目中利用对混合种群筛选来鉴定个体。鉴定具有期望特征的几个个体，对包含基因改变个体的大的混合种群一般称作文库。对文库中数千甚至上万个个体进行筛选可能是必须的。本发明的方法使快速而有效地筛选直接在它们生长的膜上的个体。在一个实施方案中，直接对膜上的个体进行分析，而不需要将个体转移到微量滴定板或者通过任何处理步骤。在另一个实施方案中，使用能直接对膜使用而不破坏菌落完整性的处理步骤。本发明首次证实ToF-SIMS，它是一种表面分析技术，能从膜载体上生长的菌落直接鉴定细胞成分。
实施例下面的实施例中进一步明确本发明。应该明白，给出这些实施例是指明本发明的优选实施方案，只是详细说明。从上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员能确认本发明的基本特征，并且不脱离本发明的精神和范围，能对本发明进行各种各样的变化和修饰，使其适合各种应用和条件。
一般方法实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的并且描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的“分子克隆实验手册”(Molecular CloningA Laboratory Manual)；冷泉港实验出版社；冷泉港，(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，的“基因融合实验”(Experiments with GeneFusions)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)，和Greene PublishingAssoc.and Wiley-interscience(1987)出版的Ausubel，F.M.等人的，Current Protocols in Molecular Biology。
适合细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域公知的。适合在下面的实施例中使用的技术可以在“一般细菌学方法指南”(Manualof Methods for General Bacteriology)(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，EugeneW.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Philips，编著)，American Society forMicrobiology，Washington，DC.(1994))，或者Thomas D.Brock的“生物技术工业微生物学教科书”(BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology)，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)中查到。细菌细胞维持和生长使用的所有的试剂，限制酶和材料都从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCOLaboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL，(Gaithersburg，MD)，或者Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得，除非另有说明。
缩写的意义如下″sec″意思是秒，″min″意思是分钟，″hr″意思是小时，″d″意思是天，″μL″意思是微升，″mL″意思是毫升，″L″意思是升，″μM″意思是微摩尔，″mM″意思是毫摩尔，″M″意思是摩尔，″mmol″意思是毫摩尔，″μmol″意思是微摩尔，″g″意思是克，″mg″意思是毫克，″μg″意思是微克，″ng″意思是纳克，″U″意思是单位，″μm″意思是微米，″cm″意思是厘米，″mm″意思是毫米，″RPM″意思是每分钟转数，″bp″意思是碱基对，″kb″意思是千碱基对，和m/z意思是质量与电荷之比。
实施例1通过靛蓝检测对表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌的ToF-SIMS鉴定本实施例证明ToF-SIMS从不表达β-半乳糖苷酶的细菌菌落区分表达β-半乳糖苷酶的细菌菌落的能力。它使用一种系统，其能在将反应物(无色5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)转化为产物(蓝色靛蓝衍生物)的那些生物体引起清楚的视觉变化，能立即验证ToF-SIMS数据。该实施例还表明将细菌菌落标本从固体培养基转移到ToF-SIMS仪器的高真空分析室，而同时保持菌落的空间关系的方法。
试验体系编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因是典型组织化学报道基因(Beckwith，J.R.LacThe genetic system.In The Operon.J.H.Miller和W.S.Reznikoff，编著，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1980))。使用各种各样的底物能检测其活性，它们都有通过β-D-糖苷键与从半乳糖释放下来时性质发生改变的部分键连的半乳糖(Wallenfels，K.，和R.Weil.，The Enzymes.，P.D.Boyer，编著，第三版，AcademicNY，7617(1972))。通过X-gal裂解时产生沉淀产物的一种有用的产色底物是吲哚衍生物，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(或″X-gal″；Holt，S.J.，和P.W.Sadler.，Proc.Royal Soc.(伦敦)148B495(1958))。当β-gal裂解X-gal中的糖苷键时，产生可溶的无色吲哚酚单体。接着，2个释放的吲哚酚部分形成二聚体，它被非酶氧化得到非常稳定而且不溶的蓝色化合物卤化靛蓝。因此，当细胞在X-gal存在下生长时，根据存在或不存在靛蓝产物有可能分别区分表达或不表达lacZ的大肠杆菌(通常已知是″蓝/白″筛选)。结构上，重要的要注意X-gal的靛蓝产物保持在大肠杆菌细胞中，因此这种产物不通过细胞膜分泌到周围环境中。
在尼龙膜上的大肠杆菌菌落制备和生长含有～20mL LB琼脂和100μg/mL氨苄青霉素的培养皿上覆盖30μL水中的100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和二甲基甲酰胺中溶解的50μL的20mg/mL X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)，将板开放放置15分钟让表面干燥。在琼脂的表面上放置在聚酯载体上成型的圆形多微孔带正电荷的尼龙66膜，0.45μm孔度(BoehringerMannheim，Mannheim，德国)，在尼龙膜顶部分布pUC18中大肠杆菌K12基因组DNA文库转化的大肠杆菌DH5α培养物。事先测得这种培养物由下面的种群构成其中34％的质粒有DNA插入物，因此培养物的34％的菌落不表达β-半乳糖苷酶，因为基因组DNA插入物阻断pUC18中的lacZ基因((Beckwith，J.R.LacThe genetic system.，The Operon.J.H.Miller和W.S.Reznikoff，编著，冷泉港实验室；冷泉港，NY(1980))。37℃下温育过夜之后，尼龙膜上覆盖～1500个菌落，其中34％是白色，其余的是蓝色。蓝色菌落包含表达β-半乳糖苷酶的细菌，这样能将X-gal转化为易于观察的靛蓝衍生物(Holt，S.J.，和P.W.Sadler.Proc.Royal Soc.(伦敦)148B495(1958))。
菌落放置到ToF-SIMS分析的真空室切下尼龙膜的1cm2切片，去掉培养基，并且通过在膜上拧上钼罩而在不锈钢圆形样品托架(称作″圆盘″)上固定。然后根据厂商说明书将样品放入PHI Model 7200ToF-SIMS仪器(Physical Electronics，Eden Prairie，MN)中。在准备室完成气压下调至＜1×10-5托，然后使用磁性转移棒将样品载物台推进到主分析室，那里压力是＜1×10-7托。
根据光谱学差异证实蓝色对白色菌落的ToF-SIMS检测使用下面的ToF-SIMS条件分别筛选蓝色和白色菌落铯一级离子源，用于电荷补偿的脉冲电子流枪，和离子反射器型光谱仪。各个菌落取样的面积是200×200μm2。检测两个菌落之间的ToF-SIMS光谱学差异。对于蓝色菌落，ToF-SIMS数据表明m/z 486带正电荷和带负电荷二级离子的各个簇(图1B，D)，各个靛蓝衍生物质子注入和去质子分子离子的大小。白色菌落显示m/z 486没有带正电荷或带负电荷二级离子簇(图1A，C)。因此，证实ToF-SIMS鉴定产生特异ToF-SIMS可检测产物X-Gal的吲哚衍生物的生物有机体的能力。
实施例2ToF-SIMS筛选随机排列的细菌菌落的不同方法本实施例描述筛选随机阵列排列的细菌菌落的三种不同方法，基础是1.)由已知菌落位置获得单点图谱；2.)通过扫描一级离子柱映射包含多个菌落的区；和3.)通过在一级离子束下扫描样品载物台映射包含多个菌落的区。利用各个方法，在一个阵列中鉴定产生或不产生ToF-SIMS可检测产物(例如，X-Gal的吲哚衍生物)的大肠杆菌菌落。
通过单点ToF-SIMS分析筛选菌落根据实施例1所述，制备上面覆盖包括蓝色的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌菌落和白色的不表达β-半乳糖苷酶的菌落的大肠杆菌菌落混合物的尼龙膜。根据实施例1所述将膜样品转移到ToF-SIMS仪器中。
通过ToF-SIMS仪器的目视片，以微米为尺度，对膜进行肉眼观察，对12个菌落的每一个(蓝色和白色菌落的混合物)样品载物台同等的物进行测定，并且记录。将样品载物台移动成按顺序的一组坐标，使用实施例1中描述的ToF-SIMS条件，分别对每一个菌落筛选200×200微米2范围。
求以靛蓝衍生物为特征的正分子二级离子强度(如实施例1所述和图1所示)与各菌落数据组总的二级离子输出的比值。将比值翻译成灰阶图，并且根据每一个菌落样品载物台的坐标在栅格上形成图像。
这个菌落阵列格式的ToF-SIMS数据色谱显示六个强白色点，一个次强白色点，和五个几乎不可见的灰色点(图2)。七个白色点指示含有靛蓝衍生物的七个菌落的载物台位置，而五个灰色点指示不含有靛蓝衍生物的菌落，这分别通过菌落是蓝色和白色的肉眼观察颜色而确定。
因此，单点ToF-SIMS分析技术可用于产生特异ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的鉴定。
通过一级离子束扫描和化学计量数据还原通过ToF-SIMS二级离子映射对菌落进行筛选根据实施例1所述，制备上面覆盖包括蓝色的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌菌落和白色的不表达β-半乳糖苷酶的菌落的大肠杆菌菌落混合物的尼龙膜。根据实施例1所述将膜样品转移到ToF-SIMS仪器中。
对包括一个蓝色菌落的一部分和一个白色菌落的一部分的膜的400×400微米2范围进行ToF-SIMS分析。以256×256像素分辨率，以有规律的空间间隔，用脉冲电子流枪补偿电荷，镓一级离子束和离子反射器设计的质谱仪对分析区域进行扫描。在每个象素，制备跨越分析区域的阵列，获得完整表面质谱。
通过扫描一级离子源获得的整个二级离子信号低于使用实施例1描述的方法获得的，这样，使用化学计量数据还原方法来增强图谱对照。首先将数据表从256×256像素剪切至204×256像素(320×400微米2)，使得它概略地含有相等的两个菌落部分。首先将混合的正和负ToF-SIMS像素图谱的52，224结论组标准化(对于正组，对整个正二级离子输出进行标准化；对于负组，对整个负二级离子输出从m/z 50向前进行标准化)。然后对这个数据组取中心平均值，并且用作主要成分分析(PCA)(PLS Toolbox Version 2.0，Eigenvector Research，Inc.，Manson，WA，与MATLAB Version 5.3，The Mathworks，Inc.，Natick，MA.联合)的输入数据。然后将该分析的输出数据带入多元曲线解析程序(PLS Toolbox，MATLAB)。这种处理是本领域技术人员公知的，通过相似谱案将这种处理分成像素组，然后分开图谱成分。出现两个因子。对每一个像素的每一个因子的强度或“浓度”作图，得到空间分布图。一个图所示的是对于两个菌落来说是共同的那些空间特征的空间分布(图3A)。伴随这个图的是对于这些共有特征的经计算机处理过的图谱。第二个图(图3B)显示的是对于一个菌落是独特的光谱特征的空间分布。这些独特光谱特征的峰相应于表达β-半乳糖苷酶菌落中存在的溴和靛蓝分子二级离子。根据其蓝色颜色确认是表达β-半乳糖苷酶菌落的这些特征的菌落。
根据实施例1所述，制备上面覆盖包括蓝色的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌菌落和白色的不表达β-半乳糖苷酶的菌落的大肠杆菌菌落混合物的尼龙膜，但所用膜是Supor聚醚砜膜(Pall-Gellman，AnnArbor，MI)。
使用Au1金一级离子束和Au3金一级离子束，用用于电荷补偿的脉冲的电子流枪，和离子反射器设计的质谱仪(lon-ToF Model ToFIV，lon-ToF GmbH，Muenster，德国)，通过一级离子束扫描，在包括一个蓝色菌落的500×500微米2面积的Supor膜上进行ToF-SIMS分析。对这个数据没有进行化学计量还原。如图4A和B所示，分别对于Au1和Au3，来自金离子束数据的负ToF-SIMS二级离子图谱能直接检测靛蓝。根据所示的，也检测了溴。
因此，通过一级离子束扫描进行映射和化学计量数据还原是有用的用于产生特异的ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的鉴定的ToF-SIMS分析技术。
通过一级离子束下载物台扫描通过ToF-SIMS二级离子映射的菌落筛选根据实施例1所述，制备上面覆盖包括蓝色的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌菌落和白色的不表达β-半乳糖苷酶的菌落的大肠杆菌菌落混合物的尼龙膜，除了膜是Supor聚醚砜膜(Pall-Gellman，Ann Arbor，MI)。根据实施例1所述，将膜样品转移到ToF-SIMS仪器中。
使用用于电荷补偿的脉冲的电子流枪，和离子反射器设计的质谱仪(lon-ToF Model ToF IV，lon-ToF GmbH，Muenster，德国)，通过在金一级离子束下扫描样品载物台，以256×256像素分辨率，对包括多个菌落的20×20毫米2面积的Supor膜进行ToF-SIMS分析。在每个间隔，或象素构成跨越区域的阵列，获得整个表面质谱。然后使用来自各个像素的质谱数据的特异峰的强度制备空间分布图。具体地，使用氯的分布，其跟踪膜载体，制备图5A所示阵列上所有菌落的映射图。每个像素的[磷酸根+酰胺/CNO]二级离子的强度也被用来显示图5B所示所有菌落的位置。溴的分布加靛蓝分子二级离子用来鉴定图5C所示能将X-Gal转化为靛蓝的那些菌落的位置。利用氯(蓝色)+[磷酸根+CNO](红色)或氯(黄色)+[溴+靛蓝](蓝色)的颜色重叠，容易地鉴定各个菌落的类型。这些二级离子图与菌落光学图相比较，证实通过它们的蓝色颜色显示溴和靛蓝分子二级离子的菌落鉴定。
因此，通过一级离子束下扫描载物台进行映射是有用的用于产生特异的ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的鉴定的ToF-SIMS分析技术。
实施例3
表达苯丙氨酸氨裂合酶的大肠杆菌的ToF-SIMS检测这个实施例证明其中产物是水溶性低分子量有机酸的系统的ToF-SIMS检测，能将反应物转化为产物的那些生物体没有看得见的变化。这个实施例还证明即使在没有检测到对产物特异的分子二级离子时也能光谱学区分能产生产物的菌落的方法。
表达苯丙氨酸氨裂合酶的大肠杆菌为了证明表达象β-半乳糖苷酶那样容易检测的酶活性的大肠杆菌的ToF-SIMS检测，我们使用来自根据US6368837所述诱变的类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)的苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)。这种酶具有增强的酪氨酸氨裂合酶(TAL)活性，但是在本实施例中只检测PAL活性。苯丙氨酸；氨裂合酶(PAL)(EC 4.3.1.5)广泛分布于植物(Koukol等，J.Biol.Chem.2362692-2698(1961))，真菌(Bandoni等，Phytochemistry 7205-207(1968))，酵母(Ogata等，Agric.Biol.Chem.31200-206(1967))，和链霉菌属(Emes等，Can.J.Biochem.48613-622(1970))，但是在大肠杆菌或哺乳动物细胞中还没有发现它(Hanson和Havir，The Enzymes，第三版；Boyer，P.，编著；AcademicNew York，1967；pp75-167)。PAL是苯基propanoid代谢的第一种酶并且催化(pro-3S)-氢和-NH3+自L-苯丙氨酸去除生成反式-肉桂酸。在该实施例中比较两个大肠杆菌菌株用pETAL构建体，包含类酵母红冬孢类酵母红冬孢PAL酶(US6368837)的EP18Km-6突变体的编码区的pET-24d质粒(Novagen，Madison，Wisconsin)转化的大肠杆菌BL21(DE3)；和用pET-24d质粒(Novagen，Madison，Wisconsin)转化的大肠杆菌BL21(DE3)，后一个菌株作为没有可检测PAL/TAL活性的对照物。
作为含水培养物的pETAL和pET-24d大肠杆菌的制备和培养对在液体培养基中培养pETAL和pET-24d菌株，用来自甘油原种的菌株接种有25mg/L卡那霉素和1mM IPTG的5mL的LB培养基，并且在300RPM摇动下在38℃下生长过夜。第二天早上，当培养物的O.D.(600nm)达到～2.0时，培养物在10,000RPM下离心10分钟，并且将沉淀物重新悬浮于已经用KOH调节至～pH7的水或4mM苯丙氨酸中。这些混合物进一步在38℃下培养，并且在6小时和24小时取出1mL等份。在用ToF-SIMS和HPLC分析之前在冰上贮存。
放到ToF-SIMS分析的真空室的含水大肠杆菌培养物样品的制备和加入使用Eppendorf吸移管系统，将在有和没有苯丙氨酸下生长了6小时和24小时的pETAL的没有过滤的没有修饰的含水培养物10微升转移到干净的硅圆片上(Virginia Semiconductor，Fredericksburg，VA)。让液滴在空气中蒸发，然后将圆硅片固定在不锈钢圆形″圆盘″上，并且放入PHI Model 7200 ToF-SIMS仪器(Physical Electronics，Eden Prairie，MN)，如前文所述。
来自pETAL含水培养物的肉桂酸产物的ToF-SIMS检测硅片上蒸发的含水培养物液滴的大小是直径5毫米级。使用铯一级离子源，用于电荷补偿的脉冲电子流枪，和离子反射器型光谱仪，对干燥的液滴的200×200微米2范围进行筛选。来自6小时和24小时苯丙氨酸供应培养物的负ToF-SIMS数据显示代表苯丙氨酸的m/z 164处的分子二级离子(图6B，D)，和代表来自苯丙氨酸TAL酶转化产生的肉桂酸产物的m/z 147处的分子二级离子。肉桂酸离子峰相对于苯丙氨酸离子峰的强度，24小时培养物的大于6小时培养物的。没有加入苯丙氨酸的6小时和24小时培养物中没有发现m/z 164或147处的离子(图6A，D)。
来自pETAL含水培养物的内桂酸产物的HPLC检测对重新悬浮于苯丙氨酸并且温育6小时或24小时的pETAL和pET-24d的含水培养物进行HPLC分析，检测肉桂酸产生。将0.1mL的各种含水混合物微量离心10分钟，去除细胞，并且将10微升上清液注入装有Zorbax ODS柱(3微米颗粒，6.2mm×8cm柱子)的Hewlett-Packard型1050HPLC中，用乙腈在水中的线性梯度进行10分钟，两者都含有0.1％甲酸(5％乙腈至80％，10分钟内)。通过紫外吸收检测肉桂酸并且通过与肉桂酸标准物(Sigma Chemical，St.Louis，MO)比较进行定量分析。
pETAL的6小时含水培养物含有0.9mM肉桂酸，24小时样品含有1.6mM。pET-24d培养物的样品都没有检测到肉桂酸。这样，肉桂酸的HPLC检测与6小时和24小时pETAL样品中肉桂酸的ToF-SIMS检测相关联。
Supor聚醚砜膜上pETAL和pET-24d大肠杆菌菌落的制备和培养含有25mg/L卡那霉素的LB琼脂的培养皿(10cm直径)铺上30微升的100mM IPTG，空气风干5分钟后盖上90mm圆形Supor聚醚砜膜。pETAL和pET-24d培养物的甘油原种充分稀释至每个板得到～600个菌落，分别在膜的表面铺上纯的pETAL，纯的pET-24d，和1∶1混合物，在38℃下培养过夜之后，将顶部的各种类型的菌落的膜转移到含有用KOH调节至pH7的4mM苯丙氨酸的琼脂，并且再在38℃下培养24小时。
菌落放置到ToF-SIMS分析的真空室如上所述，切下用于分析的Supor聚醚砜膜的1cm2切片，去掉培养基，并且通过在膜上拧上钼罩而在不锈钢圆形″圆盘″上固定。然后将样品放入PHI Model 7200 ToF-SIMS仪器(Physical Electronics，Eden Prairie，MN)中。
根据光谱学差异证实pETAL对pET-24d菌落的ToF-SIMS差异使用铯一级离子源，用于电荷补偿的脉冲电子流枪，和离子反射器型光谱仪，对有转移给含有苯丙氨酸的培养基的pETAL和pET-24d菌落的混合物的膜筛选到11个菌落。各个菌落取样的面积是200×200μm2。
从聚醚砜膜上生长的pETAL菌落获得的ToF-SIMS光谱中没有发现m/z 147处的肉桂酸负分子二级离子。对正和负ToF-SIMS数据取中心平均值，并且用作主要成分分析(PCA)(PLS Toolbox Version 2.0，Eigenvector Research，Inc.，Manson，WA，与MATLAB Version 5.3，The Mathworks，Inc.，Natick，MA.联合)的输入数据。然后将该分析的输出数据带入多元曲线解析程序(PLS Toolbox，MATLAB)。这种处理是本领域技术人员公知的，鉴定代表光谱数据不同的因子。因子1和因子2显示筛选的11个菌落的不同强度，或“浓度”(图6A)。具体地说，是因子1而不是因子2描述菌落1，5，8，9，和11的不同程度，而因子2而不是因子1描述菌落2，3，4，6，7，和10的不同程度。与这两个因子相关联的计算机处理过的负ToF-SIMS光谱揭示大约150和350m/z之间脂肪酸分布的主要光谱差异(图7B，C)。因此ToF-SIMS数据鉴定两个特征不同的菌落类型。
对在转移到有苯丙氨酸的培养基的分开的聚醚砜膜上生长的pETAL和pET-24d菌落进行相同分析。在采集的数据中，因子2描述pETAL菌落，因子1描述pET-24d菌落。另外，来自pETAL和pET-24d菌落的负ToF-SIMS数据显示因子2和1分别指示的光谱图案。当在膜上以分开的种群生长时，以及以混合的阵列排列的生物体种群生长时，区分出了产生肉桂酸的菌落和不产生肉桂酸的菌落。ToF-SIMS能区分经基因工程处理产生低分子量水溶性产物(肉桂酸)的大肠杆菌之间的差异，即使没有直接检测产物信号。
实施例4大肠杆菌中五种β-半乳糖苷酶-裂解产物的ToF-SIMS检测这个实施例证明以反应物的β-半乳糖苷酶裂解为基础，大肠杆菌合成的产物范围的ToF-SIMS筛选的应用。产物包括由4-甲基umbelliferyl-β-D-吡喃半乳糖苷(MUG)(Sigma，St.Louis，MO)裂解制备的甲基伞形酮(MU)和从2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(2NPG)(Sigma，St.Louis，MO)裂解制备的邻-硝基苯酚(NP)，以及3，4-环己烯oesculetin-β-D-吡喃半乳糖苷的代谢产物(S-Gal；Sigma，St.Louis，MO)，5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-Gal；Sigma，St.Louis，MO)，和X-Gal(Sigma，St.Louis，MO)。MU，NP，和S-Gal产物分子量和对肉桂酸的溶解性相似。还证明了区别表达β-半乳糖苷酶(GAL)的大肠杆菌和不表达GAL的大肠杆菌的能力，不需要提供反应物。
目的在于产生β-半乳糖苷酶产物的Supor聚醚砜膜上大肠杆菌的制备的培养通过获取单一蓝色(GAL+)和单一白色(GAL-)菌落，接种5mL的补充了100微克/毫升氨苄青霉素的液体LB培养基，并且在300RPM摇动下在37℃培养过夜，从实施例1描述的大肠杆菌文库制备表达β-半乳糖苷酶活性(″GAL+″)的大肠杆菌和没有β-半乳糖苷酶活性(″GAL-″)的大肠杆菌的纯的培养物。通过如实施例1所述在LB培养基上用氨苄青霉素，IPTG和X-Gal平板培养，分别验证这些培养物是纯的GAL+或GAL-。GAL+和GAL-培养物分别散布到Supor聚醚砜膜上接触培养基。基本培养基由覆盖有30微升的100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)水溶液的～20mL的有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂组成。对于每一个大肠杆菌菌株，在没有任何反应物的培养基上制备一片膜，在分别含有五种反应物的每一种的培养基上制备一片膜。当加入反应物时，在基本培养基上覆盖40微升溶液，并且空气风干15分钟。X-gal(20mg/mL)，Bluo-Gal(20mg/mL)，MUG(10mg/mL)，和2NPG(50mg/mL)溶解于二甲基甲酰胺。S-Gal(20mg/mL)溶解于水。平板在38℃下温育过夜。
菌落放置到用于ToF-SIMS分析的真空室对于每一个阵列，切下1cm2Supor聚醚砜膜的切片，去掉培养基，并且通过在膜上拧上钼罩而在不锈钢圆形″圆盘″上固定。然后将样品放入PHI Model 7200ToF-SIMS仪器(Physical Electronics，EdenPrairie，MN)中，如前面所描述的。
加入和没有加入MUG或NPG下，有和没有β-半乳糖苷酶的大肠杆菌的ToF-SIMS鉴别使用铯一级离子源，用于电荷补偿的脉冲电子流枪，和离子反射器型光谱仪，对大肠杆菌GAL+-没有反应物，大肠杆菌GAL++MUG，大肠杆菌GAL--没有反应物，和大肠杆菌GAL-+MUG每一个阵列上三个或四个菌落进行筛选。各个菌落取样的面积是200×200μm2。将负ToF-SIMS数据标准化并且取中心平均值，然后用作主要成分分析(PCA)(PLS_Toolbox，Eigenvector Research，Inc.，Manson，WA)的数据组，这是本领域技术人员公知的。
PCA给出每一个样品的每一个主要成分的得分，其代表各个主要成分对于每个样品的重要性。在三维图中对每一个菌落的主要成分#1，2和3的得分作图(图8)。在这个图中，对于每种类型的大肠杆菌和反应物条件的3-4菌落组周围画下一个圆圈。圆圈之间没有重叠，这表明菌落组之间有数据区别。ToF-SIMS区分出-在两者都加入MUG反应物时，从不表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。
-即使没有加入反应物，从不表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。
-从没有加入MUG反应物的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分加入MUG反应物的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。
这样，在存在和不存在MUG反应物情况下，实现从不表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。
用与上面相同的ToF-SIMS条件，对大肠杆菌GAL++NPG，和大肠杆菌GAL-+NPG每一个阵列上的三个或四个菌落进行筛选。这个数据与来自上面的大肠杆菌GAL+-没有反应物，和大肠杆菌GAL--没有反应物的数据组合，并且如上所述进行分析。如上所述对这组数据的主要成分#1，2和3(与上面的主要成分#1，2和3不同)作图(图9)。ToF-SIMS数据区分出-在两者都加入NPG反应物时，从不表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。
-即使没有加入反应物，从不表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。
这样，在存在和不存在NPG反应物情况下，实现从不表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌区分表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌。加入了NPG反应物的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌样品组周围的环与没有加入NPG反应物的表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌样品组周围的环重叠，表明ToF-SIMS在这些菌落类型之间不能区分。这个结果解释为，因为与NPG的β-半乳糖苷酶反应的产物是2-硝基苯酚，它在真空下不稳定，预期其一旦产生就立即被抽吸掉。ToF-SIMS数据的PCA证实这个预期的事实支持ToF-SIMS分析的值。
用上面相同的ToF-SIMS条件，对大肠杆菌GAL++S-Gal，和大肠杆菌GAL++Bluo-Gal，和大肠杆菌GAL++X-Gal每一个阵列上的两个至四个菌落进行筛选。负ToF-SIMS数据与来自上面的大肠杆菌GAL+-没有反应物，和大肠杆菌GAL++MUG，和大肠杆菌GAL++NPG的数据组合，并且如上所述进行分析。将负ToF-SIMS数据标准化并且取中心平均值，然后用作主要成分分析(PCA)和多元曲线解析(MCR)(PLS_Toolbox，Eigenvector Research，Inc.，Manson，WA)的输入数据。这种处理是本领域技术人员公知的，鉴定了与光谱数据中的变量相关的因子。因子1，2，3，4和5揭示筛选的菌落的不同的强度，或″浓度″(图10)。具体地说，因子1描述大肠杆菌GAL+没有反应物和大肠杆菌GAL++NPG型菌落，因子2描述大肠杆菌GAL++MUG型菌落，因子3描述大肠杆菌GAL++Bluo-Gal型菌落，因子4描述大肠杆菌GAL++S-Gal型菌落，和因子5描述大肠杆菌GAL++X-Gal型菌落。与这五个因子相关的负ToF-SIMS计算机处理过的光谱揭示主要光谱学差异(图10)。因此，ToF-SIMS数据鉴定五个特征不同的菌落类型。因子1对大肠杆菌GAL+和大肠杆菌GAL++NPG的描述与上文显示大肠杆菌GAL++NpG和大肠杆菌GAL+没有反应物之间重叠的上述单独从PCA获得的结果相吻合。
产物负分子二级离子检测为加反应物Bluo-Gal，S-Gal和X-Gal表达β-半乳糖苷酶的大肠杆菌的区别提供了基础。具体地说，因子3显示m/z 420左右显著特征，这与Bluo-GAL裂解产物的二聚体的分子量相吻合。因子4显示m/z 231处显著特征，这与S-GAL裂解产物的分子量相吻合。因子5显示m/z 486处显著特征，这与X-GAL裂解产物的二聚体的分子量相吻合。
大肠杆菌GAL++MUG菌落类型的光谱图案容易从其他菌落类型相区分，但是这个光谱图案没有显示MU的分子离子。ToF-SIMS数据提供与MU产生相关的特异光谱图案。这与实施例3中讨论的肉桂酸产生的情况类。
因此证明，通过产物特异性二级离子检测或者通过特异光谱图案识别，ToF-SIMS能筛选大肠杆菌合成的产物的范围。
实施例5在阵列中产生不同的脂肪酸分布的Yarrowia lipolytica菌落的ToF-SIMS检测这个实施例涉及产生不同于野生型Yarrowia产生的脂肪酸分布的经基因工程处理过的Yarrowia lipolytica菌株，这正常情况下要求大量的样品制备和接着通过气相色谱分析来区别。ToF-SIMS方法能以脂肪酸成分差异的检测为基础区分这种菌株和野生型菌株。这个实施例还证明菌落复制物的制备和分析，这是一项通过在突变体收集品筛选中使用的ToF-SIMS而用于筛选生物体收集品的技术。
酵母菌株该实施例中使用的酵母菌株，Yarrowia lipolytica，具有不同的脂肪酸成分，并且每一个都是允许筛选的营养缺陷型。野生型菌株，称作Q，从ATCC获得，保藏登记号是76982。它主要积聚油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)，并且是亮氨酸营养缺陷型(表现型leu-)。通过将亚油酸转化成二十碳五烯酸的四个基因进行转化，从Q得到Q+4菌株(δ6去饱和酶，延伸酶，δ5去饱和酶，δ17去饱和酶)。除了油酸和亚油酸之外，它还积聚10-15％γ亚麻酸(C18:3)，并且是尿嘧啶营养缺陷型(表现型ura-)。
Q+4菌株描述Q+4菌株是野生型Yarrowia lipolytica，ATCC#76982，其用包含包括下面序列的10.3kb DNA片段(SEQID NO1)的pGEM-T easy载体(Promega，Madison，WI)进行转化1)Yarrowia lipolytica URA3基因上游开始的440bp的5′-非-编码DNA序列。
2)包括来自Yarrowia lipolytica基因组的418bp TEF启动子(来自翻译延伸因子基因)(Muller S.，等，Yeast，141267-1283(1998))，包含高山被孢霉(Mortierella alpina)(登记号#AF465281)高亲和性PUFA延伸酶基因的编码区的973bp序列，和179bp XPR2转录终止子(来自胞外蛋白酶基因)的嵌合基因。
3)包括上述TEF启动子，包含高山被孢霉Δ5去饱和酶基因的编码区的1357bp序列，和XPR2转录终止子的嵌合基因。
4)包括Yarrowia LEU2基因的2.25kb序列。
5)包括TEF启动子，已经对于在Yarrowia中表达进行密码子优化的异丝水霉(Saprolegnia diclina)(ATCC&num；#56851)Δ17去饱和酶编码区，和XPR2转录终止子的嵌合基因。
6)包括TEF启动子，高山被孢霉Δ6去饱和酶编码区，和XPR2转录终止子的嵌合基因。
7)来自Yárrowia lipolytica URA3基因的280bp的3′-序列。
菌落板制备/培养在如下制备的基本培养基上生长Q和Q+4Yarrowia基本培养基m(MM)20g/L葡萄糖1.7g/L没有氨基酸或硫酸铵的酵母氮碱1g/L脯氨酸0.1g/L赖氨酸
0.1g/L腺嘌呤将pH调节至6.1。对于固体培养基，加入1.5％琼脂。对于Q亮氨酸营养缺陷型的生长，加入0.1g/L亮氨酸(MML)；Q+4尿嘧啶营养缺陷型的生长，加入0.1g/L尿嘧啶和0.1g/L尿苷(MMU)。允许两种Yarrowia菌株生长的混合培养基含有相同浓度的亮氨酸，尿嘧啶和尿苷(MMUL)。
使用甘油原种制备Q，Q+4，和另外一种菌株的混合培养物。在MMUL培养基上平板培养混合培养物，在30℃下培养两天。然后通过在培养皿顶部盖上一个圆形灭菌Supor200聚醚砜膜，能复制有大约1000个菌落的10厘米直径平板，直到膜完全湿润(发现过滤器匀均变暗)。然后从培养皿上取下这个膜，翻过来，使得接触菌落的一面朝上，然后放在新的MMUL培养基的培养皿上。30℃下温育过夜之后，膜有了菌落形态，这是原来培养板上那些的精确复制物。通过重复该过程制备另外的复制物膜。使用Sanford Sharpie Fine Point Blue永久性标记物在线中标记两个标记物点，指明原始和复制物膜两者被切下的缺口。这个缺口对应于培养基原来平板边缘线的位置，并且有助于后来膜、培养板和ToF-SIMS数据的排列。这个缺口称作径向登记标记。
菌落放置到ToF-SIMS分析的真空室从一个完整的Supor聚醚砜复制物膜去掉培养基，并且通过膜的边缘与支架重叠而固定不锈钢环。然后根据厂商说明书将样品放入lon-ToF Model IV ToF-SIMS仪器(lon-ToF，GmbH，Muenster，德国)中。在准备室完成气压下调至＜5×10-6托，然后使用磁性转移棒将样品载物台推进到主分析室，那里压力是＜5×10-7托。
利用ToF-SIMS成象数据筛选菌落使用金一级离子源，用于电荷补偿的脉冲电子流枪，和离子反射器型光谱仪(Ion-ToF Model IV，Ion-ToF，GmbH，Muenster，德国)，进行菌落筛选。筛选方法描述于实施例2，“通过在一级离子束下的载物台扫描和化学计量数据还原通过ToF-SIMS二级离子映射对菌落筛选”。样品载物台扫描超过20×20毫米2范围，以256×256像素分辨率。在每个大约78×78微米2区域象素获得0-800m/z的整个负二级离子质谱。然后使用每个象素质谱数据的特定峰的峰强来制备空间分布图。
对每一个象素的m/z 63(PO2-)和79(PO3-)磷酸根相关的峰强求和，并且用来对测试范围中所有菌落的位置作图(图10A)，因为磷酸根官能团与细胞膜相关。相应于标记物点的峰强的图与不同颜色的磷酸根图重叠，使得容易登记原来菌落板。从构成各个菌落的一个或多个象素能提取光谱学数据。从图11A磷酸根图中发现的构成不同菌落的象素组提取负ToF-SIMS光谱数据。被测试菌落的数据的脂肪酸区中发现三个不同的光谱学图案(图11A-C)，其中两个描述Q和Q+4菌株的菌落(图11D)。参见图11A-D，上部的字母指示产生图11D所示光谱的菌落，下部数字指示摘取用于身份证明的菌落。注意标记A的菌落与中图标记1的那个相同，标记B的菌落与下图标记16的那个相同。
第三个图案描述混合物中的另一个菌株，这里没有给出。一个光谱学图案在m/z 279和281有峰，分别与亚油酸(C18:2)和油酸(C18:1)脂肪酸相吻合，鉴定该菌落是Q菌株。第二个图案显示的是相对于m/z279强度的m/z 281强度显著增强，还显示在m/z 277有一个峰，指示γ亚麻酸(C18:3)的产生，它鉴定这个菌落是Q+4菌株。
根据光谱学差异，产生对于每一个象素的二级离子强度图，指示那些菌落属于Q，Q+4，和第三个菌株。具体地说，制备磷酸根强度/象素灰阶显示所有菌落的位置；制备m/z 279强度/象素颜色重叠(蓝色)图，求与m/z 281强度/象素的比值，来显示Q菌落的位置；制备m/z 281强度/象素颜色重叠(蓝绿色)图，求与m/z 279强度/象素的比值，来显示Q+4菌落的位置，并且第三光谱学图案也重叠(红色)。这些图使得可以菌落阵列颜色映象为基础鉴定Q和Q+4菌落。
根据上文所述，对这组数据的标准化的取中心平均值的数据进行主要成分分析。图12的上栏和下栏分别显示主要成分l和主要成分2的图位置和光谱。这个数据区别不同类型的Yarrowia菌落。
通过营养筛选/在特定培养基上培养鉴定证实菌落为了追踪上面进行的菌落鉴定，回到琼脂表面上菌落的原来主板，将图11A的影像大小减小至2平方厘米(分析的复制物过滤器的实际大小)，并且透明印刷。在光箱上在菌落原主板下(表面向上)脸朝下放置透明图像，并且通过透明性观察的菌落图像在平板上与菌落看得见地排列。合适的取向对于正确排列是重要的，因为ToF-SIMS扫描的菌落复制物是原来主板的镜像。然后将扫描(镜)像与平板上径向登记标记排列，使用朝向标记的标记物点，移动，直到菌落的图案精确对应于成像。
一旦图案与实际菌落相匹配，利用这个导向从主板摘取代表性菌落，接着证实它们的身份。以上文描述的不同光谱假颜色重叠为基础，主要显示蓝色的菌落被鉴定为Q，并且摘取图1lA中的No.1-12用于测试。类似地，为测试摘取主要绿色的菌落，图1lA中的No.13-18，并且鉴定为Q+4。接着证实摘取的菌落的策略利用菌株不同的营养要求。Q菌株生长要求亮氨酸，Q+4要求尿嘧啶。因此Q只是在MMUL上生长，而不在MMU或MM上生长。Q+4在MMU上生长而不在MM上生长。以鉴定为基础，通过接种到允许生长的培养基上来检测摘取的菌落，使用得到的细胞接种到更带有限制性的培养基上。
1.菌落1-12接种到固体MMUL培养基上。所有这些菌落都生长。然后将得到的细胞接种到MMU和MM培养基上。12个菌落中的10个在MMU或MM上都不生长，证明它们的身份是Q。菌落6在MMU和MM上都生长，提示它不是Q。菌落11在MMU和MM上生长少量不连续的菌落，提示它稍微有污染，但是很有可能是Q。因此ToF-SIMS映象正确鉴定12例中11例Q菌株的菌落。
2.菌落13-18接种到固体MMU培养基上。所有这些菌落都生长。然后将得到的细胞接种到MM培养基上。6个菌落中的4个在MM上不生长，证明它们的身份是Q+4。菌落14在MM上生长，提示它不是Q+4。菌落15在MM上生长少量不连续的菌落，提示它稍微有污染，但是很有可能是Q+4。因此ToF-SIMS映象正确鉴定6例中5例Q+4菌株的菌落。
实施例6在Supor过滤器上皂化之后Yarrowia lipolytica菌落的ToF-SIMS检测这个实施例证明通过增强测量ToF-SIMS可检测产物的能力的处理在过滤器上处理菌落。利用该方法来改变菌落，并且它们的产物是KOH碱-催化的组成型脂质的水解(皂化作用)。当在溶液中进行时，这样的处理得到自由脂肪酸盐。
皂化菌落的制备该实施例中只使用酵母Q+4菌株，Yarrowia lipolytica。用Q+4的甘油原种接种顶部有灭菌Supor200聚醚砜膜的MMU培养基的两个固体培养基板，并且在30℃下培养48小时。
关于皂化操作，从培养基上取出有500个Yarrowia菌落的一个Supor过滤器，空气风干2分钟，然后放到用90％甲醇，10％水，和0.3M KOH的溶液饱和的滤纸吸纸上(2层Whatman No.1，9cm直径)。滤纸事先在甲醇中淋洗干净并且空气风干。将Supor过滤器放到这个吸纸之上不少于1分钟，然后转移到杂交试管(Corning，35mm×100mm)。Supor过滤器附着试管壁。将试管密封并且浸到80℃水浴中。在水浴中1小时之后，取出试管，打开，让过滤器风干后从试管中取出。菌落失去它们大部分的垂直解像力(definition)，显示是有光泽的黄色的点。
菌落放置到ToF-SIMS分析的真空室对于处理过的，以及没有处理过的阵列，切下1cm2Supor聚醚砜膜的切片，去掉培养基，并且用钼罩固定形成不锈钢多样品支架部分。然后将样品放入Ion-ToF Model IV ToF-SIMS仪器(lon-ToF，GmbH，Muenster，德国)，如前面所描述的。
作为皂化程序结果的来自Q+4Yarrowia菌落的负ToF-SIMS二级离子信号的增强使用下面的ToF-SIMS条件分析各个菌落金一级离子源，用于电荷补偿的脉冲电子流枪，和离子反射器型光谱仪。对于没有皂化的样品，各个菌落取样的面积是250×250μm2。对于皂化的样品，各个菌落取样的面积是300×300μm2。分析范围的这种差异是不同菌落大小的结果。
如下测定脂肪酸区中负二级离子信号的增强m/z 250-290的区，包括C16和C18脂肪酸，求其与总的负离子输出的比值。当与没有处理的样品相比较时，对于来自皂化样品的光谱发现该比值增加1.7(图13)。
在另一个实验中，将有Yarrowia菌落的空气风干的Supor过滤器放在用0.3M KOH水溶液饱和的滤纸吸纸上(2层Whatman No.1，9cm直径)，没有甲醇。如上所述将过滤器孵育并分析。单独用KOH处理给出类似于使用KOH和甲醇获得的信号与噪音之比的增强。去除甲醇可能是有益的，因为它降低了溶解的脂肪酸在处理期间从菌落中原始点扩散的可能性。
实施例7(预示)通过脂肪酸成分的ToF-SIMS分析鉴定具体微生物这个实施例证明以测定生物体的脂肪酸分布的ToF-SIMS分析为基础鉴定有特色脂肪酸分布的具体微生物。
背景在各种细菌和真菌表征中利用脂肪酸分析[参见，例如Komagata，K.&Suzuki，K.(1987)，细菌分类学中脂质和细胞壁分析，Methodsin Microbiology，19161-207.；Stead，D.E.，Sellwood，J.E.，Wilson，J.&Viney，l.(1992)，以脂肪酸分布为基础的商业微生物鉴定系统评价，用于快速而精确地鉴定植物致病细菌，Journal of AppliedBiochemistry，72315-321.；和Welch，D.F.(1991)，细胞脂肪酸分析应用，Clinical Microbiology Reviews，4422-438.]。
在某些情况下，特定微生物具有非常有特征的脂肪酸分布，它是那种微生物存在的特征或微生物对特定环境条件的响应。例如，通常在人伤口中发现的Gilardi rod group 1细菌具有有特色的脂肪酸分布(Moss等，Journal of Clinical Microbiology(1993)31689-691)。食物病原体单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)具有不寻常的高组成的某些支链脂肪酸(Moss等，Journal of ClinicalMicrobiology(1993)31689-691)。脂肪酸的提取和通过传统技术象脂肪酸甲酯的气相色谱技术分析繁杂而耗时，尤其是如果对很多样品提取和分析。利用这里给出的方法，对微生物脂肪酸快得多的筛选是可能的。
通过标准方法收集微生物样品并且在Supor聚醚砜膜过滤器上生长成菌落。根据实施例5所述制备菌落阵列复制物，加入径向登记标记和标记物点。将菌落排列的过滤器放到ToF-SIMS仪器中并且如实施例5所述测试。如上所述对标准化、中心平均值的数据进行主要成分分析。利用这种分析鉴定过滤器上菌落中微生物的脂肪酸成分。以各个菌落的脂肪酸成分为基础，确定特定微生物的存在。
序列表<110>E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY<120>利用ToF-SIMS的细胞代谢产物的直接检测方法<130>CL2358 PCT<150>US 60/502151<151>2003-09-11<160>1<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>10328<212>DNA<213>合成的<400>1tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt 60ccccgtatcg gagtgtttat tttttgctca accataccct ggggtgtgtt ctgtggagca120ttctcacttt tggtaaacga cattgcttca agtgcagcgg aatcaaaaag tataaagtgg180gcagcgagta tacctgtaca gactgtaggc gataactcaa tccaattacc ccccacaaca240tgactggcca aactgatctc aagactttat tgaaatcagc aacaccgatt ctcaatgaag300gcacatactt cttctgcaac attcacttga cgcctaaagt tggtgagaaa tggaccgaca360agacatattc tgctatccac ggactgttgc ctgtgtcggt ggctacaata cgtgagtcag420aagggctgac ggtggtggtt cgtacgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca480caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agctcgaaat taaccctcac taaagggaac540aaaagctgga gctccaccgc ggacacaata tctggtcaaa tttcagtttc gttacataaa600tcgttatgtc aaaggagtgt gggaggttaa gagaattatc accggcaaac tatctgttaa660ttgctaggta cctctagacg tccacccggg tcgcttggcg gccgaagagg ccggaatctc720
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权利要求
1.一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供生物有机体组成的菌落，其中菌落的生物有机体产生ToF-SIMS可检测的产物；b)对(a)的菌落进行ToF-SIMS分析，得到数据；c)将(a)的菌落与(b)的数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体。
2.一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供以二维阵列存在的生物有机体的混合种群，其中至少一种生物有机体产生ToF-SIMS可检测的产物；b)对(a)的生物体阵列进行ToF-SIMS分析，得到数据；和c)对所述阵列进行映射，其中为每个生物体提供在阵列上的独特位置；d)鉴定阵列上存在ToF-SIMS可检测产物的至少一个位置；和e)将(c)的独特生物体位置与所述数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物体。
3.一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供以二维阵列存在的生物有机体的混合种群，其中至少一种生物体产生一级产物；b)在一级产物反应生成ToF-SIMS可检测的产物的条件下，将(a)的阵列与一种物质接触；c)对(a)的生物体阵列进行ToF-SIMS分析，得到数据；d)对所述阵列进行映射，其中为每个生物体提供在阵列上的独特位置；e)鉴定阵列上存在ToF-SIMS可检测产物的至少一个位置；和f)将(d)的独特生物体位置与所述数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物体。
4.一种鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物有机体的方法，包括a)在真空适合载体上提供以二维阵列存在的生物有机体的混合种群；b)将阵列转移到二级生长培养基中，其中在二级生长培养基上培养的至少一种生物有机体产生ToF-SIMS可检测产物；c)对(a)的生物体阵列进行ToF-SIMS分析，得到ToF-SIMS数据；d)对所述阵列进行映射，其中为每个生物体提供在阵列上的独特位置；e)鉴定阵列上存在ToF-SIMS可检测产物的至少一个位置；和f)将(d)的独特生物体位置与所述数据相关联，从而鉴定产生ToF-SIMS可检测产物的生物体。
5.根据权利要求2，3或4任一项的方法，其中用ToF-SIMS数据进行所述阵列的所述映射。
6.根据权利要求2，3或4任一项的方法，其中用ToF-SIMS数据进行所述阵列上至少一个位置的鉴定。
7.根据权利要求2，3或4任一项的方法，其中在放到真空适合载体上之前生物体混合种群在一级培养基中以二维阵列培养。
8.根据权利要求1，2，3或4任一项的方法，其中生物有机体选自原核生物和真核生物。
9.根据权利要求8的方法，其中生物有机体是植物细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中生物有机体选自玉米，稻，小麦，大豆，烟草，和拟南芥属。
11.根据权利要求8的方法，其中生物有机体选自酵母和细菌。
12.根据权利要求11的方法，其中生物有机体选自酵母属，毕赤氏酵母属，Yarrowia，红球菌属，链霉菌属，放线菌，棒状杆菌属，芽孢杆菌属，大肠杆菌，假单胞菌属，沙门氏菌属，欧文氏菌属，青霉菌，镰孢属，曲霉属，束柄霉属，金孢子菌属，木霉属，和链孢霉属。
13.根据权利要求1，2，3和4任一项的方法，其中生物体形成菌落。
14.根据权利要求1，2，3和4任一项的方法，其中真空适合载体选自尼龙，硝基纤维素，聚醚砜，聚砜类，聚碳酸酯，聚苯乙烯，硅/二氧化硅，和玻璃碳。
15.根据权利要求1，2，3和4任一项的方法，其中ToF-SIMS可检测产物选自脂肪酸，对-羟基肉桂酸，肉桂酸，β-半乳糖苷酶产物。
16.根据权利要求15的方法，其中脂肪酸选自月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，二-高-γ亚油酸，花生四烯酸，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸，羟基脂肪酸，过脂肪酸，支链脂肪酸，磷脂和磷脂片段，甘油三酯和甘油三酯片段。
17.根据权利要求3的方法，其中释放一级产物，通过皂化过程与反应物反应。
18.根据权利要求17的方法，其中皂化作用是在氢氧化钾存在并且甲醇不存在下进行的。
19.根据权利要求2，3或4任一项的方法，其中通过产生阵列的光学图来提供独特生物体位置以给阵列上的每个生物体分配独特位置。
20.根据权利要求1，2或4任一项的方法，其中ToF-SIMS产物等于或小于8kD。
21.根据权利要求2，3或4任一项的方法，其中ToF-SIMS分析收集跨越阵列维度的二维像素阵列在各个像素处的数据。
22.根据权利要求1，2，3或4任一项的方法，其中ToF-SIMS数据通过化学计量方法再分析。
23.根据权利要求22的方法，其中化学计量方法选自主要成分分析(PCA)和多元曲线解析(MCR)。
全文摘要
公开了一种利用飞行时间二级离子质谱(ToF－SIMS)通过表面分析筛选新的生物物质的快速而有效的方法。该方法依赖事先接触了固体生长培养基的多孔膜上生长的微生物阵列的表面筛选。ToF－SIMS分析分辨产生不同物质的生物体，或者直接作为分子产物，或者间接通过使用多元统计学数据还原技术。该方法与传统微生物筛选方法相比有很多优点，传统方法要求样品制备和用于进行分析的时间。
文档编号G01N23/00GK1777469SQ200480001561
公开日2006年5月24日 申请日期2004年9月9日 优先权日2003年9月11日
发明者D·P·奥基菲, K·G·洛伊德 申请人:纳幕尔杜邦公司