专利名称：核酸,多肽,以及调节细胞凋亡的方法
技术领域：
本发明涉及细胞凋亡-特异性真核生物起始因子-5A (elF-5A)和 脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的核酸及多肽，以及使用 细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS调节细胞凋亡的方法。
背景技术：
细胞凋亡属于基因程序性细胞事件，其特征在于通过明确的形态学 特征，如细胞皱缩，染色质凝聚，核断裂，以及膜起泡。Kerr等(1972) 5八/. Ca/7cer， 26， 239-257; Wyllie等(1980) /"L ， 68， 251-306。它在正常组织发育和内环境稳定方面起着重要的作用， 细胞凋亡程序的缺损被认为会导致从神经变性及自身免疫性疾病到肿 瘤的多种人类疾病。Thompson (1995) i^/e/jce， 267， 1456-1462; Mullauer等(2001) M/"L Aes， 488， 211-231。虽然已经详细描 述过凋亡细胞的形态学特征，但却刚刚开始阐述调节这一过程的分子 途径。被认为在细胞凋亡中发挥重要作用的其中一类蛋白是半胱氨酸蛋 白酶家族，其也被称作天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)， 它似乎是绝大多数细胞凋亡途径所需的。Creagh & Martin (2001) "/oc力e迈.rra/ ;y， 29， 696-701 ; Dales等 (2001) Z7迈/7力0巡a， 41， 247-253。天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶引发细 胞凋亡来应答由于剪切各种细胞蛋白所产生的细胞凋亡刺激物，从而 导致细胞凋亡的典型表现形式，包括细胞皱缩，膜起泡和DNA断裂。 Chang & Yang (2000)析cr^/o人勘人A/o人， 64， 821-846。促细胞凋亡蛋白，如Bax或Bak也可释放天门冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶活化分子，如线粒体细胞色素c，由此通过细胞凋亡促进细 胞死亡而在细胞凋亡途径中发挥重要作用。Martinou & Green (2001) iVa夂Ce"., 2， 63-67; Zou等(1997) Ce/7， 90， 405-413。抗-细胞凋亡蛋白，如Bcl-2，通过拮抗促细胞凋亡蛋白Bax 和Bak的活性而促进细胞存活。Tsujimoto (1998) Ce/2es Ce"s， 3， 697-707; Kroemer (1997) ， 3， 614-620。 Bax:Bcl-2的比例被认为是决定细胞命运的其中一种方式；Bax过量会促进细胞凋 亡，而Bcl-2过量则促进细胞存活。Salomons等(1997) /"L /.71, 959-965; Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Ce" Z/尸e Sc/. ， 55， 64-75。涉及细胞凋亡的其它重要蛋白是由肿瘤抑制基因p53编码的。这种蛋白是调节细胞生长并诱导受损且遗传学上不稳定的细胞的凋亡的 转录因子，据推测这大概是通过上调Bax而达到的。Bold等(1997) 5W^7c" 0/zco/ow， 6， 133-142; Ronen等，1996; Schuler & Green (2001) 5/oc力e迈.So" 7"ra跌，29， 684-688.， Ryan等(2001) Cwrr.//7. 6W/ A/o入，13， 332-337; Z6rnig等(2 001) A/0c力e瓜A/o/ 力". J"a， 1551， F1-F37。描述正在经历凋亡的细胞的不同形态学特征可产生很多用于确定 细胞凋亡开始和发展的方法。可用于其检测的凋亡细胞的其中一个这 类特征是外转酶的活化，它可导致磷脂酰丝氨酸，即一种通常位于质 膜内小叶的磷脂的外在化。Fadok等(1992) /. /迈迈i/;^人，l49， 4029-4035。具有外在化磷脂酰丝氨酸的凋亡细胞可通过使用与荧光染 料偶联的磷脂酰丝氨酸-结合蛋白，即膜联蛋白V染色而检测。在细胞 凋亡过程中发生的特征性DNA断裂可通过使用荧光素-标记的脱氧核苷 酸标记DNA片段的暴露3，-0H末端而检测。与核酸结合的荧光染料， 如Hoescht 33258，可用于检测凋亡细胞中的染色质凝聚以及核断裂。 细胞群中细胞凋亡的程度还可根据细胞提取物中天门冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性程度推断。作为一种遗传学确定的过程，细胞凋亡像任何其它发展程序一样， 也可被突变破坏。据信细胞凋亡途径的改变在很多疾病过程，包括癌 症中发挥着重要的作用。Wyllie等(1980) //zf. C/fo/. ， 68，251-306 ; Thompson (1995) 5We"ce ， 267 ， 1456-1462 ; Sen & D,Incalci (1992)卿"e〃e"， 307， 122-127;McDonnel 1等(1995) 5^迈/z7ars //2 (7s/ cer a/ d A/o/ogy， 6， 53—60。对癌症发生和进展的 调查研究常常集中在细胞增殖。然而，目前细胞凋亡在肿瘤发生方面 发挥的重要作用已经越来越明显。事实上，自从以恒定改变的方式控 制肺瘤细胞凋亡后，现在很多有关细胞凋亡是什么的问题已经通过使用肿瘤模型有所了解。Bold等(1997) 0"co/o^r， 6，133-142。细胞凋亡可通过各种信号在肺瘤发展过程中引发。胞外信号包括生 长或存活因子缺失，低氧和电离辐射。可引发细胞凋亡的内部信号包 括产生不适宜增殖信号的致癌突变，缩短端粒，和DNA损伤。Lowe & Lin (2000) (^rc/aoge/jes/^ 21， 485-495。用于治疗恶性肺瘤的电离辐 射和几乎所有的细胞毒性化疗剂被认为是通过引发内源性细胞凋亡机 理，诸导细胞死亡而发挥作用的。Rowan & Fisher (1997) Zewie迈/a， 11， 457-465; Kerr等(1994) Ca/ cer， 73, 2013-2026; Martin & Schwartz (1997) Aesearc力，9， l一5。有证据表明，在癌症进展的早期，肿瘤细胞对诱导细胞凋亡的试剂 (如电离辐射或化疗药物)较为敏感。然而，由于肿瘤的进展，细胞 会发展对细胞凋亡刺激物的抗性。Naik等 (1996) Ce/7es a/zd "ere/o/ 迈e/z" 10， 2105-2116。这就可解释为什么早期癌症对治疗的 反应比更晚期病变要好。晚期癌症发生对化疗和放疗抗性的能力似乎 与细胞凋亡途径的改变有关，它可限制肿瘤细胞应答细胞凋亡刺激物 的能力。Reed等(1996) /ow77 a7 o/ (7e7/w7ar A/'o7og/， 60， 23— 32; Meyn等(1996) Ca/ cer We"e『s， 15， 119-131;Ha醒n (1997) "/ood， 89， 1845-1853; Reed (1995) rox/co/ow Ze"e"， 82-83， 155-158; Hickman (1996) ^ro拜/ /。wr/7"" Ca/ cer， 32A， 921-926。对化疗的抗性分别与慢性淋巴细胞性白血病 和结肠癌中抗-细胞凋亡基因bcl-2的过量表达和促细胞凋亡bax基 因的缺失或突变有关。肿瘤细胞成功建立播散性转移的能力似乎也与细胞凋亡途径的改 变有关。Bold等(1997) i7/2^/ca/ O/zco/ogy, 6， 133-142。例如， 肿瘤抑制基因p53的突变被认为会在7(^的肿瘤中发生。Evan等(1995) Ce//. 5io人，7， 825-834。灭活p53的突变可限制细 胞诱导凋亡、应答DM损伤、使细胞易受进一步突变的损害的能力。 Ko & Prives (1996) Ce/2es a/ d Z^e/o/ 迈e/^， 10， 1054-1072。
因此，细胞凋亡与肿瘤转化以及转移的发生和进展密切相关，通过 对细胞凋亡途径的更好了解，可利用基因疗法，通过调节细胞凋亡途径而产生癌症治疗的新的有效目标。Bold等 (1997) 57//^/ca/ < /2C"o^y， 6， 133-142。已知脱氧8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸合酶(DHS)以及含有8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸的真核生物翻译起始因子-5A(elF-5A)在很多细 胞过程，包括细胞生长和分化中起着重要的作用。8-羟-2，7，10-三氨 基癸酸， 一种独特的氨基酸，可在所有检验过的真核生物和古细菌中 发现，但在真细菌中却没有发现，elF-5A是唯一已知的、含有8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的蛋白。Park (1988) /. "/oA 67 e瓜，263， 7447-7449; Schiimann & Klink (1989) 柳厶紙ro6/o人，11， 103-107; Bartig等(1990)加fe迈.柳人， 13， 112-116; Gordon等(1987a) /. A/o人C力e迈.，262， 16585-16589。 活性elF-5A是以两个翻译后步骤形成的第一步是利用脱氧8-羟-2,7，10-三氨基癸酸合酶催化，通过使亚精胺的4-氨基丁基部分向前 体elF-5A的特异性赖氨酸的oc-氨基转移而形成脱氧8-羟-2， 7, 10-三 氨基癸酸残基；第二步包括利用脱氧8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸羟化酶 使4-氨基丁基部分羟化，形成8-羟-2， 7, 10-三氨基癸酸。物种之间的elF-5A的氨基酸序列较为保守，而且在elF-5A中的 8-羟-2, 7， 10-三氨基癸酸残基周围存在的氨基酸序列也是严格保守 的，表明这种修饰对于存活而言较为重要。Park等 (1993) "/'o尸acfo"， 4， 95-104。这种假设可进一步由下列观察结果支持， 即迄今为止，在酵母中发现的elF5A同种型的失活，或DHS基因(其 催化它们活化中的第一步)的失活，可阻断细胞分裂。Schnier等 (1991)Ce/厶A/o人，11， 3105-3114; Sasaki等(1996) Ze〃. ， 384 ， 151-154; Park等 (1998) /. "/o入 C力e迈.，273 ， 1677-1683。然而，酵母中eIF-5A蛋白的缺失仅导致总蛋白合成的少 量降低，表明elF-5A是mRNA特定亚型的翻译、而不是蛋白全面合成 所需的。Kang等(1993)，"起始因子elF-5A缺失对细胞增殖及蛋白 合成的著)响"，Tuite， M. (ed.)，户rof e/fl a/ t/7^rgef// g//z reaW， NATO Series H。近来有关结合elF-5A的配体共有高度保 守基序的发现也可支持elF-5A的重要性。Xu&Chen (2001) /. "/o人C力e迈.，276， 2555-2561。此外，人们发现修饰的elF-5A的8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸残基对于特异性结合RNA的序列较为重要，而且结 合不会为核糖核酸酶提供保护。elF-5A的第一个cDNA是由Smit McBride等于1989年从人克隆 的，从那以后，又从各种真核生物，包括酵母菌，大鼠，鸡胚，苜蓿， 和番茄中克隆出elF-5A的cDNA或基因。SmitMcBride等(1989a) /. "/o厶C力e迈.，264， 1578-1583; Schnier等(1991)(酵母菌)；Sano， A. (1995) Imahori， M.等 (eds) ， /W7a迈i"es, "a"'c a"f/67// /ca/ ~ec"， VNU Science Press, The Netherlands, 81-88 (大鼠)； Rinaudo & Park (1992) F，A/. , 6， A453 (鸡胚)；Pay等(1991) "/o厶，17， 927—929 (苜蓿)；Wang等(2001) /. "/o入 (7力e迈.，276， 17541-17549 (番茄)。此外，elF-5A的胞内缺失导致特定mRNA在核中大量积聚，表明 eIF-5A可能涉及特定种类的mRNA从核到胞质的穿梭。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to #o/ecw/ar "/o/og/ o/" f力e 6W7， 8， 426a。摘要第2476， 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。 elF-5A在核孔相关核内丝的积聚及其与通用核输出 受体的相互作用进一步表明，elF-5A是一种核质穿梭蛋白，而不是多 核糖体的成分。Rosorius等(1999) / Ce// 5^/e"ce， 112， 2369-2380。elF-5A mRNA的表达已经在各种人类组织和哺乳动物细胞系中研 究过。例如，在血清剥夺后，通过加入血清，已经在人成纤维细胞中 观察到eIF-5A表达水平的改变。Pang & Chen (1994) /. Ce〃 户Am'o/. ， 160， 531-538。脱氧8-羟-2， 7, IO-三氨基癸酸合酶活性 与年龄有关的降低以及前体eIF-5A的充足已经在衰老的成纤维细胞 中观察到，尽管如此其反映同种型差异改变平均化的可能性并不确 定。Chen & Chen (1997b) /. Ce"户力ys/0/. ， 170， 248-254。研究显示elF-5A可能是病毒蛋白，如人免疫缺陷I型病毒Rev蛋 白和人T细胞白血病I型病毒Rex蛋白的细胞靶。Ruhl等(1993)/. 6W"/0人，123， 1309-1320; Katahira等(1995)/. f7ro入，69， 3125-3133。初步研究表明elF-5A可通过与其它RNA-结合蛋白，如 Rev相互作用而导向于RNA，表明这些病毒蛋白可募集用于病毒RNA加
工的elF-5A。 Liu等(1997) A/o人57^ ah， 6， 166-174。已知脱氧8-羟-2, 7， 10-三氨基癸酸合酶以及elF-5A在重要的细 胞过程，包括细胞生长和衰老中发挥着重要的作用。例如，在植物中 脱氧8-羟-2， 7, 10-三氨基癸酸合酶表达的反义降低使叶子和果实延迟 衰老，表明植物中存在诱导衰老的elF-5A同种型。见W0 01/02592; PCT/US01/44505;美国申请号笫09/909， 796。酵母菌中脱氧8-羟-2， 7, 10-三氨基癸酸合酶或elF-5A基因的失活导致细胞分裂的抑制。 Schnier等(1991) M 厶Ce/人"/o人，11， 3105-3114; Sasaki等 (1996)卿"e〃. ， 384， 151-154; Park等(1998) /. Ao厶C力e迈.， 273， 1677-1683。亚精胺类似物已经成功用于体外抑制脱氧8-羟-2， 7, 10-三氨基癸 酸合酶，并用于体内抑制8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的形成，还伴有蛋 白合成及细胞生长的抑制。Jakus等(1993) /. A/o/. C力e迈.，268， 13151-13159; Park等(1994) / J/o人C力亂，269， 27827—27832。 多胺自身，特别是腐胺和亚精胺，似乎也在细胞增殖和分化方面起着 重要的作用。Tabor & Tabor (1984) J/z肌A/ocAe迈.，53， 749-790; Pegg (1988) Ca/2cer We义，48， 759-774。例如，除非提 供外源性多胺，否则其中的多胺生物合成途径已经被阻断的酵母菌突 变体就不能生长。Cohn等(1980) /. ， 134， 208-213。多胺还显示出可保护细胞使其不被诱导凋亡。例如，胸腺细胞凋亡 已经通过与亚精胺和精胺接触而被阻断，其机理似乎是阻碍内切核酸 酶活化。Desiderio等(1995) Ce// ^oW力Z 27Te八，6， 505-513; Brune等(1991) ^r/;. (7e" Ae义，195， 323-329。此外，外源性多 胺已经显示出可抑制B细胞介导的细胞凋亡以及单细胞寄生物克鲁氏 锥虫的细胞凋亡。Nitta等(2001) Aw〃. (7e// We义，265， 174-183) Piacenza等 (2001)#a〃. ， USA， 98，7301-7 306。此外还观察到低浓度的精胺和亚精胺可减少在新生大鼠正 常发育过程中损失的神经细胞数，并保护脑在脑局部缺血过程中免受 神经元损害。Gilad等(1985) Ara/" Ae义，348， 363-366; Gilad& Gilad (1991) ^f77. ， 111， 349-355。多胺还可抑制植物组织的衰老，即一种程序性细胞死亡形式。亚精胺和腐胺已经显示出可 延迟采摘后的康乃馨花和脱落的小萝卜叶的衰老。￥&1^& Baker (1980) #or"c/e/2ce， 15， 805-806 (康乃馨花)；Altman(1982)户/^/o人 户/a/^. ， 54， 189-193 (脱落的小萝卜叶)。然而在其它研究中，细胞凋亡的诱导已经在应答外源性多胺时观察 到。例如，人乳腺癌细胞系通过诱导细胞凋亡而应答多胺类似物，且 过量腐胺已经显示出可诱导DH23A细胞的凋亡。McCloskey等(1995) (7a/2cer k. ， 55， 3233-3236; Tome等(1997) Ai'oc力e迈./， 328， 847-854。使用多胺进行这些实验的结果全都表明，elF-5A特异性同种型的 存在对于细胞凋亡的诱导起着重要的作用。具体而言，该数据与存在 由DHS活化的elF-5A的细胞凋亡特异性同种型的观点一致。这种DHS 反应需要亚精胺的事实与多胺引起天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶，即一种细胞凋亡相关性蛋白水解的关键执行者的活化的发现一 致。Stefanelli等(2000) A/oc力e迈./. ， 347， 875-880; Stefanelli 等(1999) Z^^yZe〃. ， 451， 95-98。在类似的血管中，多胺合成的 抑制剂可延迟细胞凋亡。Das等(1997) Oz co人， 9， 565-572; Monti等(1998) Z/尸e Jc/. ， 72， 799-806; Ray等(2000) j迈./. 户力"/o人，278， C480-C489j Packham & Cleveland (1994) #0人 A/o厶，14， 5741-5747。外源性多胺既可抑制又可促进细胞凋亡的发现可由下列事实解 释，即根据所用水平的不同，它们或者抑制导致elF-5A活化的DHS反 应，并因此阻碍细胞凋亡，或者由于毒性诱导细胞凋亡。低浓度外源 性多胺阻断植物和动物系统细胞凋亡的发现与低浓度多胺及其类似物 作为DHS反应的竟争性抑制剂的事实一致。事实上，甚至是作为DHS 反应底物的外源性亚精胺也会通过底物抑制而阻碍反应。Jakus等 (1993) /. "/o厶(7力e/z . ， 268， 13153-13159。然而，所有多胺及其类似物在高浓度时都是有毒的，并且能够诱导 细胞凋亡。尽管它们具有抑制elF-5A的推定细胞凋亡-特异性同种型 的能力，但该过程发生还有两个原因。第一，活化elF-5A具有长半衰 期。Torrelio等 (1987) A/oc力e迈，"/o/7力ys. Co迈迈z//7. ， 145，1335-13化Dou & Chen (1990) A/oc力/瓜A/。M^. ， 1036，128-137。因此，由于抑制脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶活性而 导致的活化的细胞凋亡特异性elF-5A的缺失可能不能及时发生，以阻
断由亚精胺毒性作用引起的细胞凋亡。第二，多胺是脱氧8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸反应的竟争性抑制剂，因此即使在毒性浓度下，也不能完 全阻断该反应。本发明涉及elF-5A cDNA的克隆，其在诱导细胞凋亡之前即时上 调。这种细胞凋亡-特异性elF-5A很可能是干预引起疾病状态的细胞 凋亡的适宜目标，因为它似乎可以参与细胞凋亡途径的下游效应子和 转录因子的转录后调节水平发挥作用。具体而言，细胞凋亡-特异性 elF-5A似乎可选择性促进编码细胞凋亡的下游效应子和转录因子的 mRNA从核易位到胞质，它们随后即被翻译。引发细胞凋亡的最终决定似乎会阻止内部和外部促-和抗-细胞凋亡信号之间复杂的相互作用。 Lowe & Lin (2 000) Csrc/zzoge/^es/s, 21， 485—495。通过其促进下 游细胞凋亡效应子和转录因子翻译的能力，与细胞凋亡有关的elF-5A 似乎会打破这些信号之间的平衡，促进细胞凋亡。正如前面所述，已经确立了抗癌试剂可诱导细胞凋亡，而细胞凋亡 途径的改变可减弱药物-i秀导的细胞死亡。Schmitt & Lowe (1999) /. /^f力o/. ， 187， 127-137。例如，4艮多抗癌药物都可上调p53，而且已 经失去p53的肿瘤细胞会发生对这些药物的抗性。然而，如果剂量充 足，几乎所有化疗剂都可诱导独立于p53的细胞凋亡，表明即使在药 物-抗性肿瘤中，细胞凋亡的途径也未被完全阻断。Wal lace-Brodeur & Lowe (1999) (7e〃 M 人Z/Z"e Sc/. ， 55， 64-75。这表明细胞凋亡 elF-5A的诱导，虽然它也许不能校正突变基因，但也许能避开p53-依赖性途径，并通过促进可替代途径而诱导细胞凋亡。与细胞凋亡有关的elF-5A的诱导具有选择性导向于癌细胞的能 力，同时对正常的相邻细胞具有很小的作用或没有作用。这种情况的 出现是因为在肿瘤细胞中表达的促有丝分裂致癌基因可提供正常细胞 中不存在的，特异性mRNA种类形式的细胞凋亡信号。Lowe等(1993) Ce"， 74， 954-967 ; Lowe & Lin (2000) "rc//70^oe"<y， 21， 485-495。例如，野生型p53在p53突变肿瘤细胞中的恢复可直接诱导 细胞调亡，并增加肿瘤细胞系和异种移植物中的药物敏感性(Spitz 等，1996; Badie等，1998)。细胞凋亡-elF-5A的选择性是由介导下游细胞凋亡效应子和转录 因子从核向胞质中易位，从而选择性促进它们的mRNA翻译而产生的。
因此，为使细胞凋亡elF-5A具有作用，这些效应子和转录因子的mRNA 必须被转录。因为这些mRNA在癌细胞，而不是相邻的正常细胞中转录， 因此预期细胞凋亡elF-5A可促进癌细胞凋亡，但若有的话，对正常细 胞的作用极小。因此，具有与细胞凋亡有关的elF-5A的肿瘤细胞凋亡 潜能的恢复可由于肺瘤细胞的选择性导向而降低癌症患者经受的毒性 和副作用。细胞凋亡elF-5A的诱导还具有加强肿瘤细胞对抗癌药物 反应的能力，并由此提高这些试剂抗药物-抗性肿瘤的有效性。如此可 减少达到功效所需的抗癌药物的剂量，并降低对患者的毒性。发明内容本发明提供分离和/或纯化的大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS 的核酸及多肽，以及细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS的反义寡核苷酸 及表达载体。本发明还提供分离和/或纯化的人elF-5A2 (此处也称作 增殖elF-5A )。本发明还提供使用细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS调 节细胞凋亡的方法。
图1描述大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A 3'末端的核苷酸序列及衍 生氨基酸序列。图2描述大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A cDNA 5，末端的核苷酸序列 及衍生氨基酸序列。图3描述大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A全长cDNA的核苷酸序列。图4描述大鼠细胞凋亡-特异性DHS cDM 3，末端的核苷酸序列及衍生氨基酸序列。图5是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A cDNA的全长核苷酸序列 与人elF-5A的核苷酸序列(登记号BC000751或NM_001970， SEQ ID NO: 3)的比对。图6是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A cDM的全长核苷酸序列 与人elF-5A的核苷酸序列(登记号NM_020390， SEQ ID N0M )的比 对。图7是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A cDNA的全长核苷酸序列
与小鼠elF-5A的核苷酸序列(登记号BC003889 )的比对。小鼠的核 苷酸序列(登记号BC003889 )为SEQ ID NO: 5。图8是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A的衍生全长氨基酸序列 与人elF-5A的矛汙生氨基酸序列(登记号BC000751或NM-001970 )的 比对。图9是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A的衍生全长氨基酸序列 与人elF-5A的衍生氨基酸序列(登记号NM—020390 )的比对。图10是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A的衍生全长氨基酸序列 与小鼠elF-5A的衍生氨基酸序列(登记号BC003889 )的比对。图ll是大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDNA的部分核苷酸序列与 人DHS的核苷酸序列(登记号BC000333, SEQ ID NO: 8 )的比对。图12是大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A cDNA的限制性酶切图。图13是部分大鼠细胞凋亡-特异性DNS cDNA的限制性酶切图。 图14是使用大鼠黄体细胞凋亡-特异性elF-5A cDNA的32P-dCTP-标记的3'-末端探测的总RNA的RNA印迹(上图)和溴化乙锭染色的凝胶(下图)。图15是使用大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDM的"P-dCTP-标 记的3，-末端探测的总RNA的RNA印迹(上图)和溴化乙锭染色的凝胶 (下图)。图16描述DNA分梯(laddering)实验，其中超数排卵的大鼠黄 体的细胞凋亡程度是在注射PGF-2 oc后检测的。图17是从细胞凋亡大鼠黄体中分离的基因组DNA的琼脂糖凝胶， 它表示用PGF F-2oc处理大鼠后的DNA分梯。图18描述DNA分梯实验，其中超数排卵的大鼠黄体的分散细胞凋 亡程度是与前列腺素F-2ct (PG F-2ct )接触之前，在使用亚精胺处 理过的大鼠中检测的。图19描述DNA分梯实验，其中超数排卵的大鼠黄体的细胞凋亡程 度是在使用亚精胺和/或PGF-2 a处理过的大鼠中检测的。图20是使用"P-dCTP-标记的部分大鼠黄体细胞凋亡-特异性 elF-5A cDNA探测的大鼠基因组DNA的DNA印迹。图21描述pHM6， 一种哺乳动物表位标记表达载体(RocheMolecular Biochemicals)。图22是诱导细胞凋亡后，使用大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDNA的32P-dCTP-标记的3，-非翻译区探测的从C0S-7细胞中分离的总RNA的RNA印迹(上图)和溴化乙锭染色的凝胶(下图)，其中细胞凋亡是通过血清剥夺诱导的。图23是说明瞬时转染C0S-7细胞过程的流程图。图24是用pHM6转染后，C0S-7细胞中外源蛋白瞬时表达的蛋白质印迹。图25说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，天门冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的增加反映的。图26说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，DNA断 裂的增加反映的。图27说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，核断裂 的增加反映的。图28说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，核断裂 的增加反映的。图29说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，磷脂酰 丝氨酸暴露的增加反映的。图30说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，磷脂酰 丝氨酸暴露的增加反映的。图31说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -特异性elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，核断裂 的增加反映的。图32说明使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A的pHM6，按 有义方向瞬时转染C0S-7细胞时凋亡的增加。图33说明使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A的pHM6，按 有义方向瞬时转染C0S-7细胞时Bel-2的下调。上图是考马斯-蓝染色 的蛋白质印迹；下图是相应的蛋白质印迹。图34是将Bel-2用作探针，使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性 elF-5A的pHM6，按反义方向瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的 蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。图35是将c-Myc用作探针，使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性 elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染的C0S-7细胞的考马斯蓝染色的 蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。图36是将p53用作探针，使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性 elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的 蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。图37是使用抗-[HA]-过氧化物酶探针时，pHM6-全长大鼠细胞凋 亡-特异性elF-5A在C0S-7细胞中表达的考马斯蓝染色的蛋白质印迹 和相应的蛋白质印迹，以及使用p53探针时，pHM6-全长大鼠细胞凋亡 -特异性6^-5人在(:03-7细胞中表达的考马斯蓝染色的蛋白质印迹(上 图)和相应的蛋白质印迹(下图)。图38是从RK0细胞中分离的人elF5A2的序列与人elF5A2的序列 (Genbank登记号XM—113401)的比对。图39是描述瞬时转染后，RKO和RKO-E6中发生细胞凋亡百分比的 图。RKO和RK0-E6细胞是用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬时转染的。 用放线菌素D处理并用pHM6-elF5Al转染的RKO细胞的凋亡相对于用 pHM6-LacZ转染但没用放线菌素D处理的细胞增加了 240%。用放线菌 素D处理并用pHM6-elF5Al转染的RK0-E6细胞的凋亡相对于用 pHM6-LacZ转染但没用放线菌素D处理的细胞增加了 105 % 。图40是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。 RKO细胞是用pHM6-LacZ， pHM6-elF5Al， p腿-elF5A2，或pHM6-截 短的elF5Al瞬时转染的。用pHM6-elF5Al转染的细胞的凋亡相对于用 pHM6-LacZ转染的对照组细胞增加了 25%。但是这种增加对于用 pHM6-elF5A2或pHM6-截短的elF5Al转染的细胞并不明显。图41是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。 RKO细胞或者未被转染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬时转染。 校正转染效率后，用pHM6-elF5Al转染的细胞有60%凋亡。
图42提供瞬时转染后，RK0细胞凋亡的流式细胞术分析结果。RK0 细胞或者未被转染，或者用pHM6-LacZ， pHM6-elF5Al， pHM6-elF5A2， 或pHM6-截短的elF5Al转染。该表描述了经历凋亡的细胞百分比，它 是以每个峰下的面积为基础计算的。校正未转染细胞的背景凋亡和转 染效率之后，有80%用pHM6-elF5Al转染的细胞显示凋亡。用pHM6-LacZ， pHM6-elF5A2或pHM6-截短的elF5Al转染的细胞仅显示背景水 平的凋亡。图43提供蛋白的蛋白质印迹，所述蛋白是从用0. 25[ig/ml放线菌 素D处理O， 3， 7， 24，和48小时的RKO细胞中分离出来的。上图描 述使用抗-p53作为第一抗体的蛋白质印迹。中图描述使用抗-elF5Al 作为第一抗体的蛋白质印迹。下图描述用于抗-elT5Al印迹的薄膜， 所述印迹是在化学发光检测以证实等量加样后，用考马斯蓝染色的。 p53和elF5Al都是通过用放线菌素D处理而上调的。
具体实施方式
本发明部分是以下列发现和特性描述为基础的，即从大鼠黄体中分 离出来的、编码elF-5A的全长cDNA涉及细胞凋亡(细胞凋亡-特异 性)。因此，在其中一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，它 含有编码大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A多肽的核苷酸序列。本发明还 提供一种纯化的多肽，它含有大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A多肽的氨 基酸序列。大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A多肽是指对大鼠特异的任何 多肽，它在凋亡细胞中差异表达，而且是由脱氧8-羟-2，7，10-三氨基 癸酸残基的形成而产生，所述残基的形成是利用脱氧8-羟-2， 7， IO-三 氨基癸酸合酶催化，使亚精胺的4-氨基丁基部分向前体elF-5A的特 异性保守赖氨酸的oc-氨基转移，并利用脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸 酸羟化酶使4-氨基丁基部分轻化形成8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸，由此 活化elF-5A。此外，使用这里提供的指导和本领域那些技术人员熟知的技术，本 发明的大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A的核酸及多肽序列可用于从其它 细胞、组织、器官或动物分离细胞凋亡-特异性核酸及多肽。本发明还 提供适宜作为引物或杂交探针的核酸分子，从而检测编码本发明大鼠 细胞凋亡-特异性elF-5A多肽的核酸。
本发明的核酸可以是DNA， RNA， DNA/RNA双链体，蛋白-核酸 (PNA)，或其衍生物。这里所用的核酸或多肽，当基本上没有细胞物质 或没有化学前体或其它化学品时是"分离的"或"纯化的，，。应认识 到术语分离的或纯化的不指含有许多其它序列片段的文库型制品。本 发明的核酸或多肽可被纯化至均一或其它程度的纯度。纯化水平是以 预期用途为基础的。重要的特征是，即使有大量其它成分存在，制品 也能达到核酸或多肽的预期功能。分离多肽可从天然表达它的细胞纯化，从已被改变从而表达它的细 胞(重组体)纯化，或使用已知的蛋白合成方法合成。例如，蛋白的 重组产生包括将编码诱导细胞凋亡的elF-5A或DHS的核酸分子克隆到 表达载体中。将表达载体引入到宿主细胞中，并使蛋白在宿主细胞中 表达。然后使用标准蛋白纯化技术，通过任何适宜的纯化方案将蛋白 从细胞中分离出来。优选，编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性elF5A多肽的分离的核酸 具有SEQ ID N0: 1的核普酸序列，本发明的纯化的多肽具有SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列。本发明的大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的核酸及多肽 还包括分别与SEQ ID NO: l和SEQ ID NO: 2基本相同或同源的序列， 及其功能衍生物和变体。这里所用的术语"序列基本同一"或"基本同源"用于说明一个序 列与另外一个序列显示出基本相同的结构或功能。基本同 一或基本同 源的序列之间的任何结构或功能差异都是极小的(de巡// /边")；也 就是说，它们不会影响序列在预期应用中发挥作用的能力。差异可能 是由于不同物种之间密码子使用的固有差异，例如，如果两个或多个 不同序列之间存在大量的序列重叠或类似，或如果不同序列即使长度 或结构不同，也仍然显示相似的物理特性，那么结构差异被认为是极 小的。这种特性包括，例如，在规定条件下杂交的能力，或蛋白的免 疫交叉反应性，类似的酶活性等。技术人员可利用本领域已知的方法 很容易地确定各种特性。此外，如果两个核苷酸序列之间具有至少约70%或更高，更优选 80%或更高，甚至更优选约90%或更高，最优选约95%或更高的序列 相似性，那么它们"基本互补"。如果两个氨基酸序列在多肽的活性 或功能相关部分之间具有至少50%,优选至少70%，更优选至少80%,
甚至更优选至少90%，最优选至少95%的相似性，那么它们基本同源。 为了测定两个序列的同 一性百分比，将序列进行用于最佳比较目的 的比对(例如，将空位引入到第 一和第二个氨基酸或核酸序列的其中一 个或两个中进行最佳比对，且为了进行比较，可忽略非-同源性序列)。 在优选实施方案中，将至少30%, 40%, 50%， 60%， 70%， 80%,或90% 或更长的参考序列进行比对。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置 的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被与第二个序列中的 相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置 是相同的(这里所用的氨基酸或核酸"同一性"与氨基酸或核酸"同源 性，，等价)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的 函数，考虑到空位数和每个空位的长度，需要引入它们进行两个序列 的最佳比对。两个序列之间的比较和同一性及相似性百分比的确定可使用数学 算法完成。(Computational Molecular Biology， Lesk， A. M. ， ed.， Oxford University Press ， New York ， 1988 ) Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.， ed. ， Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1， Griffin, A, M. ， and Griffin， IL G.， eds. ， Humana Press, New Jersey, 1994j Sequence Analysis in Molecular Biology, vonHeinje， G. ， Academic Press， 1987j and Sequence Analysis Primer, Gribskov， M. and Devereux， J. ， eds.， M Stockton Press, New York, 1991)。本发明的核酸及蛋白序列可进一步被用作"查询序列"，在序列数 据库中进行检索，从而鉴定其它家族成员或相关序列。这种检索可使 用Altschul，等(1990) /. "/o入215: 403-10的NBLAST和XBLAST程序(2. 0版)进行。BLAST核苷酸检索可使用NBLAST程序进 行。BLAST蛋白检索可使用XBLAST程序进行，从而获得与本发明蛋白 同源的氨基酸序列。为了比较目的而获得有空位的比对，可按照 Altschul等(1997) ^/"eic Jc/" 25 (17): 3389-3402中所述，使用有空位的BLAST。当利用BLAST和有空位的BLAST程序时， 可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST )的缺省参数。术语核酸的"功能衍生物"在这里是指基因或核苷酸序列的同源物
或类似物。功能衍生物可保留已知基因的至少一部分功能，用于本发明中。这里所述细胞凋亡-特异性elF-5A多肽的"功能衍生物"是细 胞凋亡-特异性elF-5A的片段，变体，类似物，或化学衍生物，它们 可保留细胞凋亡-特异性elF-5A的至少一部分活性或与对细胞凋亡-特异性elF-5A特异的抗体的免疫交叉反应性。细胞凋亡-特异性 elF-5A多肽的片段是指分子的任何亚型。功能变体还可包括类似氨基酸的取代，但功能不会发生改变或发生 无关紧要的改变。对于功能而言较为重要的氨基酸可通过本领域已知 的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham等(1989) 5c/e/7ce 244:1081-1085)。后一个过程可将单丙氨酸突变引入到分子 中的每个残基上。然后测试所得突变分子的生物活性，如激酶活性或 体外增殖活性。对于结合配偶体/底物结合较为重要的位点还可通过结 构分析，如结晶，核磁共振或光亲和标记测定(Smith等(1992) /. "/o厶224: 899-904; de Vos等(1992) ^c/e/2ce 255: 306-312)。 "变体"是指与完整基因或其片段基本相似的分子，如具有一个或多个取代核苷酸的核苷酸取代变体，但它仍然维持与特定基因杂交或 编码与天然DNA杂交的mRNA转录物的能力。"同源物"是指来源于不同动物属或种的片段或变体序列。"类似物"是指与整个分子，其变 体，或片段基本相似或有相关功能的非天然分子。变体肽包括天然存在的变体以及利用本领域熟知的方法制造的那 些。这种变体可使用分子技术以及这里公开的序列信息很容易地鉴定/ 制造。此外，可以本发明elF-5A或DHS蛋白的序列和/或结构同源性 为基础，很容易地将这种变体与其它蛋白区别开来。同源性/同一性的 程度主要以蛋白是功能变体还是非功能变体，共生同源物家族的趋异 差异量，以及直向同源物间的进化距离为基础的。本发明的elF-5A或DHS蛋白的非天然存在变体可使用重组技术很 容易地产生。这种变体包括但不限制于蛋白氨基酸序列的缺失，添加 和取代。例如，其中一类取代是保守氨基酸取代。这种取代是用具有 相似特性的其它氨基酸取代蛋白中给定氨基酸的那些。通常所见的保 守取代是将脂族氨基酸Ala， Val， Leu，和lie中的一个替换为另一 个；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺 残基Asn和Gln之间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳族
残基Phe和Tyr之间的替换。有关很可能是表型沉默的氨基酸改变的 指导，见Bowie等，Sc/e/7ce 247: 1306-1310 (1990)。可选择性而且优选地，编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A 多肽的核酸在高度严格条件下，与SEQ ID N0:1的互补核苷酸序列杂 交。这里所用术语"杂交"是指核酸在适宜的严格条件下杂交，根据 探针序列和靶序列性质的不同，所述条件对于本领域那些技术人员而 言是显而易见的。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，根据所需严格程 度的不同，通过改变温育时间，温度，和/或溶液的离子强度而对条件 进行调节是很容易完成的。见，例如，Sambrook， J.等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2版，Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。条件的选择取决于杂交序列的长度，特别是探针序列的长度，核酸 中的相对G-C含量以及所允许的错配数。当需要在互补程度较低的链 之间进行部分杂交时，优选低度严格条件。当需要完全或接近完全互 补时，优选高度严格条件。对于典型的高度严格条件而言，杂交溶液 含有6X S.S.C. ， 0. 01M EDTA， IX Denhardt，s溶液和0-5%SDS。对 于克隆DNA的片段而言，杂交在约68"C时进行约3-4小时，对于总真 核生物DNA而言，进行约12-16小时。对于较低的严格程度而言，杂 交温度降至约42"C，低于双链体的解链温度(Tm)。已知Tm是G-C 含量和双链体长度以及溶液离子强度的函数。这里所用术语与DNA或MA分子的"相应部分杂交"是指杂交分 子，例如，寡核苷酸，多核苷酸，或任一核苷酸序列(按有义或反义 方向)识别并与其它核酸分子序列杂交，其中所述其它核酸分子序列 具有与该核苷酸序列近似相等的大小以及足够的序列相似性，从而在适宜条件下进行杂交。例如，ioo个核苷酸长的有义分子可识别并与核苷酸序列中大约100个核苷酸的部分杂交，只要两个序列之间有大约 70%或更高的序列相似性。应当了解，"相应部分"的大小会造成杂 交中的一些错配，如此"相应部分"可比与它杂交的分子更小或更大， 例如，大或小20-30%，优选至多大或小约12-15%。此外，多肽的功能变体还可包括相似氨基酸的取代，但功能不会发 生改变或发生无关重要的改变。对于功能而言较为重要的氨基酸可通 过本领域已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变 (Cunningham等，^c/e"ce 244: 1081-1085)。后一个过程可将单丙氨 酸突变引入到分子中的每个残基上。然后测试所得突变分子的生物活 性。例如，细胞凋亡-特异性elF-5A的类似物是指与整个蛋白或其片 段基本相似的肽模拟物或非天然蛋白。细胞凋亡-特异性elF-5A的化 学衍生物含有通常不是肽或肽片段一部分的其它化学部分。另外，还 可通过使肽的目标氨基酸残基与有机衍生剂反应而将修饰引入到肽或 其片段中，其中所述有机衍生剂能够与所选择的侧链或末端残基反 应。从大鼠黄体中分离的、编码细胞凋亡-特异性elF-5A的全长cDNA 的最初发现和表征导致编码DHS的部分cDNA克隆的发现和表征，它也 是从大鼠黄体中分离的，并涉及细胞凋亡。因此，在另一实施方案中， 本发明提供一种分离的核酸，它含有编码大鼠细胞凋亡-特异性DHS多 肽的核苷酸序列。本发明还提供一种纯化的多肽，它含有大鼠细胞凋 亡-特异性DHS多肽的氨基酸序列。大鼠细胞凋亡-特异性DHS多肽是 指对大鼠特异的任何适宜多肽，它在凋亡细胞中差异表达，并且通过 使亚精胺的4-氨基丁基部分向失活elF-5A的特定保守赖氨酸的oc-氨 基转移，形成脱氧8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸，由此活化elF-5A而催 化脱氧8-鞋-2， 7, 10-三氨基癸酸残基的形成。优选，编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性DHS多肽的分离的核酸具 有SEQ ID NO: 22的核苷酸序列，本发明的纯化的多肽具有SEQ ID NO: 23 的氨基酸序列。本发明大鼠细胞凋亡-特异性DHS的核酸及多肽还包括 分别与SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23基本同一或同源的序列，和功 能衍生物及其变体，前面已经对它们进行过描述。可选择性而且优选 地，本发明的分离的核酸具有在高度严格条件下，与SEQ ID NO: 22的 互补序列杂交的核苷酸序列，这也已经在前面描述过。就这里所述大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A序列的核酸及多肽而 言，本发明大鼠细胞凋亡-特异性DHS序列的核酸及多肽可用于从其它 动物，包括人类分离细胞凋亡-特异性DHS的核酸及多肽。DHS序列从 动物和人类的这种分离可以物种之间至少80 %的序列相似性为基础， 使用本领域已知的方法和这里提供的指导进行。本发明还提供适于作 为引物或杂交探针的核酸分子，用来检测编码本发明大鼠细胞凋亡-特 异性DHS多肽的核酸。细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS是调节细胞凋亡，包括作为疾病 过程基础的细胞凋亡的适宜靶，这是因为它很可能对涉及细胞凋亡途 径的下游效应子和转录因子的翻译后调节发挥作用。因此，本发明还 提供通过给予细胞一种调节细胞凋亡-特异性elF-5A和/或DHS功能的 试剂而调节细胞凋亡的方法。本领域技术人员应当认识到，所述试剂 可以是仅调节细胞凋亡-特异性elF5A功能的试剂，仅调节细胞凋亡-特异性DHS功能的试剂，或同时调节细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS 功能的试剂。细胞凋亡可通过细胞中凋亡-特异性elF-5A和/或DHS功能的正常 水平的任何适宜改变而调节。正如这里预期的，修饰或改变可以是完 全或部分的，且包括转录或翻译控制的改变或改变细胞中凋亡-特异性 elF-5A和/或DHS功能的其它改变。细胞凋亡-特异性elF-5A或DHS 的功能是指与脱氧8-鞋-2, 7， 10-三氨基癸酸残基的形成有关的任何活 性，所述残基的形成是利用DHS催化，使亚精胺的4-氨基丁基部分向 前体elF-5A的特异性保守赖氨酸的oc-氨基转移，并利用脱氧8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸羟化酶使4-氨基丁基部分羟化形成8-羟-2， 7, 10-三氨基癸酸，由此活化elF-5A。在本发明其中 一个实施方案中，所述试剂可抑制细胞凋亡-特异性 elF-5A和/或DHS的功能，由此抑制细胞凋亡。抑制细胞凋亡是指强 度和/或数量的任何降低，和/或细胞凋亡的任一或所有明确的形态学 特性，如细胞铍，染色质凝聚，核断裂，以及薄膜起泡开始的延迟。能够抑制细胞凋亡-特异性elF-5A和/或DHS功能的其中一种试剂 是反义寡核苷酸。优选，所述反义寡核苷酸具有编码细胞凋亡-特异性 elF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性DHS多肽的一部分的核苷酸序列。 很多编码细胞凋亡-特异性elF-5A多肽和/或DHS多肽的适宜核酸序列 都是本领域已知的。例如，SEQ ID N0S:1， 3， 4， 5， 11， 15， 19， 20，和21(细胞凋亡-特异性elF-5A的核酸序列)，SEQ ID N0S: 6和 8 (细胞凋亡-特异性DHS的核酸序列)，SEQ ID N0S: 12和16 eIF-5A (细 胞凋亡-特异性多肽的序列)，和SEQ ID NO: 7(细胞凋亡-特异性DHS 多肽的序列)，或其一部分，都可提供适宜的序列。其它适宜的序列可 使用已知序列作为探针，按照这里描述的方法找到。
因此，本发明还提供编码细胞凋亡-特异性elF-5A多肽和/或细胞 凋亡-特异性DHS多肽的一部分的反义寡核苷酸，及其互补序列。本发 明的反义寡核苷酸可以是RNA或DNA，例如，cDNA，基因组DNA，或合 成RNA或DNA的形式。DNA可以是双链或单链的，且如果是单链，可 以是编码链或非编码链。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交会妨碍 核酸的正常功能，通常被称作"反义的"。受到妨碍的DNA功能包括 复制和转录。受到妨碍的RNA功能包括所有功能，例如RNA向蛋白翻 译位点的易位，蛋白从RNA的翻译，产生一个或多个mRNA种类的RM 剪接，和涉及或由RNA促进的催化活性。这种反义寡核苷酸的全部作 用是抑制细胞凋亡-特异性elF-5A和/或DHS的表达和/或减少所产生 的活化细胞凋亡-特异性elF-5A的量。可选择性地，细胞凋亡特异性DHS对细胞凋亡-特异性elF-5A的 活化可通过给予抑制DHS酶反应的化学剂抑制。例如，在通过注射 PGF-2a诱导细胞凋亡后，当使用亚精胺， 一种DHS反应的抑制剂处理 动物时，大鼠黄体中反映细胞凋亡的DNA分梯的开始延迟了(图18-19)。 Jakus等，(1993) /. A/o人268: 13151-13159。细胞凋亡还通过加入4吏细胞凋亡-特异性elF-5A的DNA， RNA，或 蛋白降解，或使细胞凋亡-特异性DHS的DNA， RNA，或蛋白降解，由 此防止细胞凋亡-特异性DHS将细胞凋亡-特异性elF-5A活化的试剂而 被抑制或大大降低。在本发明另一实施方案中，内源性哺乳动物细胞 凋亡-特异性DHS，细胞凋亡-特异性elF-5A，或两者表达的抑制是通 过使用核酶进行的。适宜药物的例子包括抑制细胞凋亡-特异性DHS将 细胞凋亡-特异性elF-5A活化的那些，抑制脱氧8-羟-2, 7， 10-三氨基 癸酸羟化酶将细胞凋亡-特异性elF-5A活化的那些，抑制细胞凋亡-特异性DHS的转录和/或翻译的那些，抑制细胞凋亡-特异性脱氧8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸羟化酶的转录和/或翻译的那些，以及抑制细胞 凋亡特异性elF-5A的转录或翻译的那些。抑制细胞凋亡-特异性DHS 将elF-5A活化的药物的例子是亚精胺，1，3-二氨基-丙烷，1，4-二氨 基-丁烷(腐胺)，1，7-二氨基-庚烷，或l，8-二氨基-辛烷。还可通过使细胞中编码细胞凋亡-特异性elF-5A的基因失活而抑 制细胞凋亡-特异性elF-5A。这种失活可通过使细胞中的基因缺失， 或向基因中引入缺失或突变而发生，由此使基因失活而发生。此外， 还可通过将其它DNA片段插入到基因中而使基因失活，如此，内源性 细胞凋亡-特异性elF-5A蛋白的表达就不会发生。同样，可通过使细 胞中编码细胞凋亡-特异性DHS的基因失活而抑制细胞凋亡-特异性 elF-5A的活化。将突变，如缺失和插入引入到真核细胞基因中的方法 是本领域已知的，例如，美国专利号第5, 464, 764。用于进行细胞基 因突变的寡核苷酸及表达载体可按照本领域已知的方法和这里提供的 指导制造；例如，用于制造和表达反义寡核苷酸的方法可用于制造进 行细胞基因突变的寡核苷酸及表达栽体。还可通过抑制细胞中编码细胞凋亡-特异性elF-5A的基因表达而 抑制细胞凋亡-特异性elF-5A的表达。这种失活可通过共抑制完成， 例如，将编码细胞凋亡-特异性elF-5A的核苷酸序列引入到细胞中， 如此进行共抑制。同样，它可经由共抑制，通过抑制细胞中编码细胞 凋亡特异性DHS的基因表达而抑制细胞凋亡特异性elF-5A活化。用于 进行共抑制的寡核苷酸及表达载体可按照本领域已知的方法和这里提 供的指导制造；例如，用于制造和表达反义寡核苷酸的方法可用于制 造进行共抑制的寡核苷酸及表达载体。进行共抑制的方法是本领域已 知的，例如，美国专利号第5， 686， 649。(通过，例如，反义，突变，或共抑制)抑制的其中一个结果是内 源性可翻译的、编码细胞凋亡特异性elF-5A或DHS的mRNA量降低。 因此，所产生的细胞凋亡-特异性DHS蛋白的量降低，由此减少活化 elF-5A的量，从而降低细胞凋亡-特异性蛋白的翻译。因此，细胞凋 亡被抑制或延迟，这是因为蛋白重新合成是细胞凋亡开始所需的。在本发明另 一实施方案中，所述试剂可诱导细胞凋亡-特异性 elF-5A或DHS的功能，由此诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡是指强度或 数量的增加，或细胞凋亡的任一或所有明确的形态学特征，例如，细 胞皱缩，染色质凝聚，核断裂，以及膜起泡开始的加速。可使用任何诱导细胞凋亡-特异性elF-5A和/或DHS功能的适宜试 剂。本领域技术人员可认识到，可给予细胞凋亡-特异性elF-5A的失 活及活性形式。如果给予失活形式，或8-羟-2，7，10-三氨基癸酸-未 修饰形式，那么天然的细胞凋亡-特异性DHS可活化elF-5A。很多编 码细胞凋亡-特异性elF-5A多肽和/或DHS多肽的适宜核酸序列都是本 领域已知的。例如，SEQ ID N0S:1， 3， 4， 5， 11， 15， 19， 20，和 21 (细胞凋亡-特异性elF-5A的核酸序列)，SEQ ID N0S: 6和8 (细胞 凋亡-特异性DHS的核酸序列)，SEQ ID N0S:12和16 elF-5A(细胞凋 亡-特异性多肽的序列)，和SEQ ID N0:7(细胞凋亡-特异性DHS多肽 的序列)，或其一部分，可提供适宜的序列。其它适宜的序列可使用已 知序列作为探针，按照这里所述的方法找到。例如，可将棵露核酸(棵露DNA载体，如寡核苷酸或质粒)，或多 肽，包括重组产生的多肽给予细胞。重组产生的多肽是指将编码eIF-5A或DHS蛋白的DNA序列放入适宜的表达载体中，这将在下面详细描 述。宿主是用表达载体转染的，随后产生所需的多肽。然后从宿主细 胞中分离多肽。诱导重组细胞凋亡的elF-5A蛋白可在中国仓鼠卵巢 (CHO )细胞中制造，并由本领域那些技术人员使用重组DHS活化。Wang 等(2001) /. A/oA (7力e迈.，276， 17541-17549; Eriksson等，(2001) Se迈//7. ^e迈a"/， 38， 24-31。所述多肽还可以是利用已知蛋白合成 方法合成的。多肽摄取可使用配体促进，例如，来源于炭疽的配体，它可介导在 各种细胞中的摄取。Liu等(2001) /. A/o人，276， 46326-46332。此外，还可利用脂质体将重组蛋白给予哺乳动物的靶细胞，组 织，和器官。含蛋白的脂质体是静脉内给予的。可通过将特异性细胞 受体的配体掺入到脂质体中而实现导向。见，例如，Kaneda， y^r"rz^ Z e//P^ry M 43: 197-205 (2000)。可诱导细胞凋亡-特异性elF-5A或DHS功能的其中一种优选试剂 是表达栽体。因此，本发明提供表达载体，它们具有与编码细胞凋亡-特异性elF-5A多肽和/或DHS多肽的核酸可操纵连接的启动子。本发 明的表达载体可以是RNA或DNA，例如，cDNA，基因组DNA，或合成 RNA或DNA的形式。DNA可以是双链或单链的，如果是单链，可以是编 码链或非-编码链。可4吏用任何适宜的表达载体(见，例如，Pouwels 等 ， Cloning Vectors:A Laboratory Manual (Elsevior ， N.Y.: 1985))。优选，表达载体具有与编码细胞凋亡-特异性(相关) elF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性(相关)DHS多肽的核苷酸序列可 操纵连接的启动子序列。在表达载体内，所需核酸与启动子是可操纵连接的，如此启动子才 能驱动核酸的表达。可使用任何适宜的启动子，只要核酸被表达。这
种适宜启动子的例子包括各种病毒启动子，真核启动子，和组成型活 化的启动子。只要维持这种可操纵连接，表达载体就可含有不止一种核酸(例如，编码细胞凋亡-特异性elF-5A和/或DHS的核酸)。表达栽 体可任选含有其它元件，如聚腺苷酸化序列，核糖体进入位点，转录 调节元件(例如，增强子，沉默子等)，用于提高载体或转录物的稳定 性或提高细胞内所需转录物的翻译或加工的其它序列(例如，分泌信 号，前导序列，等)，或任何其它适宜的元件。表达载体可来源于病毒，如腺病毒，腺伴随病毒，疱療病毒，逆转 录病毒或慢病毒。还可将本发明的表达载体转染到宿主细胞中，所述 宿主细胞包括但不限制于，细菌，哺乳动物或昆虫的宿主细胞系统， 包括杆状病毒系统(见，例如，Luckow等，"/o/7"ec力/7o/of ， 6， 47 (1988))，和已经确立的细胞系，如293， C0S-7， C127， 3T3， CH0， HeU， BHK等。优选腺病毒载体，这是因为和质粒及其它病毒载体(例如，单纯性 疱療病毒)不同，腺病毒载体可同时在分裂细胞和未分裂细胞中获得基 因转移，以及蛋白在心血管相关位点，如心肌，血管内皮和骨骼肌中的高水平表达。此外，腺病毒载体可将基因转移到染色体外位置，并 因此很少会出现将转移基因不适当插入到宿主基因组关键位点中的危 险。而且希望腺病毒载体在病毒复制所需的至少一个基因功能方面有 缺陷。优选，腺病毒载体在腺病毒基因组El, E2，和/或E4区的至少 一个重要基因功能方面有缺陷。更优选，载体在腺病毒基因组E3区的 至少一个部分有额外缺陷(例如，E3区的Xbal缺失)。通过简单地向培养基中加入病毒可将重组腺病毒递送给所培养的 细胞。宿主动物/人的感染可通过将病毒颗粒直接注射到血流或预定组 织中获得。病毒在血清中的半衰期可通过使病毒与脂质体(例如 Lipofectin， Life Technologies)或聚乙二醇复合而延长。腺病毒载 体常常通过病毒纤维蛋白隆突结构域和柯萨奇病毒及腺病毒受体CAR 之间的相互作用而进入细胞。病毒载体可通过对病毒进行基因工程改 造，使其表达对特定细胞受体特异的配体，来针对特定的细胞或不表 达CAR的细胞。在可选择性的实施方案中，细胞凋亡可通过使用化学品对内源性细 胞凋亡-特异性elF-5A，或细胞凋亡-特异性DHS，或两者的转录进行 化学上调，或通过化学提高细胞凋亡-特异性elF-5A的活化而引发或 提高。在其中一个实施方案中，将PGF-2a给予动物/人的癌细胞或肿 瘤，从而上调DHS和elF-5A的转录。细胞凋亡-特异性elF-5A是调节细胞凋亡，包括作为疾病过程基 础的细胞凋亡的适宜目标，这是因为它有可能在涉及细胞凋亡途径的 下游效应子和转录因子的转录后调节方面发挥作用。单独或结合进行 的、本发明调节细胞凋亡-特异性elF-5A和细胞凋亡-特异性DHS的方 法可在动物细胞中完成，诱导或提高细胞凋亡，并产生治疗和预防疾 病的新方法及组合物，所述疾病的病因与细胞没有能力经历凋亡有 关。很多重要的人类疾病都是由细胞凋亡控制中的异常而引起。这些异 常可导致细胞(例如，癌细胞)数的病理性增加或细胞损耗(例如， 变性疾病)。作为非限制性的实例，本发明的方法和组合物可用于预 防或治疗下列与细胞凋亡有关的疾病和病症神经病/神经变性疾病 (例如，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，肌萎缩性侧 索硬化(Lou Gehrig氏病)，自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎， 系统性红斑狼疱(SLE)，多发性硬化)，杜兴氏肌性营养不良(DMD),运 动神经元病，局部缺血，慢性心力衰竭，中风，婴儿脊肌萎缩，心搏 停止，肾衰竭，变应性皮炎，脓毒症和脓毒性中风，AIDS,肝炎，青 光眼，糖尿病(1型和2型)，孝喘，色素性视网膜炎，骨质疏松症，异 种移植排斥，和烧伤。本发明的方法可用于治疗带有癌细胞或患有肿瘤的动物，所用的量 分别要足以杀死癌细胞或抑制肿瘤的进展。足以实现该目标的量被定 义为治疗有效的剂量。用于这种用途的有效量取决于疾病的严重程度 和动物自身免疫系统的一般状况。肿瘤生长的抑制是指阻碍或降低肿瘤的进展，例如，肿瘤的生长， 侵入，转移和/或复发。本发明的方法可用于治疗任何适宜的肿瘤，包 括，例如，乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头和颈， 卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾 丸，子宫颈或肝的肿瘤。动物，优选哺乳动物，更优选人，可使用本 发明的组合物和方法治疗。因此，本发明的方法可在体外，离体，或 体内进行。
给药方案还可根据动物的疾病状况和状态而改变，通常每天单次团块给药一次或连续输注或多次给药(例如，每4-6小时)，或根据治 疗和动物的情况而定。然而应当注意的是，本发明不限于任何特定的 剂量。在本发明中，可使用任何适宜的方法或途径给药，例如，口服，静 脉内，腹膜内，皮下，或肌内给药。所给予拮抗剂的剂量取决于多种 因素，包括，例如，所给予分子的类型，所治疗肿瘤的类型和严重程 度，以及给药途径。然而，应当强调的是，本发明不限于任何特定的 给药方法或途径。在其中一个可选择性的实施方案中，本发明的方法可与一种或多种常规疗法联合使用。例如，可使用适宜的抗肿瘤剂，如化疗剂或进行 放疗。在其它可选择性的实施方案中，本发明的方法可与一种或多种 适宜的佐剂联合使用，例如，细胞因子(IL-10和IL-13)或其它免疫刺 激剂。在其它可选择性的实施方案中，与细胞凋亡有关的疾病的诊断可使 用细胞凋亡-特异性elF-5A和增殖elF-5A进行，其与利用不同启动子 从不同位置转录的细胞凋亡-特异性elF-5A不同；尽管两者在结构上 同源，但羧基末端有差异。本发明的诊断方法包括比较给定细胞中增 殖elF-5A的量和同一细胞中细胞凋亡-特异性elF-5A的量。在正常发 挥作用的过程中，细胞具有的增殖elF-5A (这里也称作elF-5A2)的 量要高于细胞凋亡-特异性elF-5A(这里也称作elF-5Al )的量。然而， 在某些癌细胞中，由于正常的调节机理出错，使得细胞凋亡-特异性 elF5A的量相对于增殖elF-5A的量发生了改变。因此该方法可在细胞 发生任何表型改变之前，诊断细胞为癌细胞。在另一实施方案中，增殖elF-5A与细胞凋亡-特异性elF-5A的比 值可用于筛选药物。这种方法还包括比较给定细胞中增殖elF-5A的量 和同一细胞中细胞凋亡-特异性elF-5A的量。将增殖elF-5A与细胞凋 亡-特异性elF-5A的正常比值和细胞与候选药物接触之后，增殖 elF-5A与细胞凋亡-特异性elF-5A的比值进行比较。接触后，增殖 elF-5A与细胞凋亡-特异性elF-5A比值的改变可用于鉴定那些具有细 胞凋亡-调节活性的候选药物。具有细胞凋亡-调节活性的候选药物可 通过抑制或诱导细胞凋亡而用于治疗与细胞凋亡有关的疾病。此外， 增殖elF-5A与细胞凋亡-特异性elF-5A比值的改变可用于调节细胞凋 亡，还可用于治疗这里所述与异常细胞凋亡有关的任何状况。使用该方法可有效筛选很多潜在的候选药物，即候选药物库，从而 鉴定调节细胞凋亡的库成员。任何候选药物或候选药物库都可使用该 方法筛选。例如，已经被确定可以作为细胞凋亡调节剂的生物学反应 修饰物，包括改变信号转导途径的单克隆抗体，细胞因子如TRAIL( Apo2 配体)，视黄酸/类固醇家族核受体的配体，以及结合并抑制蛋白激酶 的小分子化合物都可使用本发明方法来筛选明确的细胞凋亡-调节活 性。其中一种适宜的候选物是蛋白激酶C-a反义寡核苷酸，ISIS 3521 (ISIS Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad, CA)，它具有抗肺 瘤活性。其它具体的特异性候选物包括天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶(IdunPharmaceuticals， San Diego, CA)， 已知它可在导致癌症 和神经变性疾病的各种类型细胞中引发并完成细胞凋亡的方面发挥重 要作用；GENASENSETM(Genta， Inc., Berkeley Heights, NJ)，它是 一种阻断 Bcl-2 产生的反义药物；INGN 241 (Introgen Therapeutics, Inc., Houston, TX)，它是针对p53的基因疗法；利 妥希玛(IDEC Corporation, Osaka, Japan),它是抗-CD20单克隆抗 体；和用于心血管疾病和癌症的通用细胞凋亡驱动疗法(Egera Therapeuticslnc. ， Quebec, Canada)。应当了解，本发明用于动物预防或治疗目的的核酸及多肽可以组合 物的形式给药，所述组合物还含有药学上可接受的载体。适宜的药学 上可接受的载体包括，例如， 一种或多种水，盐水，磷酸盐緩冲盐水， 葡萄糖，甘油，乙醇等，及其组合。药学上可接受的载体还可含有微 量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂，防腐剂或緩冲剂，它们可提高结 合蛋白的保质期或有效性。正如本领域熟知的，还可配制成注射用组 合物，从而在给予哺乳动物后，提供活性成分的快速，持续或延迟释 放。本发明的组合物可以各种形式存在。这些包括，例如，固体，半固 体，和液体剂型，如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液，分散液或混悬液， 脂质体，栓剂，可注射及可输注的溶液。优选形式取决于预定的给药 方式和治疗应用。
这种组合物可按照药物领域熟知的方式制备。在制备组合物时，通 常将活性成分与载体混合，或用载体稀释，和/或包封在载体中，它可 以是胶嚢，小药嚢，纸或其它容器的形式。当载体起稀释剂的作用时， 它可以是固体，半-固体，或液体物质，充当活性成分的媒介物，赋形 剂或介质。因此，所述组合物可以是片剂，锭剂，小药嚢，扁嚢剂，酏剂，混悬液，气溶胶(固体或存在于液体介质中)，含有10重量％活性化合物的软膏剂，软和硬的明胶胶嚢，栓剂，注射液，混悬液，无 菌包装的粉剂和局部贴剂。参考为了进行举例说明而提供的下列实施例，可更容易理解本发明 的一般性描述。提出实施例的目的在于理解本发明，但不是，也不应 被解释为是以任何方式限制本发明的范围。实施例不包括常规方法的 详细描述。这种方法是本领域那些普通技术人员熟知的，并且已经在 很多公开出版物中描述过。常规方法，如构造载体和质粒，将编码多 肽的核酸插入到这种栽体和质粒中，将质粒引入到宿主细胞中，以及 表达并测定其基因和基因产物时所用那些方法的详细描述可从很多公开出版物获得，包括Sambrook， J.等，(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。这里提到的所有参考文献都整体引入。实施例实施例1本实施例可证实编码大鼠elF-5A核酸的全长cDNA的分离和表 征，所述核酸具有细胞凋亡-特异性表达。超炎#伊及义扃## 一勿應源亡W谬, 给未成熟的(21-30日龄)雌性大鼠皮下注射50 IU的PMSG(孕母马 血清促性腺激素)，60-65小时后，注射50 IU的HCG(人绒毛膜促性腺 激素)，使它超数排卵。用HCG处理7天后，皮下注射500mg的PGF-2a，诱导黄体细胞凋亡。用PGF-2a处理后，在不同时间(例如，1, 8， 和24小时)处死大鼠，切除黄体，放在液氮中。对照组的黄体组织是 在进行PGF-2a处理之前，立即处死大鼠获得的。义處#沐勿應^#教超数排卵后6-9天，给大鼠多位点皮下注射500mg PGF-2a。 15-30分钟后，切除超数排卯大鼠的卵巢，放在水上的EBSS (Gibco)中， 吸干并称重。剔除结締组织，用刮刀将卵巢精细切碎，并用BBSS 2X 清洗两次。胶原酶溶液是通过将6.5mg胶原酶(Sigma， Catologue 并C5138)在5ml EBSS中涡旋而制备的。将来源于8个卵巢的切碎的组 织加入到50ml Erlenmeyer烧瓶中的5ml胶原酶EBSS溶液中，并通 过在Diamed移液管中抽取若干次而轻轻搅拌。然后在95%空气，5%C02温育箱上的位置45)。 ' '、 工温育之后，把烧瓶放在水上，用塑料移液管将细胞悬浮液转移到装 配有Swiss Nitex尼龙单丝(75m)的Nitex过滤器上。把滤液收集在 15ml Falcon试管中。将胶原酶溶液(6. 5mg胶原酶/5ml EBSS)的第二 份等分试样(2. 5ml)加入到50ml Erlenmeyer烧瓶的剩余切碎的组织 中，使用移液管轻轻搅拌，温育10分钟，并按照上述过滤。将两份滤 液混合，室温在临床离心机(约200g)中离心5分钟。用移液管吸出 约2ml上清液并弃去，将沉淀的细胞在剩余的2ml上清液中重悬浮。按照上面所述，通过加入5mlMEM，离心并重悬浮而将细胞清洗2 次。把清洗过的细胞重悬浮在50ml Erl函eyer烧瓶的30ml含10mm 谷氨酰胺的MEM中，95%空气，5%CO" 37匸时，在没有振摇的情况 下温育1小时。如上所述，通过离心使细胞沉淀，并将细胞重悬浮在 含1 OmM谷氨酰胺的MEM中。分散细胞的浓度是使用血细胞计数器测定的，存活力是利用台盼蓝 染色确定的。将2-5乂105个细胞的等分试样放在12x75mm的试管中， 371C， 95%空气，5。/。C02时，在没有振摇的情况下温育2-5小时。在 此期间，细胞凋亡的进展是通过测定DNA分梯的程度而监测的。神_^ #脊麂,义扃##尹^勿^敏游亡 细胞凋亡的程度是利用DNA分梯测定的。基因组DNA是按照制造 商的指导，使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)，从分散的黄体细 胞或切除的黄体组织中分离的。黄体组织是在用PGF-2a处理诱导细胞 凋亡之前，诱导细胞凋亡后1和24小时切除的。分离的DNA是通过用0.2jiCi [a-32P]dCTP， lmM Tris， 0. 5mM EDTA， 3个单位的克列诺酶， 和分别为0. 2 pM的dATP， dGTP，和dTTP室温温育500ng DNA30分钟 而末端标^己的。按照Sambrook等,斤述，^吏样品通过lml Sepadex G-50柱而除去未掺入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸盐-EDTA(l. 8%)凝 胶电泳分离样品。室温真空干燥凝胶30分钟，-801C时，暴露于X-射 线胶片24小时。在其中一个实验中，超数排卵大鼠黄体中细胞凋亡的程度是在注射 PGF-2a后0， 1， 24小时检测的。在O小时的对照组中，切除没有注 射PGF-2a的卵巢。可反映与细胞凋亡有关的核酸酶活性的低分子量 DNA片段的分梯在对照组黄体组织中并不明显，该对照组黄体组织是在 用PGF-2a处理前切除的，但在诱导细胞凋亡后的1小时内就可看出， 并在诱导细胞凋亡24小时后更显著，如图16所示。在该图中，上面 是用大鼠黄体细胞凋亡特异性DHS cDNA的32P-dCTP-标记的3'-未翻 译区探测的RNA印迹的放射自显影照片。下面是总RNA的溴化乙锭染 色的凝胶。每道含有lOjig RM。该数据表明，血清剥夺后，存在着elF-5A 转录物的下调。在另一个实验中，用盐水代替PGF-2a处理相应的对照组动物。用 盐水或PGF-2a处理15分钟后，切除动物的黄体。在切除动物组织3 和6小时后，从黄体中分离基因组DNA。 DNA分梯和基因组DNA末端标 记的增加在从用PGF-2a处理过的动物中切除黄体组织6小时后变得较 为明显，但在切除组织3小时后并不明显。见图17。当用PGF-2a处 理15分钟后切除黄体，并在体外条件下的EBSS (Gibco)中维持6小时 的时候，反映细胞凋亡的DNA分梯也很显著。从基因组DNA更广泛的 末端标记可以看出，与细胞凋亡有关的核酸酶活性也很显著。在另一个实验中，皮下注射500figPGF-2a诱导超数排卵。对照组 大鼠是用相等体积的盐水溶液处理的。15-30分钟后，切除卵巢，并用 胶原酶切碎。将使用PGF-2a处理过的大鼠的分散细胞在10mm谷氨酰 胺+10fflm亚精胺中温育1小时，然后在没有亚精胺的10mm谷氨酰胺(第 2道)中再温育5小时或在10mm谷氨酰胺+10mm亚精胺中温育1小时， 然后在10mm谷氨酰胺+lmm亚精胺中再温育5小时(笫3道)。用盐 水处理过的大鼠的对照细胞是用胶原酶分散的，并温育1小时，然后 仅在谷氨酰胺中再温育5小时(笫1道)。利用克列诺酶，使用[a-
"P]-dCTP标记各样品的500纳克DNA，在1. 8%琼脂糖凝胶上分离，并 暴露于胶片24小时。结果在图18中给出。在另一个实验中，给超数排卵的大鼠皮下注射lmg/100g体重的亚 精胺，并以0. 333mg/100g体重的三次相等剂量，在皮下注射500jig PGF-2a之前的24， 12和2小时给药。将对照组大鼠分成3组没有 注射，注射3次亚精胺，但没注射PGF-2a;以及在进行PGF-2a处理 之前，注射3次相等体积的盐水。在进行前列腺素处理后1小时35分 钟或3小时45分钟，切除大鼠卵巢，用于分离DNA。利用克列诺酶， 使用[a-"P]-dCTP标记各样品的500纳克DNA，在1. 8%琼脂糖凝胶上 分离，并暴露于胶片24小时第1道，没有注射(在与第3-5道相同 的时间处死动物)；第2道，注射3次亚精胺(在与第3-5道相同的时 间处死动物)；第3道，注射3次盐水，然后注射PGF-2a(用PGF-2a 处理1小时35分钟后，处死动物)；第4道，注射3次亚精胺，然后 注射PGF-2a(用PGF-2a处理后1小时35分钟，处死动物)；第5道， 注射3次亚精胺，然后注射PGF-2a(用PGF-2a处理后1小时35分钟， 处死动物)；第6道，注射3次亚精胺，然后注射PGF-2a(用PGF-2a 处理3小时45分钟后，处死动物)；笫7道，注射3次亚精胺，然后 注射PGF-2a(用PGF-2a处理后3小时45分钟，处死动物)。结果在图 19中给出。及W为、席总RNA是在用PGF-2a诱导细胞凋亡后的不同时间，从大鼠切除的 黄体组织中分离的。简言之，将所述组织(5g)在液氮中磨碎。将磨碎 的粉末与30ml胍緩冲液(4M异硫氰酸胍，2. 5mM Na0Ac pH 8. 5， 0.8% (3-巯基乙醇)混合。通过4层Miracloth将混合物过滤，并于4TC时， 10， 000g离心30分钟。然后使上清液经过11， 200g的氯化铯密度梯度 离心达20个小时。用75%乙醇清洗成颗粒状的RNA，将其重悬浮在 600ml EDPC-处理过的水中，然后在-70"C时，使用1. 5ml 9M乙醇和 60ml 3M NaOAc沉淀RNA。差顺^时为、岸和为、脊 基因组DNA是根据制造商的指导，使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)从提取的黄体组织或分散的黄体细胞中分离的。DNA是通 过用0.2jiCi [a-32p]dCTP， lmM Tris， 0. 5mM EDTA， 3个单位的克列 诺酶，和分另'J为0. 2 pM的dATP， dGTP，和dTTP室温温育500ng DNA 30分钟而末端标记的。按照Maniatis等所述的方法，使样品通过lml Sepadex G-50柱而除去未掺入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸盐-EDTA(2W)凝胶电泳分离样品。室温真空干燥凝胶30分钟，-80^时， 暴露于X-射线胶片24小时。#在扁"》、岸， Sambrook等所述的碱裂解法可用于分离质粒DM。使用双脱氧测 序法对全长阳性cDNA克隆进行测序。Sanger等，Proc. Natl. Acad-Sci. USA, 74: 5463-5467。可读框是利用BLAST检索(GenBank， Bethesda， MD)编辑并分才斤的，序列比对是利用BCM Search Launcher: MultipleSequence AlignmentsPat tern—Induced Multiple Alignment Method进行的(见F. Corpet ， Nuc. Acids Res.， 16: 10881-10890， (1987)。序列和序列比对在图5-11中给出。大鼠黄体RNA的RNA印迹杂交在细胞凋亡的不同阶段，从大鼠黄体中分离的20毫克总RM是在 1%变性甲醛琼脂糖凝胶上分离的，并固定在尼龙薄膜上。利用随机引 物试剂盒(Boehringer) ， ^_用32P-dCTP标记的全长大鼠细胞凋亡-特 异性elF-5A cDNA(SEQ ID NO: 1)探测薄膜7xl07。可选择性地，利用 随机引物试剂盒(Boehringer)，使用32P-dCTP标记的全长大鼠细胞凋 亡一特异性DHS cDNA(SEQ ID NO: 6)探测薄膜(7x107cpm)。室温用lx SSC， 0. 1%SDS清洗薄膜一次，65匸时用0. 2x SSC， 0. 1%SDS清洗3 次。干燥薄膜，并于-701C时，暴露于X-射线胶片过夜。从中看出，elF-5A和DHS在细胞凋亡黄体组织中都是上调的。在 用低浓度PGF-2a处理从而诱导细胞凋亡后的0时间，细胞凋亡-特异 性elF-5A的表达显著提高，在处理的1小时内大大增加，在处理的8 小时内仍然增加，在处理的24小时内稍稍增加(图14 ) 。 DHS的表达 在0时间时较低，在处理的1小时内大大增加，在处理的8小时内仍 然增加，在处理的24小时内稍稍增加(图15)。 炎^差f4 ,弄乂 e/F-i^ Wj Z勿應游亡义處W a r-户^ ,參与基因3，末端对应的部分细胞凋亡-特异性elF-5A序列(SEQ ID NO: ll)是使用从酵母菌，真菌和人elF-5A序列设计的寡核苷酸引物 对，利用RT-PCR，从细胞凋亡大鼠黄体RNA模板生产的。用于分离大 鼠elF-5A基因3，末端的上游引物是20个核苷酸的简并引物 5，TCSAARACHGGNAAGCAYGG3，(SEQ ID NO: 9)，其中S选自C和G; R选 自A和G; H选自A， T，和C; Y选自C和T; N是任意的核酸。用于分 离大鼠elF-5A基因3'末端的下游引物含有42个核苷酸 5'GCGAAGCTTCCATGG CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3， (SEQ ID NO: 10)。进行逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。简单地说，使用5mg 下游引物合成cDNA的第一个链。然后将第一个链用作RT-PCR的模板， RT-PCR中同时使用上游和下游引物。在琼脂糖凝胶上分离的RT-PCR产物揭示存在一个900bp的片段， 然后利用平端连接将其亚克隆到pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla， CA)中，并测序(SEQ ID NO:ll)。 3，末端的cDNA 序列是SEQ ID NO: 11， 3，末端的氨基酸序列是SEQ ID NO: 12。见图 1-2。与基因5，末端对应，并与3，末端重叠的部分细胞凋亡-特异性 elF-5A序列(SEQ ID NO: 15)是利用RT-PCR，从细胞凋亡大鼠黄体RNA 模板产生的。5，引物是具有序列5，CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3，(SEQ IDN0: 13)的24聚体，它是从人eIF-5A序列设计的。3，引物是具有序 列5，ATATCTCGAGCCTT GATTGCAACAGCTGCC3，(SEQ ID NO:14)的30聚 体，它是根据3'末端的RT-PCR片段设计的。进行逆转录酶聚合酶链反 应(RT-PCR)。简单地说，使用5mg下游引物合成cDNA的第1个链。然 后将第1个链用作RT-PCR中的模板，RT-PCR中同时使用上游和下游 引物。在琼脂糖凝胶上分离的RT-PCR产物揭示存在一个500bp的片段， 然后使用分别存在于上游和下游引物中的Xbal和Xhol克隆位点将其 亚克隆到pBluescript ( Stratagene Cloning 5'末端的氨基酸序列是SEQ ID NO: 16。见图2。大鼠细胞凋亡-特异性elF-5A的3，和5，末端序列(分别为SEQ ID NO: 11和SEQ ID N0:15)重叠，产生全长cDNA序列(SEQ ID NO: 1)。 将该全长序列与Genbank数据库中的序列进行比对。见图l-2。 cDNA 克隆编码计算的分子量为16. 8KDa、具有154个氨基酸的多肽(SEQ ID NO: 2)。利用RT-PCR获得的大鼠细胞凋亡-特异性黄体elF-5A基因的 全长cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO: 1在图3中描述，相应的衍生氨基 酸序列是SEQ IDN0:9。将elF-5A的衍生全长氨基酸序列与人和小鼠 elF-5A的序列进行对比。见图7-9。炎^差于乂 /^S淨W辨j,勿應游亡义薦#傳W W7W7(^与基因3，末端对应的部分细胞凋亡-特异性DHS序列(SEQ ID NO: 6) 是使用从人DHS序列设计的一对寡核苷酸引物，通过RT-PCR从细胞凋 亡大鼠黄体RNA模板产生的。5，引物是具有序列 5，GTCTGTGTATTATTGGGCCC3,(SEQ ID N0:17)的20聚体；3'引物是具 有序列5'GCGAAGCTTCCATGGC TCGAGTTmmTTTTmmm3" (SEQ ID N0:18)的42聚体。进行逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。简单地 说，使用5mg的下游引物合成cDNA的第1个链。然后将第1个链用作 RT-PCR的模板，RT-PCR同时使用上游和下游引物。在琼脂糖凝胶上分离的RT-PCR产物揭示存在一个606bp的片段， 利用平端连接将其亚克隆到pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LsJolla， CA)中，并测序(SEQ ID NO: 6)。通过RT-PCR获 得的大鼠细胞凋亡-特异性黄体DHS基因的部分cDNA的核苷酸序列 (SEQ IDN0:6)在图4中描述，对应的衍生氨基酸序列是SEQ ID NO: 7。差茵逸#浙 进行DNA印迹的基因组DNA是从切除的大鼠卵巢中分离出来的。 将大约lOOmg的卵巢组织分成小份，放在15ml试管中。使用1ml PBS， 通过轻轻振摇组织混悬液而将组织清洗两次，然后使用移液管吸出 PBS。将组织重悬浮在2. 06ml的DNA-緩冲液(O. 2M Tris-HCl pH 8. 0 和0. ImM EDTA)中，加入240[il的10%SDS和lOOjil的蛋白酶 K(Boehringer Manheim; 10mg/ml)。将组织放在45X:的水浴中振摇
过夜。第2天，再加入lOOfil蛋白酶K(10mg/ml)，然后在451C的水 浴中温育组织混悬液4小时。温育后，用相等体积的苯酚氯仿异戊 醇(25:24:1)提取组织混悬液1次，然后用相等体积的氯仿异戊醇 (24:1)提取1次。提取后，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5. 2)和2 个体积的乙醇。用本生灯将玻璃移液管密封，并弯成钩状，用于从溶 液中拉出DNA丝，并将DNA转移到干净的微量离心管中。将DNA在70 %乙醇中清洗1次，风干10分钟。将DNA颗粒状物溶解在500^1的 10mM Tris-HCl (pH8. 0)中，加入1 Ojil RNA酶A (1 Omg/ml) ， 371C温育 DNA1小时。用苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)提取DNA—次，通过加入 1/10体积的3M醋酸钠(pH5. 2)和2个体积的乙醇而使DNA沉淀。4"C 时，通过13, OOOxg离心IO分钟而使DNA成颗粒状物。将DNA颗粒状 物在70%乙醇中清洗1次，然后通过4TC时，使DNA旋转过夜而将其 溶解在200nl的10mM Tris-HCl (pH 8. 0)中。为了进行DNA印迹分析，用各种限制酶消化从大鼠卵巢中分离的 基因组DNA，所述限制酶或者不在内源性基因中切割，或者仅切割一 次。为了实现这一点，使10ng基因组DNA， 20fil IOX反应緩冲液和 100U限制酶在总共200(il的反应体积中反应5-6小时。将消化的DNA 加样到0. 7%琼脂糖凝胶上，40伏电泳6小时或15伏电泳过夜。电泳 后，使凝胶在0. 2N HC1中脱嘌呤10分钟，接着在变性溶液(O. 5M Na0H， 1.5MNaCl)中清洗两次，每次15分钟，然后在中和緩冲液(1. 5M NaCI， 0. 5M Tris-HCl pH7.4)中清洗两次，每次15分钟。将DNA转 移到尼龙薄膜上，使薄膜在杂交溶液(40%甲酰胺，6X SSC， 5X Denhart's溶液(1X Denhart、溶液是0. 02%Ficol 1 ， 0. 02%PVP，和 0. 02%BSA)， 0. 5%SDS，和1. 5mg变性鲑鱼精子DNA)中预杂交。利用随 机引物，使用[a-32p]-dCTP标记大鼠elF-5A cDNA 3，UTR的700bpPCR 片段(650bp的3，UTR和50bp的编码)，然后以1 X 106cpm/ml加到薄 膜上。同样，利用随机引物，使用[a-32P]-dCTP标记大鼠DHS cDNA的 606bp PCR片段(450bp的编码和156bp的3，UTR)，然后以1 X 106cpm/ml加入到第2张相同的薄膜上。印迹在42t!杂交过夜，42TC 用2X SSC和0. 1%SDS清洗1次，然后421C用IX SSC和0. 1%SDS清洗 2次。然后使印迹暴露于胶片3-10天。36
按照图20所示，用限制酶切割大鼠黄体基因组DNA，并用32P-dCTP-标记的全长elF-5A cDNA探测。高度严格条件下的杂交揭示了全长 cDNA探针与每个限制酶消化的DNA样品的若干限制片段杂交，表明若 干elF-5A同种型的存在。特别值得注意的是，当使用EcoRV (它在细 胞凋亡-特异性elF-5A的可读框内具有一个限制位点)消化大鼠基因 组DNA时，在DNA印迹中可检测到elF-5A细胞凋亡-特异性同种型的2 个限制片段。这两个片段在图20中用双箭头表示。与elF-5A细胞凋 亡-特异性同种型对应的限制片段在标记了 EcoRI和BamHI的道中是用 单箭头表示的，所述限制酶在可读框内没有切割位点。这些结果表明， 细胞凋亡-特异性elF-5A在大鼠中是单拷贝基因。如图5-13所示，物 种间的elF-5A基因高度保守，从而预期在任何物种的同种型间，存在 大量保守。图21表示用32p-dCTP-标记的部分大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDNA探测的DNA印迹。基因组DNA是用EcoRV， 一种不会切割被用作 探针的部分cDNA的限制酶切割的。其中有两个限制片段非常明显，表 明基因有两个拷贝，或该基因含有带EcoRV位点的内含子。实施例2本实施例证实使用细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS调节细胞凋亡。C0S-7， 一种使用编码野生型T抗原的SV40突变体转化的非洲绿 猴肾成纤维细胞样细胞系，可用于所有以转染为基础的实验。C0S-7 细胞是在Dulbecco，s修饰Eagle，s培养基(DMEM)中培养的，每升培养 基含有0. 584克L-谷氨酰胺，4.5g葡萄糖，和O. 37%碳酸氢钠。培养 基中还补充了 10。/。的胎牛血清(FBS)和100个单位的青霉素/链霉素。 细胞在37TC、 5。/。C02和95%空气的湿润环境下生长。每3-4天，通过 用0. 25%胰蛋白酶和lmM EDTA的溶液使粘着的细胞分离而再次培养 该细胞。将分离的细胞以1:10的比例分散在含有新鲜培养基的新的培 养皿中。用于分离RNA的C0S-7细胞是在150-mm组织培养亚(Corning)中
生长的。通过用胰蛋白酶-EDTA溶液分离它们而采集细胞。将采集的细 胞收集在离心管中，通过3000rpm离心5分钟而使细胞成颗粒状物。 除去上清液，将细胞颗粒状物在液氮中瞬间冷冻。按照制造商的建议， 使用GenE 1 ut e哺乳动物总RNA微量制备试剂盒(S igma)分离冷冻细胞 的RNA。,逸^在辨种建希CM-7勿應^脊染 携带有:5Ur向大鼠细胞凋亡elF-5A的4^码序列，携带^JC方向大鼠细 胞凋亡elF-5A的3，未解区(UTR)的重纟赠粒是^^哺乳动物表^j^e4Ji^ 体，pHM6 (Roche Molecular Biochemicals)构建的，如图21所示。所ii^体 含有下列CMV启动子-人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子；来源于流感血细 舰集素的HA-ym^^敏BGH pA-牛生錄素絲苷酸條号；f lori-f 1 起泉；SV40ori-SV40早期启动子械泉；新霉素-新霉素私性(G418)基因；SV40 pA-SV40l^^苷酸^fl"号；Col El-Col El起泉；氨爷西林-氨节西綠錄因。 大鼠细胞凋亡elF-5A的4^M^码序列和大鼠细胞凋亡elF-5A的3，UTR是通过 PCR，从pBluescript中的原始大鼠elF-5A的RT-PCR片段扩增的(SEQ ID NO: 1)。为了扩增全长elF-5A ， 所用引物如下正向5 ， GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3， (Hind3) ( SEQ ID NO: 22 )和反向5， CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG3， (EcoRl) (SEQ ID NO: 23)。为了扩增3，UTR 大鼠elF-5A，所用引物如下正向5， AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3， (EcoRl) ( SEQ ID NO: 24 ) 和 反 向 5 ， GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3， (Hind3) (SEQ ID NO: 10)。 进行琼脂糖凝胶电泳后分离的全长大鼠elF-5A PCR产物的长度为 430bp，而3'UTR大鼠elF-5A PCR产物的长度为697bp。将两个PCR 产物亚克隆到pHM6的Hind3和EcoRl位点中，从而制备pHM6-全长 elF-5A和pHM6-反义3'UTR eIF-5A。用来源于多克隆位点上游的流感 血细胞凝集素(HA)的九肽表位标记将全长大鼠eIF-5APCR产物亚克 隆到读框中，从而使用抗-[HA]-过氧化物酶抗体检测重组蛋白。表达 是由人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子驱动的，从而确保在哺乳动 物细胞系中高水平表达。所述质粒还可提供用于选择稳定转染子的新 霉素抗性(G418)基因，以及在表达SV40大型T抗原的细胞，如C0S-7 细胞中进行附加型复制的SV40早期启动子和起点。
转染实验中使用的COS-7细胞或者在24孔细胞培养平板 (Corning)中培养，用于提取细胞的蛋白，或者在4室培养载玻片 (Falcon)中培养，用于将细胞染色。细胞在补充了 10%FBS，但没 有青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长至50-70%融合。24-孔平板的 其中一个孔或培养载玻片所需的转染培养基是通过将0. 32jig质粒DNA 在42. 5fil无血清的DMEM中稀释，并在室温温育混合物15分钟而制备 的。将1.6ji1的转染试剂，脂转染胺(Gibco， BRL)在42. 5fil无血清 的DMEM中稀释，室温温育5分钟。5分钟后，将脂转染胺混合物加入 到DNA混合物中，室温共同温育30-60分钟。在覆盖转染培养基之前， 用无血清的DMEM清洗待转染的细胞1次，然后将细胞放回到生长室中 温育4小时。温育后，向细胞中加入0. 17ml的DMEM + 20%FBS。在先于染色进 行的、诱导细胞凋亡之前，或采集进行蛋白质印迹分析之前，将细胞 再培养40小时。作为对照，还要进行模拟转染，其中的转染培养基中 没有质粒DNA。蛋冷炎承 一蛋伊遂 进行蛋白质印迹的蛋白是通过在PBS(8g/L NaCl， 0. 2g/L KC1， 1.44g/L Na2HP(K，和0. 24g/L KILPOO中将细胞清洗2次，然后加入 150jil热的SDS凝胶-加样緩冲液(50mM Tris-HC1 pH6. 8， lOOmM 二 硫苏糖醇，2%SDS， 0. 1%溴酚蓝，和10%甘油)而从转染细胞中分离出 来的。将细胞的溶胞产物收集在微量离心管中，951C加热10分钟，然 后13, 000 x g离心IO分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，-20 1C贮存备用。为了进行蛋白质印迹，在12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离2.5或 5fig的总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜 在封闭溶液(5%脱脂乳粉末，0. 02%叠氮化钠的PBS溶液)中温育1小 时，并在PBS-T(PBS + 0. 05%吐温-20)中清洗3次，每次15分钟。将 薄膜在41C的PBS-T中贮存过夜。第2天温热至室温后，将薄膜在 lHg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。将薄膜在去离子水中清洗5次，然 后在5%乳汁的PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前，将第一抗 体在5%乳汁的PBS溶液中预温育30分钟。
可使用多种第一抗体。使用1: 5000稀释的抗-[HA]-过氧化物酶抗 体(Roche Molecular Biochemicals)检观J重组蛋白的表达。因为这种 抗体与过氧化物酶偶联，因此无需第二抗体，清洗印迹并利用化学发 光显色。可使用的其它笫一抗体是来源于Oncogene的单克隆抗体，它 可识另'J p53(Ab-6)， Bcl-2(Ab-l)，和c-Myc (Ab-2) 。 p53的单克隆 抗体是以0. ljig/ml的稀释度使用的，Bcl-l和c-Myc的单克隆抗体 是以0. 83ng/ml的稀释度使用的。用第一抗体温育60-90分钟后，将 薄膜在PBS-T中清洗3次，每次15分钟。然后将第二抗体在1%乳汁 的PBS溶液中稀释，与薄膜温育60-90分钟。当使用p53(Ab-6)作为 第一抗体时，所用的第二抗体是1: 1000稀释的、与碱性磷酸酶偶联的 山羊抗-小鼠IgG (Rockland)。当使用Bcl-2 (Ab-l)和c-Myc (Ab-2)作 为第一抗体时，使用1:5000稀释的、与过氧化物酶偶联的兔抗-小鼠 IgG(Sigma)。用第二抗体温育后，将薄膜在PBS-T中清洗3次。比色法和化学发光法这两种检测方法用于使印迹显色。仅当使用 p53(Ab-6)作为笫一抗体，以及碱性磷酸酶-偶联的第二抗体时，使用 比色法。结合抗体是通过在黑暗中，在0. 33mg/mL硝基蓝四唑铺， 0. 165mg/mL 5-溴-4-氯-3-丐l哚基磷酸盐，100mM NaCl， 5mM MgCl" 和100mM Tris-HCl (pH 9. 5)的溶液中温育而目测;現察的。显色反应通 过在2mMEDTA的PBS溶液中温育印迹而终止。化学发光检测法可用于 所有其它的第一抗体，包括抗-[HA]-过氧化物酶，Bel-2(Ab-1)，和 c-Myc (Ab-2) 。 ECL Plus蛋白质印迹检效，J试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测过氧化物酶偶联的结合抗体。简单地说，将薄膜轻 轻吸干，然后在黑暗中，与试剂A和试剂B的40: 1混合物温育5分钟。 将薄膜吸干，放在醋酸盐层之间，暴露于X-射线胶片接触IO秒-IO分 钟。^tV^ 7勿應吵谬,勿應游亡 血清剥夺以及用放线菌素D，链霉菌(Calbiochem)处理这两种方 法都可用于在转染的C0S-7细胞中诱导细胞凋亡。对于两种处理方法 而言，转染后40小时除去培养基。对于血清饥饿实验而言，用无血清 和抗生素的DMEM替换培养基。将在补充了 10 % FBS 、没有抗生素的DMEM 中生长的细胞用作对照。对于放线菌素D诱导的细胞凋亡而言，用补
充了 10%FBS和ljig/ml放线菌素D的曱醇溶液、且没有抗生素的DMEM 替换培养基。对照组细胞是在补充了 10%FBS和相等体积甲醇、且没 有抗生素的DMEM中生长的。对于两种方法而言，凋亡细胞的百分比是 在用Hoescht或膜联蛋白V-Cy3染色48小时后测定的。细胞凋亡的 诱导还可通过RNA印迹分析加以证实，如图22所示。Aoe"力f染g核染料Hoescht用于标记转染的C0S-7细胞的核，从而鉴定以形 态学特征，如核断裂及凝聚为基础的凋亡细胞。使用前，即时制备固 定的，由无水曱醇和水醋酸的3:1混合物组成的固定剂。然后向在培 养载玻片上生长的C0S-7细胞培养基中加入相等体积的固定剂，并温 育2分钟。除去细胞中的培养基/固定剂混合物，并弃去，向细胞中加 入lml的固定剂。5分钟后，弃去固定剂，向细胞中加入lml新鲜的固 定剂，温育5分钟。弃去固定剂，在加入lml的Hoescht染色剂 (0. 5ng/ml Hoescht 33258的PBS溶液)前，将细胞风干4分钟。在 黑暗中温育10分钟后，弃去染色溶液，用去离子水清洗载玻片3次， 每次l分钟。清洗后，向细胞中加入lml的McIlvaine，s緩冲液(O. 021M 柠檬酸，0. 058M NazHPO" 7IL0; pH5. 6)，并在黑暗中温育20分钟。 弃去緩冲液，将细胞在黑暗中风干5分钟，并除去分离培养载玻片各 孔的室。在载玻片上加几滴荧光Vectashield封固剂(Vector Laboratories),并盖上盖玻片。在使用UV滤光器的荧光显微镜下可 观察到染色的细胞，将鲜明染色或核断裂的细胞记录为细胞凋亡。篪炎f冷F-0^染^ 膜联蛋白V-Cy3细胞凋亡检测试剂盒(Sigma)用于荧光标记凋亡 细胞上外在化的磷脂酰丝氨酸。按照制造商的方案使用该试剂盒，并 进行下列改进。简单地说，用PBS清洗在四室培养载玻片上生长的转 染的C0S-7细胞2次，用1X结合緩冲液清洗3次。加入150|il染色溶 液(溶解在1X结合緩冲液中的lng/ml AnnCy3)，在黑暗中温育细胞 10分钟。然后除去染色溶液，用1X结合緩冲液清洗细胞5次。除去培 养载玻片上的室壁，并将几滴1X结合緩冲液放在细胞上，盖上盖玻片。 使用绿色滤光器，通过荧光显微镜检查分析染色的细胞，从而观察到
阳性染色(凋亡)细胞的红色荧光。总细胞群是通过在可见光下计算 细胞数而测定的。实施例3本实施例证实使用细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS调节细胞凋亡。使用前面实施例描述的方法和一般过程，图23是举例说明C0S-7 细胞瞬时转染的流程图，其中将无血清培养基中的细胞在脂转染胺的 质粒DNA中温育4小时，加入血清，将细胞再温育40小时。或者在进 行分析之前，将细胞在含有血清的规则培养基中再培养48小时(即， 没有进一步的处理)，或者在进行分析之前，使血清缺失48小时而诱 导细胞凋亡，或者在进行分析之前，用放线菌素D处理48小时而诱导 细胞凋亡。图22是举例说明使用pHM6转染后，外源性蛋白在C0S-7细胞中 的瞬时表达。蛋白是在模拟转染，或用pHM6-LacZ， pHM6-反义 3，rF5A(pHM6-反义3，UTR大鼠细胞凋亡elF-5A)，或p画6-有义 rF5A(pHM6-全长大鼠细胞凋亡elF-5A)转染48小时后，从C0S-7细胞 中分离出来的。各样品的5jig蛋白是通过SDS-PAGE分级分离的，然后 转移到PVDF薄膜上，使用抗-[HA]-过氧化物酶进行蛋白质印迹。利用 化学发光检测结合抗体，并使其暴露于X-射线胶片30秒。LacZ(笫2 道)和有义大鼠细胞凋亡elF-5A (第4道)的表达清晰可见。如上所述，或者模拟转染或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠 elF-5A)转染C0S-7细胞。转染40小时后，通过剥夺血清48小时而诱 导细胞经历凋亡。使用荧光同源性天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 测定试剂盒(Roche Diagnostics)测量转染细胞提取物中的天门冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。还可使用FragELDNA断裂 细胞凋亡检测试剂盒(Oncogene)测量DNA的断裂，该试剂盒使用荧光 素-标记的脱氧核苷酸标记DNA片段的暴露3'0H末端。模拟转染或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠elF-5A)转染其它 COS-7细胞。转染40小时后，使细胞在含血清的常规培养基中再生长 48小时(没有进一步的处理)，通过剥夺血清48小时而诱导细胞经历 凋亡，或通过用0. 5ng/ml放线菌素D处理48小时而诱导细胞经历凋
亡。或者用Hoescht 33258将细胞染色，它可描述伴随细胞凋亡的核 断裂，或者用膜联蛋白V-Cy3将细胞染色，它可描述伴随细胞凋亡的 磷脂酰丝氨酸暴露。此外，还可使用绿色滤光器，通过荧光显微镜检 查观察染色的细胞，并进行计数，从而测定经历凋亡的细胞百分比。 总细胞群是在可见光下计数的。图25说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，天门冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的 eIF-5A表达导致天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性增加60%。图26说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，DNA断 裂的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A表达导致DNA断裂增 加273%。图27说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞 凋亡-诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，核 断裂的增加反映的。图28说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全 长大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7 细胞时，核断裂的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A表达分 别导致非-血清饥饿样品和血清饥饿样品对照组中的核断裂增加27%和 63%。图29说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，磷脂酰 丝氨酸暴露的增加反映的。图30说明细胞凋亡的增加，它是通过使用 含有全长大鼠细胞调亡-诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染 C0S-7细胞时，磷脂酰丝氨酸暴露的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导 的elF-5A表达分别导致非-血清饥饿样品和血清饥饿样品对照组中的 磷脂酰丝氨酸暴露增加140%和198%。图31说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡 -诱导的elF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，核断裂 的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A表达分别导致未处理样 品和处理样品对照组中的核断裂增加115%和62%。图32说明在使用含 有全长大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A的p固6，按有义方向瞬时转染 COS-7细胞的条件下，细胞凋亡增加的对比，其中对C0S-7细胞没有
进行进一步的处理或进行了处理而诱导细胞凋亡。实施例4本实施例证实给予细胞凋亡-特异性elF-5A和DHS后，调节细胞 凋亡活性。此外，或者模拟转染，或者用pHM6-LacZ转染，或者用pHM6-有 义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染C0S-7细胞，温育40小时。各 样品的5ng蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到 PVDF薄膜上，使用可识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白质印迹。将与 过氧化物酶偶联的兔抗-小鼠IgG用作第二抗体，利用化学发光检测结 合抗体，并使其暴露于X-射线胶片。结果如图32所示。与使用 pHM6-LacZ转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中仅 检测到更少量的Bel-2;因此，Bcl-2是下调的。或者模拟转染，用pHM6-反义3'rF5A(大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6-反义3，UTR)转染，或者用pHM6-有义rF5A (pHM6-全长大鼠 细胞凋亡特异性eIF-5A)转染其它C0S-7细胞。转染40小时后，通过 剥夺血清48小时而诱导细胞经历凋亡。各样品的5fig蛋白提取物样品 是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到PVDF薄膜上，使用可识别 Bel-2的单克隆抗体进行蛋白质印迹。将与过氧化物酶偶联的兔抗-小 鼠IgG用作第二抗体，利用化学发光检测结合抗体，并使其暴露于X-射线胶片。此外，或者模拟转染，或者用pHM6-LacZ转染，或者用pHM6-有 义rF5A(pHM6-全长大鼠elF-5A)转染C0S-7细胞，温育40小时。各 样品的5ng蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到 PVDF薄膜上，使用可识别p53的单克隆抗体进行蛋白质印迹。将与碱 性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG用作第二抗体，利用比色法检测结合 抗体。最后，或者模拟转染，或者用pHM6-LacZ转染，或者用pHM6-有 义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞，温育40小时。各 样品的5jig蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到 PVDF薄膜上，使用可识别p53的单克隆抗体探作为探针进行杂交。相 应的蛋白印迹是用抗-[HA]-过氧化物酶探测的，从而测定大鼠细胞凋
亡-特异性elF-5A的表达水平。将与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠 IgG用作笫二抗体，利用化学发光法检测结合抗体。图33说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A的pHM6， 按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，Bcl-2的下调。上面是考马斯蓝 染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与使用pHM6-LacZ转染 的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更少量的 Bcl-2。图34说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A的pHM6， 按反义方向瞬时转染C0S-7细胞时，Bcl-2的上调。上面是考马斯蓝 染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与模拟转染或使用pHM6-有义rF5A转染的那些相比，在使用pHM6-反义3'rF5A转染的细胞中检 测到更多的Bcl-2。图35说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A的 pHM6，按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，c-Myc的上调。上面是考 马斯蓝染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与使用pHM6-LacZ 或模拟对照组转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中 检测到更多的c-Myc。图36说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的elF-5A的pHM6， 按有义方向瞬时转染C0S-7细胞时，p53的上调。上面是考马斯蓝染 色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与使用pHM6-LacZ或模拟 对照组转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到 更多的p53。图37说明p53上调依赖于pHM6-全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A在C0S-7细胞中的表达。在使用抗-[HA]-过氧化物酶探测蛋白质印 迹中，上面是考马斯蓝染色的蛋白质印迹，下面是相应的蛋白质印迹。 与第2次转染相比，在第1次转染中检测到更多的大鼠细胞凋亡-诱导 的eIF-SA。在使用抗-p53作为探测蛋白质印迹中，A中上面是相应的 考马斯蓝染色的蛋白印迹，下面是使用p53的蛋白质印迹。对于笫1 次转染而言，与使用pHM6-LacZ或模拟对照组转染的那些相比，在使 用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更多的p53。对于其中大鼠细 胞凋亡诱导的eIF-5A表达水平较低的笫2次转染而言，在使用pHM6-有义rF5A， pHM6-LacZ或模拟对照组转染的细胞之间，没有检测到p53 水平的差异。实施例5本实施例证实细胞凋亡-特异性elF-5A可诱导具有活性p53的细 胞(RK0细胞)以及没有活性p53的细胞(RK0-E6细胞)凋亡，表明 细胞凋亡-特异性elF-5A可通过与p53不同的途径引发细胞凋亡。这 还可支持我们的观点，即它在上游发挥作用，很可能杀死多种不同类 型的癌症。本实施例还表明elF-5Al的活性位点是蛋白的羧基末端(即，见， 使用截短elF-5A进行的实验)，它很可能含有RNA结合域。此外，本实施例还可证实人elF-5A2最可能是增殖elF-5A，这是 因为它不能诱导细胞凋亡。因此，据信人数据库中的两种eIF-5A基因， 细胞凋亡-特异性elf-5Al是细胞凋亡基因，elF-5A2是增殖基因。和<f勿應"凝# RKO(美国典型培养物保藏中心CRL-2577)， 一种表达野生型p53 的人结肠癌细胞系，和RK0-E6(美国典型培养物保藏中心CRL-2578)， 一种来源于RKO的细胞系，其含有稳定整合的人乳头状瘤病毒 E6致癌基因，可导致正常p53水平和功能的降低，上述这两种细胞都 可用于以转染为基础的实验。RK0和RK0-E6细胞是在含有非必需氨基 酸，Earle，s盐，和L-谷氨跣胺的极限必需培养基Eagle (MEM)中培养 的。培养基中还补充了 10%胎牛血清(FBS)和100个单位的青霉素/ 链霉素。细胞在371C、 5%0)2和95%空气的湿润环境中生长。每3-4天， 通过使用0. 25%胰蛋白酶和lmM EDTA的溶液分离粘着的细胞而将细 胞再次培养。将分离的细胞以1:10-1:12的比例分散在新培养皿中的 新鲜培养基中。乂 e/尸JJ2 W乂發使用根据从Genbank获得的人elF-5A2序列设计的引物 (ACCESSION XM-113401),通过RT-PCR，从RKO细胞的RNA中分离人 elF5A2。图38提供从RKO细胞中分离的人elF-5A的序列与人elF-5A2 的序列的对比。RNA是使用GenElute哺乳动物总RNA微量制备试剂盒 (Sigma)从RK0细胞中分离的。用于扩增elF5A2的正向引物具有序列 5，AAACTACCATCTCCCCTGCC3，， 反向引物具有序列 5'TGCCCTACACAGGCTGAAAG3'。将所得的936bp PCR产物亚克隆到 pGEM-T Easy栽体(Promega)中，并测序。然后将pGEM-T Easy-elF5A2构建体用作模板，产生亚克隆到哺乳 动物表达载体pHM6 (Roche)的读框中的elF5A2 PCR片段。用于扩增人 elF5A2的正向引物是5， ATCAAGCTTGCCCACCATGGCAGACG3，，反向引 物是5， AACGAATTCCATGCCTGATGTTTCCG3，。所得的505bpPCR产物是 用Hind3和EcoR 1消化的，并亚克隆到pHM6的Hind3和EcoRl位点中。e/,"J ^游建为了确定elF5Al的羧基末端是否对其诱导细胞凋亡的活性很重 要，构建羧基末端缺失的elF5Al。编码氨基酸1-127的截短的elF5Al 是使用pBS-大鼠elF5Al作为模板，利用PCR产生的。正向PCR引物 是5 ， GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG3 ，， 反向引物是5 ， TCCGAATTCGTACTTCTGCTCAATC3，。所得的390bp PCR产物是用Hind 3 和EcoR l消化的，并被亚克隆到pHM6的Hind 3和EcoR l位点中。脊染转染实验中所用的RKO或RK0-E6细胞进行Hoecht染色时，是在8 孔室培养栽玻片(Falcon)中培养的，通过流式细胞术进行分析时， 是在6孔平板中培养的。所述细胞在补充了 10%胎牛血清，但没有青 霉素/链霉素的MEM培养基中生长至70-80%融合。8孔培养载玻片的 其中一个孔所需的转染培养基是通过将0. 425jig质粒DNA稀释在22nl 无血清的MEM中，室温温育混合物15分钟而制备的。将0. 85jil的转 染试剂，脂转染胺(Gibco， BRL)稀释在22jil无血清的MEM中，室温 温育5分钟。5分钟后，将脂转染胺混合物加入到DNA混合物中，室温 温育30-60分钟。在向转染培养基中加入44nl MEM，并将它覆盖在细 胞上之前，用无血清的MEM清洗细胞1次。将细胞放回到生长室中达4 小时。温育后，向细胞中加入88fil的MEM+20%FBS。然后将细胞再培 养44小时，并按照前面所述用Hoescht 33258染色。在另一组实验中，
在转染并用Hoescht染色20小时后，用0. 25ng/ml的放线菌素D处 理8-孔培养载玻片中的RK0或RK0-E6细胞。在6-孔平板中进行的转 染是以相同方式完成的，区别在于所有试剂都增加了 4. 81倍。转染48 小时后，采集在6孔平板中转染的RK0细胞，并将其固定，从而按照 下面所述利用流式细胞术进行分析。脊,放羊《承/;t转染效率是用5-溴-4-氯-3-吲哚基-l5-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL) 将pHM6-LacZ转染的细胞染色而测定的。染成蓝色的细胞是表达LacZ 的转染细胞，转染效率是通过用染成蓝色的细胞数除以总细胞数而计 算的。转染48小时后，将转染的细胞染色。用PBS清洗细胞2次，然 后室温时，在0. 5%gluteraldehyde/PBS中固定10分钟。用lmM MgCL/PBS清洗细胞3次，然后用染色溶液[5mMK4Fe (CN)6.3H20， 5mM K3Fe(CN)6， lmM MgCL， 0. 1%X-GAL的PBS溶液]温育，直到出现染成 蓝色的细胞。#oe"/^染g核染料Hoescht用于标记转染RK0和RK0-E6细胞的核，从而根据 核断裂及凝聚鉴定凋亡细胞。无水甲醇与水醋酸的3:1混合物组成的 固定剂是在使用前即时制备的。然后向在培养载玻片上生长的细胞培 养基中加入相等体积的固定剂，温育2分钟。除去细胞中的培养基/固 定剂混合物，并弃去，向细胞中加入lml固定剂。5分钟后，弃去固定 剂，向细胞中加入lml新鲜的固定剂，温育5分钟。弃去固定剂，在 加入lml的Hoescht染料(O. 5|ig/ml Hoescht 33258的PBS溶液)之 前，将细胞风干4分钟。在黑暗中温育10分钟后，弃去染色溶液，用 去离子水清洗栽玻片3次，每次1分钟。清洗后，向细胞中加入lml 的Mcllvaine，s緩冲液(O. 021M柠檬酸，0. 058M Na2HP0" 7H20; pH5.6)，并在黑暗中温育20分钟。弃去緩冲液，将细胞在黑暗中风干 5分钟，并除去分隔培养载玻片的孔的室。在载玻片上加几滴荧光 Vectashield封固剂(Vector Laboratories),并盖上盖玻片。在使 用UV滤光器的荧光显微镜下可观察到染色的细胞。将鲜明染色或核断 裂的细胞记录为细胞凋亡。
利用流式细胞术检测DNA断裂利用荧光素-FragELTM DNA断裂检测试剂盒(Oncogene Research Products)，使用荧光素标记的脱氧核苷酸标记在细胞凋亡过程中产生 的DNA片段。转染48小时后，通过胰蛋白酶消化采集用各种构建体在 6孔培养平板中转染的细胞，然后按照制造商的指导将细胞固定并标 记。简单地说，4TC时，1000xg、 5分钟，使细胞成颗粒状物，在PBS (8g/L NaCl， 0.2g/L KC1， 1. 44g/L Na2HP04，和0. 24g/L KH2P(h)中清洗1 次。然后将细胞重悬浮在4。/。甲醛/PBS中，室温温育10分钟。再次使 细胞成颗粒状物，重悬浮在lml 80%乙醇中，4TC贮存。在进行分析当 天，将lml的固定细胞(lXl()6个细胞/ml)转移到微量离心管中，通过 1000xg离心5分钟而使细胞成颗粒状物。将成颗粒状物的细胞重悬浮 在200ji1的IX TBS(20mM Tris pH7.6， 140mM NaCI)中，室温温育 10-15分钟。然后再次使细胞成颗粒状物，重悬浮在lOOfil 20ng/ml 的蛋白激酶K中，室温温育5分钟。使细胞成颗粒状物，重悬浮在lOOfil 的1XTdT平衡緩冲液中，室温温育10-30分钟。然后通过离心使细胞 成颗粒状物，并重悬浮在60nl TdT标记反应混合物中，黑暗中温育 1-1.5小时。温育后，离心使细胞成颗粒状物，在200nl IX TBS中 清洗2次。将细胞重悬浮在0. 5ml终体积的IX TBS中，并在装配有 488nm氩离子激光源的流式细胞器上进行分析。蛋冷炎承々蛋々#伊逐为了进行蛋白质印迹，通过在PBS中清洗细胞2次，然后加入15Ofil 的热SDS凝胶-加样緩冲液(50mM Tris-HCl pH 6.8， 100mM二硫苏糖 醇，2%SDS， 0. 1%溴酚蓝，和10%甘油)而从转染细胞中分离蛋白。将 细胞的溶胞产物收集在微量离心管中，95TC加热10分钟，然后13， 000 x g离心10分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，-2010贮存备 用。为了进行蛋白质印迹，在12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离5jig或 10fig的总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄 膜在封闭溶液(5%脱脂乳粉末，0. 02%叠氮化钠的PBS溶液)中温育1 小时，并在PBS-T(PBS + 0. 05%吐温-20)中清洗3次，每次15分钟。
将薄膜在41C的PBS-T中贮存过夜。第2天温热至室温后，将薄膜在 ljig/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。在去离子水中清洗薄膜5次，然后 在5。/。乳汁的PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前，将第一抗体 在5%乳汁的PBS溶液/O. 025%吐温-20中预温育30分钟。使用可识别p53 (Ab-6)、来源于Oncogene的单克隆抗体，或针 对合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIEQKYD-羧基)的多克隆抗体在薄膜上 印迹，所述合成肽与在鸡中含量较高的人elF5Al的C-末端同源。p53 的单克隆抗体是以0. ljig/ml的稀释度使用的，elF5Al的抗体是以 1:1000的稀释度使用的。用第一抗体温育60-90分钟后，将薄膜在 PBS-T中清洗3次，每次15分钟。然后将第二抗体在1%乳汁的PBS 溶液/0. 025 %吐温-20中稀释，与薄膜温育60-90分钟。当使用 p53(Ab-6)作为第一抗体时，所用的第二抗体是1: 1000稀释的、与碱 性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG (Rockland)。当使用抗-elF5Al作为 第一抗体时，使用1:10000稀释的、与过氧化物酶偶联的兔抗-鸡 IgY(Gallus Immunotech)。用第二抗体温育后，将薄膜在PBS-T中清 洗3次 比色法和化学发光法这两种检测方法都可用于使印迹显色。仅当使 用p53(Ab-6)作为第一抗体，以及与碱性磷酸酶-偶联的第二抗体时， 使用比色法。结合抗体是通过在黑暗中，在0. 33mg/mL硝基蓝四唑铺， 0. 165mg/mL 5-溴-4-氯-3-丐l哚基磷酸盐，100mM NaCl， 5mM MgCL， 和100mM Tris-HCl (pH 9. 5)的溶液中温育而目测，见察的。显色反应是 通过在2mMEDTA的PBS溶液中温育印迹而终止的。化学发光检测法可 用于所有其它的第一抗体，包括抗-[HA]-过氧化物酶和抗-eIFSAl 。 ECL Plus蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测与过氧化物酶偶联的结合抗体。简单地说，将薄膜轻轻吸干，然后 在黑暗中，与试剂A和试剂B的40:1混合物温育5分钟。将薄膜吸干， 放在醋酸盐层之间，暴露于X-射线胶片IO秒-IO分钟。图39是描述瞬时转染后，RKO和RKO-E6中发生细胞凋亡百分比的 图。RKO和RK0-E6细胞是使用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬时转染 的。24小时后，用0. 25ng/ml的放线菌素D或相等体积的甲醇(对照 组)处理细胞。用Hoescht 20将细胞染色20小时后，使用UV滤光器 在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而鲜明染色的细胞记录为细
胞凋亡。上述实验说明，用pHM6-elF5Al转染、并用放线菌素D处理 的RK0细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染、但没用放线菌素D处理 的细胞增加了 240%。用放线菌素D处理、并用pHM6-elF5Al转染的 RK0-E6细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染、但没用放线菌素D处理 的细胞增加了 105%。图40是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。 RKO细胞是用pHM6-LacZ， pHM6-elF5Al， pHM6-elF5A2，或pHM6-截 短的elF5Al瞬时转染的。44小时后用Hoescht将细胞染色后，使用 UV滤光器在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而鲜明染色的细胞 记录为细胞凋亡。用pHM6-elF5Al转染的细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染的对照组细胞增加了 25%。这种增加对于4吏用pHM6-elF5A2 或pHM6-截短的elF5Al转染的细胞似乎并不明显。图41是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。 RKO细胞或者未被转染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬时转染。 44小时后用Hoescht将细胞染色后，使用UV滤光器在荧光显微镜下 观察。将由于染色质凝聚而鲜明染色的细胞记录为细胞凋亡。校正转 染效率之后，用pHM6-elF5Al转染的细胞有60%凋亡。图42提供瞬时转染后，RK0细胞凋亡的流式细胞分析。RK0细胞 未被转染，或者用pHM6-LacZ， p,-elF5Al， pHM6-elF5A2，或pHM6-截短的elF5Al转染。48小时后，采集细胞并固定。反映细胞凋亡的 断裂DNA是用与脱氧核苷酸偶联的荧光素标记的，并在装配有488nm 的氩离子激光源的流式细胞器上进行分析。E下出现的荧光来源于非-凋亡细胞，F下出现的荧光来源于正在经历凋亡的细胞。该表描述了经 历凋亡的细胞百分比，它是以各个峰下的面积为基础计算的。校正未 转染细胞中的背景细胞凋亡和转染效率后，有80%用pHM6-elF5Al转 染的细胞显示凋亡。用pHM6-LacZ， pHM6-elF5A2或pHM6-截短的 elF5Al转染的细胞仅仅显示背景水平的凋亡。图43提供蛋白的蛋白质印迹，所述蛋白是从用0. 25ng/ml放线菌 素D处理O， 3， 7， 24，和48小时的RK0细胞中分离的。在12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离5fig (抗-elF5Al)或10ng (抗-p53)的总蛋 白，并转移到聚偏二氯乙烯薄膜上。上面描述使用抗-p53作为第一抗 体的蛋白质印迹。中间描述使用抗-elF5Al作为笫一抗体的蛋白质印51
迹。下面描述用于抗-elT5Al印迹的薄膜，该印迹是在化学发光检测 以证实等量加样后，用考马斯蓝染色的。p53和elF5Al都是通过用放 线菌素D处理而上调的。 序列表<110〉 SENESCO, INC.<120>核酸，多肽，以及调节细胞凋亡的方法<130〉 10799/40<140> PCT/US02/23254 <141> 2002-07-23<150> 10/200， 148 <151> 2002-07-23<150> 10/141,647 <151〉 2002-07-05<150> 09/909, 796 <151> 2001-07-23<160〉 30<170> Patentln Ver. 2. 1<210〉 1 〈211> 1139 <212> DNA〈213〉大鼠(Rattus sp.)<220〉<221> CDS<222> (33).. (494)<400〉 1caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5gag aca gga gat gca ggg gcc tea gcc acc ttc cca atg cag tgc tea 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35ate gtc gag atg tct act teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat 293 lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn 75 80 85gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tec ctg etc cag 341 Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin 90 95 100gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 110 115ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate 437 Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie 120 125 130 135aca gtg ctg tec gec atg aca gag gag gca get gtt gca ate aag gec 485 Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 140 145 150atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc 534 Met Ala Lysatgagectae agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594 atttatttga cgttttattt tggttt.tcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654 ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714 ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774 cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834 gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894 ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954 acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014 atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074 atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaa肌1134
aasaa 1139<210> 2 <211> 154 <212> PRT <213>大鼠<400> 2Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu 1 5Thr Gly Asp Ala 10Gly Ala Ser Ala 15Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 4045Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe50 5560Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 707580Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie, Gly lie Gin Asp 85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp115 120125Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150<210> 3 <211> 462 <212〉 DNA<213>人(Homo sapiens) <400> 3
atggcagatg acttggactt cgagacagga cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag aaggagattg agcagaagta cgactgtgga atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaaggatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 gccatggcaa aa 462〈210〉 4<211〉 462<212〉 DNA <213>人<220〉〈221〉修饰的碱基 <222> (455).. (456) <223> a, t, c或g〈400〉 4atggcagacg aaattgattt cactactgga cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggagatgt caacttccaa aactggaaag attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gttccaaata ttaaga^gaaa^ tgattatcaa ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt atgagtgaag aatatgctgt agcca/taaaagatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 ccctrmgcaa at 462〈210〉 5<211〉 462〈212〉 DNA 〈213〉大鼠<400〉 5atggcagatg atttggactt cgagacagga cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag attgacattt ttactggg肌gaaatatgaa gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag aaggagattg agcagaagta tgactgtgga atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaaggatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240 ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 gccatggcaa 462〈210〉 6
<211> 606 <212> ■ <213>大鼠<220> <221〉 CDS <222> (1)..(453)<400> 6get gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48 Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His lie Pro Val Leu Ser Pro 15 10 15gca etc aca gac ggc tea ctg ggt gac atg ate ttt ttc cat tec tat % Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac ate gtt gaa gac ctg egg etc ate 144 Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu lie 35 40 45aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg ate ate ctg ggt 192 Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 50 55 60gga ggc gtg gtc aa.g cac cac ate gcc aat get aac etc atg egg aat 240 Gly Gly Val Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80gga get gac tac get gtt tat ate aac aca gcc cag gag ttt gat ggc 288 Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly 85 90 95tea gac tea gga gcc egg cca gat gag get gtc tec tgg ggc aag ate 336 Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie 100 105 110egg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat get gat gca tct ctg gtt 384 Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125ttc ccc ttg ctg gtg get gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc 432 Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140邻a get gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483 Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543 catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603 aaa 606<210〉 <211> <212> <213><400>7151 PRT 大鼠7Ala Val Tyr Tyr Trp Ala 1 5His Lys Asn His 10lie Pro Val LeuSer Pro 15Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu lie 35 40 45Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 50 55 60Gly Gly Val Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn65 707580Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly 85 90 95Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie 100 105 110Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150<210> 8 <211> 453 <212> DNA <213>人〈400〉 8tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60 ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120 atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180 atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240 ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300 gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360 gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420 atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453<210> 9 <211> 20 <212> DNA 〈213〉人工序列<220><223>人工序列说明引物 〈220〉<221>修饰的碱基<222> (12)<223> a， t， c或g<400〉 9tcsaarachg gnaagcaygg 20<210> 10〈211〉 42<212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>人工序列说明引物<400> 10gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt<210〉<211>972 DNA<212〉 <213>大鼠 <220><221〉 CDS<222〉 (1)..(327)<400> 11tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att 48 Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 15 10 15gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat ate tgc ccg tcg act cat % Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His 20 25 30aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144 Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly 35 40 45ate cag gat ggg tac eta tec ctg etc cag gac agt ggg gag gta cga 192 lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag 240 Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin 65 70 75 80aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate aca gtg ctg tec gcc atg 288 Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95aca gag gag gca get gtt gca ate aag gcc atg gca aaa taactggctt 337 Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 100 105ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagectae agaggcccct cccccagctc 397tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877 accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972<210> 12 <211> 109 <212> PRT <213〉大鼠<400> 12Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 15 10 15Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His2025 30Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly3540 45lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin657075 80Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met8590 95Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 100 105<210> <211> <212> <213>13 24 DNA人工序列<220〉<223>人工序列说明引物 <400> 13caggtctaga gttggaatcg aagc 24〈210〉 <211> <212〉 <213>
14 30 DNA
人工序列
<220>
<223>人工序列说明引物
<400> 14
atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc
<210〉 15 <211> 489 <212> DNA 〈213〉大鼠
<220>
<221〉 CDS
<222〉 (33).. (485)
<400〉 15
caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53
Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5
gag aca gga gat gca ggg gcc tea gec acc ttc cca atg cag tgc tea 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20
gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35
ate gtc gag atg tct act teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55
gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70
ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat 293 lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn 75 80 85
gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tec ctg etc cag 341<formula>formula see original document page 63</formula>Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140
Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 145 150
<210〉 <211〉 <212> <213〉
17 20 腿
人工序列
<220>
<223>人工序列说明引物 <400〉 17
gtctgtgtat tattgggccc 20
<210> <211> <212> <213>
18
42 腿
人工序列
<220〉
<223>人工序列说明引物 <400> 18
gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42
<210> <211> <212> 〈213〉
19 18
DNA
人工序列
<220>
〈223>人工序列说明引物 <400> 19
ttgaaggggt gaggaaaa 18
<210> 20 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明引物 <400〉 20
ttgagtggga taaag 15
<210> 21 <211> 18 <212〉腿 <213〉人工序列
<220>
<223>人工序列说明引物 <400〉 21
aatcatctgc cattttaa 18
<210> 22 <211> 26 <212〉腿 <213>人工序列
〈220〉
<223〉人工序列说明引物 <柳〉22
gccaagctta atggcagatg atttgg 26
<210> 23
<211> 25
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列说明引物 <400> 23
ctgaattcca gttattttgc catgg 25
<210> 24 <211> 27 <212〉賺 <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列说明引物 <400〉 24
aatgaattcc gccatgacag aggaggc 27
<210> 25 <211> 20 <212>腿 〈213>人工序列
<220〉
<223〉人工序列说明引物 <400> 25
aaactaccat ctcccctgcc 20
<210> 26 <211> 20 <212〉誰 <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列说明引物 <400> 26
tgccctacac aggctgaaag 20
<210> 27
<211> 26
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223>人工序列说明引物 <400> 27
atcaagcttg cccaccatgg cagacg 26
<210〉 28 <211> 26 <212> DNA <213〉人工序列
<220>
<223>人工序列说明引物 <400〉 28
aacgaattcc atgcctgatg tttccg 加
<210> 29
<211> 25 <212〉醒 〈213>人工序列
〈220>
<223>人工序列说明引物
<400〉 29
tccgaattcg tacttctgct caatc 25
<210> 30 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列
<220〉
<223>人工序列说明合成肽 〈400> 30
Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr 15 10 15
Asp
权利要求
1.一种表达载体在制备用于增加细胞凋亡的药物中的用途，其中所述表达载体含有选自下组的编码人细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的分离的核苷酸序列由SEQ ID NO3组成的核苷酸序列；和与SEQ ID NO3的互补序列在高度严格条件下杂交的核苷酸序列。
2. —种表达载体在制备用于增加癌症细胞凋亡的药物中的用途， 其中所述表达载体含有选自下组的编码人细胞凋亡-特异性elF-5A多 肽的分离的核苷酸序列由SEQ ID NO: 3组成的核苷酸序列；和与SEQ ID NO: 3的互补序列在高度严格条件下杂交的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了核酸，多肽，以及调节细胞凋亡的方法。具体地，本发明涉及分离和/或纯化的大鼠细胞凋亡-特异性真核生物起始因子-5A(eIF-5A)和脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的核酸及多肽。本发明还涉及使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS调节细胞凋亡的方法，以及用于这种方法中的细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS的反义寡核苷酸及表达载体。
文档编号H01S5/024GK101164624SQ20071018017
公开日2008年4月23日 申请日期2002年7月23日 优先权日2001年7月23日
发明者C·泰勒, D·克利歇, J·C·卡尔森, J·E·汤普森, L·佩特罗夫, M·考普, R·纳拉延辛, T·-W·王 申请人:森尼斯科公司