一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法。
【背景技术】
[0002]蛹虫草又名北冬虫夏草、蛹草、北虫草等，有关研究表明，蛹虫草富含蛋白质、月旨质、糖三大类营养物质，以及多种维生素和微量元素，含有丰富的虫草酸(甘露醇)、虫草素(3’ -脱氧腺苷)、虫草多糖和超氧化物歧化酶(S0D)等生物活性物质。蛹虫草是一种和冬虫夏草同属异种的药食兼用真菌，其主要药用成分与冬虫夏草相同，具有调节免疫、抑制肿瘤、延缓衰老等作用。
[0003]生物活性肽因为高吸收率、低毒、零污染等特点，在医药、食品、畜牧养殖等领域都有广泛应用。Byung等从蛹虫草子座中分离得到分子量为12kDa的小分子蛋白肽，经检测其对尖孢镰刀菌有显著抗菌活性，并能对人乳腺癌和膀胱癌细胞有抑制作用；Ng等从蛹虫草中提取到天然活性肽Cordymin，测定到此多肽分子量为10.90kDa，其对玉米小班病菌、球腔菌、丝核菌、加拿大白色念珠菌都有显著抑制作用；宗静采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶酶解蛹虫草子座制备的蛹虫草多肽具有一定的还原能力。
[0004]在虫草素、虫草多糖等活性成分提取过程中，子座剩余物多被以残渣形式废弃，造成资源浪费及环境污染，且在热水浸提虫草素所得蛹虫草剩余物中，会有一些虫草素、虫草多糖的残留，具有抗氧化、抑菌、提高机体免疫力等功能。因此利用热水浸提虫草素所得蛹虫草剩余物制备具有特定生物学功能的蛹虫草多肽，不仅有利于蛹虫草资源的综合利用，更能进一步挖掘开发蛹虫草的潜在价值。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种联合酶法对蛹虫草多肽的综合利用。本发明以文以蛹虫草提取剩余物为原料，采用酶解法酶解蛹虫草提取剩余物制备多肽，然后用活性炭对蛹虫草HWM剩余物酶解液进行脱色，最后采用葡聚糖凝胶层析对蛹虫草多肽进行分离纯化。
[0006]具体包括以下步骤
一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法，其特征在于:具体包括一下步骤:
(1)蛹虫草蛋白的提取:分别取蛹虫草子座干粉lg于锥形瓶中，加少量蒸馏水，经超声波破碎2h，补加蒸馏水调节料液比为1 g: 20mL，分别在0.05-0.30mol/L的氢氧化钠溶液中，在60°C条件下恒温提取3h ;提取结束后，4000r/min离心15min，离心3次，取上清液测定蛋白质含量，计算蛋白得率；
(2)蛹虫草提取剩余物多肽提取:取蛹虫草剩余物1.0g于锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20.0-100.0mg/mL,用lmol/L盐酸调节溶液pH值至6.5，加入0.01g蜗牛酶，37°C水解3h后，煮沸lOmin使酶灭活；冷却后，用lmol/L氢氧化钠重新调节溶液pH至8.0-12.0，加入碱性蛋白酶2-10%，40-70°C水解5_20h，水解结束，沸水浴lOmin终止酶解反应，抽滤，滤渣烘干至恒重，测定滤液多肽指数； (3)活性炭脱色:精确量取30mL蛹虫草剩余物酶解液于锥形瓶中，用lmol/L的盐酸调节溶液pH值为3.0-9.0，分别加入0.1-1.1%的活性炭，20-45°C条件下脱色15_75min ;脱色结束后，4000r/min离心lOmin，取上清液在450nm处测定其吸光值；
(4)多肽的分离纯化:取等体积的SephadexG-25或SephadexG_15凝胶装柱，以1.0mL上样量上柱，在1.0mL/min流速下用蒸馏水进行洗脱，洗脱过程中采用部分收集器收集多肽流出液。
[0007]所述步骤2中的蜗牛酶可用纤维素酶替换。
[0008]所述步骤2中的碱性蛋白酶可用胃蛋白酶替换。
[0009]蜗牛酶是一种用于细胞破碎的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等二十多种酶；纤维素酶是一种由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和葡萄糖苷酶等组成的复合酶，在分解纤维素时起生物催化作用。考虑蜗牛酶和纤维素酶可以在酶解中起到催化辅助作用。
[0010]本发明具有以下有益效果:
(1)利用热水提虫草素所得蛹虫草剩余物制备具有特定生物学功能的蛹虫草多肽，不仅有利于蛹虫草资源的综合利用，更能进一步挖掘开发蛹虫草的潜在价值。
[0011](2蛋白酶解先加蜗牛酶水解再加碱性蛋白酶水解对蛹虫草剩余物的效果较好，在此组合方式下，酶解液多肽指数为62.20%，蛹虫草水解率为35.72%。
[0012](3)凝胶层析可根据分离物分子大小进行分级分离，操作简单易行。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
具体包括以下步骤
一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法，其特征在于:具体包括一下步骤:
(1)蛹虫草蛋白的提取:分别取蛹虫草子座干粉lg于锥形瓶中，加少量蒸馏水，经超声波破碎2h，补加蒸馏水调节料液比为1 g: 20mL，分别在0.05-0.30mol/L的氢氧化钠溶液中，在60°C条件下恒温提取3h ;提取结束后，4000r/min离心15min，离心3次，取上清液测定蛋白质含量，计算蛋白得率；
(2)蛹虫草提取剩余物多肽提取:取蛹虫草剩余物1.0g于锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20.0-100.0mg/mL,用lmol/L盐酸调节溶液pH值至6.5，加入0.01g蜗牛酶，37°C水解3h后，煮沸lOmin使酶灭活；冷却后，用lmol/L氢氧化钠重新调节溶液pH至8.0-12.0，加入碱性蛋白酶2-10%，40-70°C水解5_20h，水解结束，沸水浴lOmin终止酶解反应，抽滤，滤渣烘干至恒重，测定滤液多肽指数；
(3)活性炭脱色:精确量取30mL蛹虫草剩余物酶解液于锥形瓶中，用lmol/L的盐酸调节溶液pH值为3.0-9.0，分别加入0.1-1.1%的活性炭，20-45°C条件下脱色15_75min ;脱色结束后，4000r/min离心lOmin，取上清液在450nm处测定其吸光值；
(4)多肽的分离纯化:取等体积的SephadexG-25或SephadexG_15凝胶装柱，以1.0mL上样量上柱，在1.0mL/min流速下用蒸馏水进行洗脱，洗脱过程中采用部分收集器收集多肽流出液。
[0014]所述步骤2中的蜗牛酶可用纤维素酶替换。
[0015]所述步骤2中的碱性蛋白酶可用胃蛋白酶替换。
[0016]实施例2 具体包括以下步骤
(1)蛹虫草蛋白的提取:分别取蛹虫草子座干粉lg于锥形瓶中，加少量蒸馏水，经超声波破碎2h，补加蒸馏水调节料液比为1:20 (g:mL)，分别在0.05-0.30mol/L的氢氧化钠溶液中，在60°C条件下恒温提取3h。提取结束后，4000r/min离心15min，离心3次，取上清液测定蛋白质含量，计算蛋白得率。
[0017](2)蛹虫草提取剩余物多肽提取:取蛹虫草剩余物1.0g于锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为30.0mg/mL,用lmol/L盐酸调节溶液pH值至6.5，加入0.0lg蜗牛酶(或纤维素酶)，37°C水解3h后，煮沸lOmin使酶灭活；冷却后，用lmol/L氢氧化钠重新调节溶液pH至10.0，加入碱性蛋白酶(或胃蛋白酶)5%，50°C水解10h，水解结束，沸水浴lOmin终止酶解反应，抽滤，滤渣烘干至恒重，测定滤液多肽指数。
[0018](3)活性炭脱色:精确量取30mL蛹虫草剩余物酶解液于锥形瓶中，用lmol/L的盐酸调节溶液pH值为3.5，分别加入0.8%的活性炭，20-45°C条件下脱色15_75min。脱色结束后，4000r/min离心lOmin，取上清液在450nm处测定其吸光值。
[0019](4)多肽的分离纯化:取等体积的SephadexG-25或SephadexG_15凝胶装柱，以1.0mL上样量上柱，在1.0mL/min流速下用蒸馏水进行洗脱，洗脱过程中采用部分收集器收集多肽流出液。
[0020]实施例3 具体包括以下步骤
(1)蛹虫草蛋白的提取:分别取蛹虫草子座干粉lg于锥形瓶中，加少量蒸馏水，经超声波破碎2h，补加蒸馏水调节料液比为1:20 (g:mL)，分别在0.05-0.30mol/L的氢氧化钠溶液中，在60°C条件下恒温提取3h。提取结束后，4000r/min离心15min，离心3次，取上清液测定蛋白质含量，计算蛋白得率。
[0021](2)蛹虫草提取剩余物多肽提取:取蛹虫草剩余物1.0g于锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为30.0mg/mL,用lmol/L盐酸调节溶液pH值至6.5，加入0.0lg蜗牛酶(或纤维素酶)，37°C水解3h后，煮沸lOmin使酶灭活；冷却后，用lmol/L氢氧化钠重新调节溶液pH至10.0，加入碱性蛋白酶(或胃蛋白酶)8%，50 °C水解10h，水解结束，沸水浴lOmin终止酶解反应，抽滤，滤渣烘干至恒重，测定滤液多肽指数。
[0022](3)活性炭脱色:精确量取30mL蛹虫草剩余物酶解液于锥形瓶中，用lmol/L的盐酸调节溶液pH值为3.5，分别加入0.8%的活性炭，20-45°C条件下脱色15_75min。脱色结束后，4000r/min离心lOmin，取上清液在450nm处测定其吸光值。
[0023](4)多肽的分离纯化:取等体积的SephadexG-25或SephadexG_15凝胶装柱，以1.0mL上样量上柱，在1.0mL/min流速下用蒸馏水进行洗脱，洗脱过程中采用部分收集器收集多肽流出液。
【主权项】
1.一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法，其特征在于:具体包括一下步骤: (1)蛹虫草蛋白的提取:分别取蛹虫草子座干粉lg于锥形瓶中，加少量蒸馏水，经超声波破碎2h，补加蒸馏水调节料液比为1 g: 20mL，分别在0.05-0.30mol/L的氢氧化钠溶液中，在60°C条件下恒温提取3h ;提取结束后，4000r/min离心15min，离心3次，取上清液测定蛋白质含量，计算蛋白得率； (2)蛹虫草提取剩余物多肽提取:取蛹虫草剩余物1.0g于锥形瓶中，加入蒸馏水调节底物质量浓度为20.0-100.0mg/mL,用lmol/L盐酸调节溶液pH值至6.5，加入0.0lg蜗牛酶，37°C水解3h后，煮沸lOmin使酶灭活；冷却后，用lmol/L氢氧化钠重新调节溶液pH至8.0-12.0，加入碱性蛋白酶2-10%，40-70°C水解5_20h，水解结束，沸水浴lOmin终止酶解反应，抽滤，滤渣烘干至恒重，测定滤液多肽指数； (3)活性炭脱色:精确量取30mL蛹虫草剩余物酶解液于锥形瓶中，用lmol/L的盐酸调节溶液pH值为3.0-9.0，分别加入0.1-1.1%的活性炭，20-45°C条件下脱色15_75min ;脱色结束后，4000r/min离心lOmin，取上清液在450nm处测定其吸光值； (4)多肽的分离纯化:取等体积的SephadexG-25或SephadexG_15凝胶装柱，以1.0mL上样量上柱，在1.0mL/min流速下用蒸馏水进行洗脱，洗脱过程中采用部分收集器收集多肽流出液。2.根据权利要求1所诉的一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法，其特征在于:所述步骤2中的蜗牛酶可用纤维素酶替换。3.根据权利要求1所诉的一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法，其特征在于:所述步骤2中的碱性蛋白酶可用胃蛋白酶替换。
【专利摘要】<b>本发明公开了</b><b>一种联合酶法对蛹虫草多肽的提取方法本发明以文以蛹虫草提取剩余物为原料，采用酶解法酶解蛹虫草提取剩余物制备多肽，然后用活性炭对蛹虫草HWM剩余物酶解液进行脱色，最后采用葡聚糖凝胶层析对蛹虫草多肽进行分离纯化。本发明利用热水提虫草素所得蛹虫草剩余物制备具有特定生物学功能的蛹虫草多肽，不仅有利于蛹虫草资源的综合利用，更能进一步挖掘开发蛹虫草的潜在价值。本发明蛋白酶解先加蜗牛酶水解再加碱性蛋白酶水解对蛹虫草剩余物的效果较好，在此组合方式下，酶解液多肽指数为62.20%，蛹虫草水解率为35.72%。本发明凝胶层析可根据分离物分子大小进行分级分离，操作简单易行。</b>
【IPC分类】C12P21/06
【公开号】CN105349606
【申请号】CN201510939303
【发明人】陈喜军
【申请人】黑龙江众生生物工程有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月16日