松弛素肽合成的制作方法

专利名称：松弛素肽合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽合成，特别是肽激素的合成。本发明尤其涉及胰岛素家族肽的合成，特别是松弛素(relaxin)的合成。
背景技术：
松弛素(RLX)由FrederickHisaw[Hisaw, F. (1926) Experimental relaxation of the pubic ligament of the guinea pig. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 23,661-663]于 1926年发现，其作为能够松弛骨盆韧带并调节雌性生殖道功能的底物。松弛素家族的肽类包括松弛素-I (RLXl)、松弛素-2 (RLX2)和松弛素_3 (RLX3)。松弛素肽类属于较大家族的胰岛素样肽类(insulin like peptides，INSL)。该肽家族包括胰岛素和胰岛素样肽3、4、5和
6。这些肽类具有高度的结构相似性。除雌性生殖道功能以夕卜，已知松弛素参与一系列的医疗病症(medicalconditions)，例如其参与心脏保护，如在 Samuel，C. S. and Hewitson，T. D. (2006)Relaxinin cardiovascular and renal disease ；Kidney Int.69，1498—1502 ;Bani， D. ， Nistri，S. ， Bani Sacchi, T.and Bigazzi, M. (2005)Basic progress and future therapeuticperspectives of relaxin in ischemic heart disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1041，423-430 ；SamueI, C. S.，Du，X. J.，Bathgate，R. A. D. and Summers, R. J. (2006) “Relaxin”thestiffened heart and arteries the therapeutic potential for relaxin in thetreatment of cardiovascular di sease.Pharmacol. Ther. 112，529—552 ;Dschietzig，T.，Bartsch，C.，Baumann，G. and Stangl, K. (2006) Relaxin-a pleiotropic hormoneand its emerging role for experimental and clinical therapeutics. Pharmacol.Ther. 112，38-56 中所公开的；其参与纤维变性，如在 Bathgate，R. A. D.，Hsueh，A. J. andSherwood，0. D. (2006)Physiology and molecular biology of the relaxin peptidefamily. In Physiology of Reproduction. (Knobil，E. and Neill, J. D.，Eds)，679-770.Elsevier, San Diego ；Sherwood, 0. D. (2004)Relaxins physiological roles and otherdiverse actions. Endocr. Rev. 25, 205-234 ；Samuel, C. S. (2005) Relaxin antifibroticproperties and effects in models of disease.Clin. Med. Res. 3,241-249 中所公开的；其参与过敏反应，如在 Bani, D. (1997) Relaxin apleiotropic hormone. Gen.Pharmacol. 28，13-22.中所公开的;其参与癌症，如在 Silvertown, J. D.，Summerlee,A. J. and Klonisch, T. (2003)Relaxin-Iike peptides in cancer. Int. J. Cancer 107，513-519 ；Kamat, A. A.，Feng, S.，Agoulnik，I. U.，Kheradmand，F.，Bogatcheva，N. V.，Coffey, D.，Sood，A. K.and Agoulnik，A. I. (2006)The role of relaxin in endometrialcancer. Cancer Biol. Ther. 5，71-77中所公开的；且其参与创伤愈合，如在Yamaguchi，Y. and Yoshikawa, K. (2001)Cutaneous wound healing an update. J. Dermatol. 28,521-534 ；113 Wyatt, T. A. , Sisson, J. H. , Forget, M. A. , Bennett, R. G. , Hamel, F. G. andSpurzem,J. R. (2002)Relaxin stimulates bronchial epithelial cell PKA activation,migration, and ciliary beating, Exp.Biol. Med. (Maywood)227,1047-1053 ；Casten,G. G. and Boucek, R. J. (1958)Use of relaxin in the treatment of scleroderma. J. Am.Med. Assoc. 166,319-324 中所公开的。RLX2其他的治疗应用被认为与它控制胶原更新(collagen turnover)的能力有关，如在 Samuel CS, Hewitson TD, Unemori EN, Tang ML, Cell Mol Life Sci. 2007,64,1539-57. Drugs of the future :the hormone relaxin 中所公开的。RLX2潜在地具有宽范围的治疗应用，对于其在研究和用于治疗目的的应用，存在着显著的需求。由于对生产或分离其他松弛素存在着困难，因此它们的治疗潜能没有得到普遍研究。RLX具有两个肽链，通常称为A链(RLXA)和B链(RLXB)。这些链(A链和B链)通过两个分子间半胱氨酸桥连接，并且链A包含另外的分子内二硫键。链的构象排布是松弛素，尤其是RLXl和RLX2的重要特征，并且两个链必须通过适当的二硫键连接，以显示出适当的生物活性。此外，RLXB通常在水溶液中高度不溶。RLXB的不溶性和确保形成适当二硫键的需要意味着通过随机链结合的合成是非常困难的，并且使得RLXB如通过色谱方法的纯化非常困难，如在 J.-G. Tang et al, Biochemistry 2003，42，2731-2739 ；ffade, J. D.,和 Tregear, G. ff. (1997) Relaxin. Methods EnzymoI. 289,637-646 中所公开的。利用重组DNA技术生产松弛素的方法，已在US-A-4758516和US-A-4758516的分案US-A-5023321中公开。在这些专利中，与用于利用重组DNA技术合成肽类的方法一起，公开了用于表达人前松弛素原(前原松弛素，preprorelaxin)和其亚基(subunits)的基因和DNA转移载体(DNAtransfer vectors),包括用于表达人松弛素原(prorelaxin)和A链、B链和C链的基因和转移载体。US-A-5464756公开了用于将一个肽切割为两个多肽组分的方法，其通过用切割试剂处理还原的游离半胱氨酸形式的多肽，并特别是培养包含编码该多肽并在待切割位置处具有至少一个Asp密码子的DNA的细胞，以致在宿主细胞培养中表达DNA以产生多肽，并用稀酸处理游离-半胱氨酸形式的多肽，以产生所期望的切割。重组DNA技术可能是冗长和复杂的，并且不能满足用于大规模生产松弛素。此外，因为在该技术中使用的材料是基于动物的，通过这样的方法生产的松弛素的使用，可能会在宗教地区或因为道德原因而被拒绝，限制通过该方式生产的松弛素产品的应用。松弛素的化学合成已普遍证明是有问题的。RLXl的化学合成是未知的并因此也无法研究合成RLXl的可能治疗应用。E.Bullesbach and C.Schwabe, Journal Biol. Chem. 1991，266，10754-10761 ;E. Bullesbach and C. Schwabe, J. Biol. Chem. 2005,280,14586-14590 公开了 RLX2 的化学合成。该方法包括两个单独链的固相合成，和它们的位点定向结合(组合，combination),其保护特定的半胱氨酸残基，以确保预定半胱氨酸残基结合而形成特定的二硫键。在链组装之后，需要要求施加氟化氢的两个反应步骤和用于位点定向链结合的三个反应步骤，用 于完成RLX2的合成。然而，该方法非常费力，具有较小的产率，并且不合乎期望地要求使用高毒性和危险的氟化氢。US-A-4835251公开了用于结合人松弛素的A链和人松弛素的B链的方法，通过在7至12的pH下在氧(气氛)下将还原游离-半胱氨酸形式的A链和还原游离-半胱氨酸形式的B链在水性介质中混合以产生生物活性的人松弛素，其中B链，而非产物，是变性的。然而对于生产合成人松弛素的尝试还未得到满意的结果。人松弛素-I的链B(RLXlB)和人松弛素-2的B链(RLX2B)以及中间体小肽和片段是高度不溶的或疏水的(hydrophobic),并在 RLXlB 和 RLX2B 的序列 Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys 周围延伸妝链中已遇到困难。固相合成路线包括非常难的偶联(coupling)和脱保护步骤。另外，由于在松弛素合成期间B链的不溶性导致不期望的沉淀或B链的未溶解，对于RLXlB和RLX2B与相应松弛素A链，在形成适当的链间二硫键结合中遇到了困难。

发明内容
存在对于不利用重组DNA技术并且不包括冗长或复杂过程或使用危险试剂生产胰岛素型肽类(例如，松弛素类，尤其是人松弛素类)的方法的需求。另外，不采用重组DNA技术生产松弛素将提供材料的来源，且尤其利于对潜在治疗应用的研究。我们现在已经开发了用于生产胰岛素型肽类的合成路线，其利用胰岛素型肽类和包含至少一个甲硫氨酸亚砜残基的松弛素(尤其是松弛素I和松弛素2)、松弛素型产品和它们的前体的B链的(例如，松弛素的B链)的较高溶解性。尤其是，本申请提供了 RLX2(其结构在图2中示出)改进的化学合成，以及RLXl (其结构在图 I 中示出)、RLX1B、RLX2B 和 Met (0)24_RLX1B 和 Met (0) 25-RLX2B (其结构分别在图5和图6中示出)的新化学合成。在一个实施方式中，提供了用于生产具有至少两个肽链A和B的胰岛素型肽的方法，其中链A和链B通过至少一个二硫键(disulphide link)连接，该方法包括，提供肽链A和链B (每种链包含至少一个半胱氨酸残基并且链A和链B中的至少一个包含氧化的甲硫氨酸残基)，使链A和链B在(一定)条件下结合，以致链A中的至少一个半胱氨酸残基和链B中的至少一个半胱氨酸残基结合以使链连接在一起，并还原氧化的甲硫氨酸残基以产生胰岛素型肽。适当地，胰岛素型肽为松弛素，例如松弛素I和松弛素2，并且链A为松弛素A链而链B为松弛素B链。适当地，氧化的甲硫氨酸残基为甲硫氨酸氧化物残基，且残基在B链中。在另一个实施方式中，提供了用于生产生物活性松弛素的方法，包括提供具有至少一个分子内二硫键的松弛素A链、以及其中B链中至少一个甲硫氨酸残基被氧化的松弛素B链，B链可选地包含分子内二硫键，使A链和B链在(一定)条件下结合，以致在A链和所述B链之间形成至少一个分子间二硫键，以使链连接在一起，并还原氧化的甲硫氨酸残基以产生松弛素。在本申请的一个方面，松弛素为人松弛素，在特定的方面，松弛素为人松弛素1，其中B链为Met (0) 24RLXlB或人松弛素2，其中B链为Met (0) 25RLX2B。在另一个方面，含有一个或多个甲硫氨酸亚砜残基的松弛素的B链表现出比不含 有甲硫氨酸亚砜残基的松弛素的相应B链更高的溶解性。尤其是，人Met (0)24-RLXlB和人Met (O) 25-RLX2B分别比RLXlB和RLX2B链具有更高的溶解性。甲硫氨酸亚砜类似物的更高溶解性，使得能够易化链间结合反应中松弛素和B链的合成以及纯化和应用，以产生生物活性松弛素。适当地，链间结合反应在室温下在水溶液中于中性或期望地碱性pH下进行。链间反应可在存在氧化剂或还原剂的条件下进行。B链的还原形式具有游离半胱氨酸基团，其可用于催化链间反应，并可以不需要单独的氧化剂或还原剂。在另一个方面，A链以至少与B链化学计量相同并期望地以化学计量过量的水平出现，期望地，以摩尔计，高于I : I至3 1，并优选I. 01至2 I。氧化的甲硫氨酸残基可以利用任何适于在肽合成中还原且期望地对甲硫氨酸氧 化物残基的还原特异的已知还原剂进行还原。优选碘化物，例如碘化铵。在用于实施链间反应的另一种实施方式中，松弛素A链适当地以双环形式存在，而甲硫氨酸氧化的松弛素B链以环状形式或以完全还原形式存在。在另外的方面中，提供了合成生产的人松弛素I (其结构在图I中示出)，以及其药用盐、衍生物或前药。在另外的方面，本申请公开了用于生产具有至少两个肽链，A和B的胰岛素型肽的方法，链A和链B通过至少一个二硫键连接并且链B具有至少一个氧化的甲硫氨酸残基，该方法包括提供肽链A和链B，每种链含有至少一个半胱氨酸残基并且链B包含氧化的甲硫氨酸残基，使链A和链B在(一定)条件下结合，以致链A中的至少一个半胱氨酸残基和链B中的至少一个半胱氨酸残基结合以使链连接在一起，以产生具有氧化的甲硫氨酸残基的胰岛素型肽。在另外的实施方式中，本申请进一步提供了生物活性、合成的胰岛素型多肽，其包含一个或多个甲硫氨酸亚砜残基，例如具有在图3中说明的序列的人Met (O)24-松弛素I和具有在图4中说明的序列的人Met(O)25-松弛素2，以及其药用盐、衍生物、或前药。在一方面，合成胰岛素型多肽为松弛素。在另外的方面，合成胰岛素型多肽为人松弛素。松弛素A链可以通过一系列方法生产，可选地包括在合成肽链中使用已知的保护基团，以及链适当地经受环化反应，其中形成一个或多个分子内二硫键，例如在图9至14中所示出的。本申请进一步提供了合成嵌合多肽，包含合成松弛素的全部或部分多肽序列和非来源于松弛素的多肽序列。本申请还提供了合成多肽，包含合成松弛素的全部或部分多肽序列，优选合成松弛素的B链，并可选包含一个或多个甲硫氨酸亚砜残基。本文中描述的实施方式和方面的胰岛素型肽类适用于治疗应用。本申请还提供了合成胰岛素型多肽，包括人松弛素、和合成多肽，以及其药用盐、衍生物或前药，其用于通过治疗来处理人或动物体的方法中，尤其是用于提供心脏保护、治疗心脏疾病、纤维变性、过敏反应、癌症的一种或多种，以及伤口愈合和要求控制胶原更新的疾病治疗中。在另外的方面，提供了一种药物组合物，包含合成多肽，优选合成松弛素，例如合成松弛素-I、合成松弛素-2和含有至少一个甲硫氨酸亚砜残基的合成松弛素、以及药用载体。
含有甲硫氨酸亚砜残基的胰岛素型多肽与其不具有亚砜的类似物相比更高的溶解性，提供了更大的配制灵活性，使得它们尤其适用于配制药物组合物，并可提供增强的生物活性以及具有期望的性质，以容许形成合成松弛素。适当地，本文中表示为“Met (0)”的甲硫氨酸亚砜残基，可利用本领域中已知的N-保护的Met (0)衍生物在肽链中在要求的位置处引入。


本发明和代表性合成路线结合附图进行说明，在附图中图I显示合成人松弛素I (ShRLXl)的结构(序列)；图2显示合成人松弛素2 (shRLX2)的结构(序列); 图3显示B-Met (0) 24_合成人松弛素I (B_Met (0) 24ShRLXl)的结构(序列)；图4显示B-Met (0) 25_合成人松弛素2 (B-Met (0) 25shRLX2)的结构(序列)；图5显示DMSO氧化；还原的(线性)Met (O)24-人松弛素IB链[化合物9，Met(0)24-shRLXlB]、氧化的(环状)Met (O)24-人松弛素IB链[化合物10，Met(0)24-shRLXlB]和氧化的(环状)人松弛素IB链[化合物11，shRLXlB]的合成；图6显示还原的(线性)Met (O)25-人松弛素2B链[化合物13，Met (0)25_shRLX2B]、氧化的(环状)Met (0)25-人松弛素2B链[化合物14，Met (0) 25-shRLX2B]和氧化的(环状)人松弛素2B链[化合物15，shRLX2B]的DMSO氧化合成；图7显示碘氧化；氧化的(环状)Met (O)24-人松弛素IB链[化合物10，Met(O) 24-shRLXlB]的合成；图8显示氧化的(环状)Met (0) 25_人松弛素2B链[化合物14，Met (0) 25_shRLX2B]的合成；图9显示双环RLXlA[化合物24]的合成，并应用S-Mmt和Trt保护基团。图10显示双环人松弛素2链A[化合物28 ;双环RLX2A]的合成，并应用S-Mmt和Trt保护基团；图11显示双环人松弛素I链A[RLX1A链；化合物24 ;双环RLX1A]的合成，并应用S-Mmt和Trt保护基团；图12显示双环人松弛素2链A[化合物19 ;双环RLX2A]的合成，并应用S-Acm和Trt保护基团；图13显示由线性链松弛素I链A的DMSO氧化合成双环合成人松弛素I链A [化合物24、35-36 ;双环RLX1A]的混合物；图14显示由线性链松弛素2链A的DMSO氧化对合成人松弛素2链A [化合物28、39-40 ;双环RLX2A]的混合物的合成；图15显示用于合成RLXs A链和B链的三苯甲基和二苯甲基型树脂的实例；图16显示由双环RLXlA和还原的Met (0) 24-RLXlB链的链结合合成Met (0) 24_松弛素l[Met(0)24-RLXl ;化合物3]和松弛素I [RLX1 ;化合物I]；图17显示由双环RLXlA和环状RLXlB链以及少量的线性RLXlB链的链结合合成Met (O)24-松弛素 l[Met(0)24-RLXl]；图18显示由双环RLX2A和还原的Met (0) 25-RLX2B的链结合合成Met (0) 25-RLX2]和 RLX2 ；图19显示由双环RLX2A和环状Met (0) 25-RLX2B以及少量的线性RLX2B链的链结合合成人松弛素2 [RLX2 ;化合物2]和Met (0) 25_人松弛素2 [Met (0) 25-RLX2]；[化合物4]；
具体实施例方式衍生物可包括如图5至8中说明的以及如本文所提供的Fmoc-Met (0) -0H、Boc-Met(0)-OH 和 Trt-Met(0)-0H。制备包含Met (0)的RLXB可适当地通过Met残基的树脂上氧化(on-resinoxidation)进行,如在图5和6中说明的。该方法适当地采用氧化剂和溶剂进行。在一个特定的方面，氧化剂包括过氧化氢和过氧2-氯苯甲酰(2-chlorobenzoyl peroxide)。适当地采用有机溶剂如四氢呋喃。图5和图6说明合成Met(O)24-人松弛素IB链[Met (0) 24_hRLXlB]以及Met (0)25-人松弛素2B链[Met (0) 25-hRLX2B]相应序列的实例。RLX28可在肽链的25位、在肽链的4位或如果要求在4位和25位两个位置处包含Met (O)。仅在4位包含Met(O)的RLX2B与非氧化类似物相比也显示出更高的溶解性。在一个方面，本申请使得能够在松弛素中形成正确的分子内和分子间二硫键。氧化半胱氨酸巯基(硫醇基，thiol group)以形成分子内二硫键可利用任何适合的氧化剂实现，但优选利用 DMSO (J. P. Tam, et al. J. Am. Chem. Soc. 1991，113,6657-6662)，尤其是在RLXA链和RLXB链未被保护的情况下，例如，如在图5和6中所示的，并且在以被保护或部分保护的肽进行氧化的情况下，如在图7-12所示的，使用碘。适当地纯化松弛素的A链和B链。半胱氨酸残基经受的用以形成分子内二硫键的反应，适当地氧化反应，可在单独的A链和/或B链纯化之前或之后进行。在肽的合成中，如果要求，可采用已知的保护基团。保护基团可在形成二硫键之前除去，或可被保留并可与保护形式的肽形成二硫键。肽合成可采用的标准保护基团，例如在Barany and Merrifield在“The Peptides”Vol. 2, Ed. Gross and Minehoffer, AcademicPress, pp. 233-240(1980)中公开，其公开内容并入文中。A链和B链两者之一或两者的合成可在固体载体上进行。可在将肽从树脂上切割后或如果要求可与其从树脂上切割的同时，在树脂上进行二硫键的形成。适当地，可在肽组装过程中采用任何巯基保护领域已知的保护基团保护半胱氨酸残基的巯基。优选使用4-甲氧基三苯甲基(4-methoxytrityl) (Mmt) (Barlos etal. Int J Pept Protein Res. 1996,47,148-53)、三苯甲基(Trt)以及乙酸氨基甲基(acetamidomethyl) (Acm)基团。除了由于氧化甲硫氨酸残基的存在而出乎意料地提高B链的溶解性以外，可以实 现A链和B链溶解性的进一步提高。一旦分子内二硫键已形成，环状链的洗脱与相应还原链相比在分析和制备HPLC上则更快，其他杂质的洗脱也更快。具有分子内二硫键(即环状INSL肽类)的A链和B链，与相应的线性A链和B链相比，可获得更高水平的纯度。因此，可从环状INSL肽类中获得比从单独的A链和B链所获得的更高纯度。在特定方面，环状INSL肽类以高于95%、高于96%、高于97%、高于98%、和高于99%纯度获得。对于链A中分子内二硫桥的选择性形成，可使用任何正交巯基保护基团对(orthogonal thiol protecting group pair)，但优选 Trt/Mmt、Trt/Acm 和 Mmt/Acm 中的一个。制备RLXl和RLX2的双环链A的实例在图9_12中显示。在使用Trt/Mmt对的情况下,S-Mmt基团可被选择性地除去,接着在释放的巯基官能团(thiol functions)之间通过用适当的氧化剂(如DMSO或空气)氧化形成二硫键,如图9至10所示。S-Trt-基团的去除以及释放的巯基官能团的氧化适当地导致第二个二硫键的形成。优选第二个二硫键通过用碘氧化去除S-Trt或S-Acm基团而产生。通过利用用于A链的固相合成的2_氯三苯甲基(2-chlorotrtyl)树脂(K. Barlos et al, Int. J. Pept.Protein Res. 1991，37，513-520)或具有相似酸敏感性的树脂，S-Mmt官能通过弱酸解的选择性去除，适当地与受保护肽从树脂上切割同时进行。 对于氧化去除S-Trt-官能随后形成二硫键，可以使用任何本领域中已知的氧化齐U，但优选碘。在采用Trt/Acm对的情况下，可在存在S-Acm基团的情况下，通过用适当的酸溶液酸解处理肽树脂而选择性地去除S-Trt基团，酸溶液优选三氟乙酸，在二氯甲烷中以10-100%浓度的三氟乙酸酸解(acidolytic)并适当地加入清除剂(净化剂，scavenger),清除剂优选以有效比例的硫醇、硅烷和水。然后适当地通过用本领域中已知的任何氧化剂，优选用DMSO或空气进行氧化来实现第一个二硫键的形成。第一个二硫键的形成还可通过利用用于氧化去除(如果存在)S-Trt-官能的碘来实现。这可在受保护的肽从树脂上切割之前、之中或之后发生(K. Barlos et al,Int. J. ofPeptide&Protein Research,1991,38,562-568)。适当地，且不期望被任何理论约束，如果碘解(iodolysis)在低温如0°C至15°C进行，所期望的二硫键在存在S-Acm基团的条件下选择性地产生。适当地，反应在亲脂性(Iypophilic)溶剂中进行，优选氯化烃，例如二氯甲烷，和氟化醇如三氟乙醇，以及弱酸如乙酸和三氟乙酸，如图11-12中说明的。在另外的实施方式中，第二个二硫键可通过在反应混合物中加入极性组分如乙酸、甲醇、三氟乙醇、三氟乙酸或/和水在更加极性溶剂中碘解(iodolysis)而形成。氧化期间，优选碘解(iodolysis)期间的温度，不是关键性的，但优选在5至25°C范围内进行。适当地，松弛素在固相中合成。在优选的实施方式中，可采用任何本领域中已知的树脂，但优选合成在三苯甲基型树脂或连接物上进行，例如，如图15中所示的2-氯三苯甲基氯树脂(K. Barlos, et al.，Tetrahedron Lett. , 1989, 30, 3943 ；K. Barlos, et al.，Tetrahedron Lett. ,1989, 30, 3947 ；K. Barlos, et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 1991,30, 590 ;K. Barlos, et al. , Int. J. Pept. Protein Res. ,1991,37,513 ；K. Barlos, et al.，Int. J. Pept. Protein Res.，1991，38，562)和图 15 中的 4-甲基二苯甲基溴树脂(K. Barloset al, Liebigs Annalen der Chemie(1989)，(10)，951-5)。已知采用高价低负载的聚苯乙烯-Peg-树脂用于相应的合成(E. Bullesbach andC. Schwabe. J. Biol. Chem. 266，17，10754-10761，1991)。然而，这些树脂有半胱氨酸易被外消旋化的缺点。由于需要将酯化作用和链组装期间由Cys-外消旋化形成的D-非对映异构肽分离，这导致复杂化和显著更高的成本。另外，合成肽的切割不能由已知的树脂定量，导致更高的生产成本。在另外的实施方式中，提供了利用三苯甲基型树脂或连接物，例如2-氯三苯甲基氯树脂和4-甲基二苯甲基溴(4-methylbenzhydryl-bromide)树脂,用于在固相合成中生产RLXlA或RLX2A的方法。本申请中，描述了使用这些树脂用于制备RLXlA和RLX2A，这二者在其羧基-末端位置包含Cys残基。有益地，这些树脂高度优于本领域中使用的其他树脂，因为经观察没有或极少有半胱氨酸残基外消旋化。适当地形成羧酸酯(或盐)物质，而不是酸类物质，用于与树脂反应，尤其是与三苯甲基和二苯甲基型树脂反应。另外，可实现从树脂定量切割肽(Fujiwara et al, Chem. Pharm. Bull. 42，724，1994)。在形成松弛素中，A链和B链在有效形成分子间二硫键并提供所期望松弛素构象的条件下结合以提供生物活性。一般而言，且不期望被任何理论约束，在形成链间-S-S-键时，包含分子内二硫键的环肽类(参见图5至8中的化合物10、11、14和15)比相应线性肽反应更快。环肽类将显得像活化的环肽类一样反应，并以更简易的方式经受与第二个链的链间连接。适当地，链A的线性链肽类用例如DMS0、空气或其他氧化剂氧化以产生环状链A异 构体的混合物，如在图13和14中说明的。环状松弛素链B可类似地由线性松弛素链B产生。松弛素可由双环链A的异构体的混合物或任何纯双环异构体与环状或线性形式的链B反应形成。适当地，链A和链B之间的反应或相互作用在存在氧化剂或还原剂的条件下进行。其中线性链A以及尤其线性链B存在时，虽然可能是优选的但不要求加入另外的氧化剂或还原剂。在另外的实施方式中，链A和链B之间的反应/相互作用在存在可优选作为催化剂的还原剂的条件下进行。不期望被任何理论约束，认为二硫桥还原为游离巯基并建立环状和链间连接肽的平衡，其导致热力学更稳定的产物，其为天然的RLX蛋白，如图18和19中所示。作为还原剂，可使用任何有机或无机还原剂，但采用有机硫醇类，如还原的链A、还原的链B、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、苯硫酚、苯甲硫醚、吡啶-硫醇、3或5硝基吡啶-2-硫醇、节硫醇(benzyImercaptam)、二硫苏糖醇。在另外实施方式中,优先采用还原的链A、还原的链-B或其混合物作为催化剂。催化剂可在混合链A和链B之前、之后或之中加入到混合物中。催化剂可以以多种量加入以建立平衡混合物，但可以以基于A链和B链的量计算的1至5%摩尔比的量加入。在折叠反应(其中A-连和B链结合)期间的温度不是关键的，但可以是大约室温，例如20至25°C。适当地，溶剂为水溶液或水和有机溶剂和/或碱(bases)的混合物。用于链结合的溶液pH不是关键性的，但优选碱性并期望为10至11。还原的链A在存在适当氧化剂的条件下适当地与链B结合，以促进期望RLX的形成。适当地，反应通过形成单环和双环链A的混合物而进行。在另外的实施方式中，可使用氧化的链A，因为通常该反应将比采用还原的链A更加快速。在一个方面，双环和单环链A和链B的混合物反应以提供天然RLXs。在另外的实施方式中，如图16和18中所示，通过加入作为氧化剂以促进反应的DMS0，例如15% DMS0，使双环链A与还原的链B结合。链A和链B的摩尔比可为I : I至2 1，或链A和链B的摩尔比可为I. I I摩尔。伴随增加过量的链A，反应速度提高。适当过量的双环和单环链A在纯化期间回收，例如通过HPLC。其中不采用氧化剂如DMSO时，链A与链的摩尔比可至少为4 I。
在另外的实施方式中，其中松弛素A链或松弛素B链作为链间折叠反应的副产物形成，副产物经受氧化以提供氧化的甲硫氨酸类似物，其适当地能够作为反应物参与进一步的链间折叠反应。适当地，包含Met(O)的RLXs用还原剂如碘化铵还原成天然蛋白。碘化铵是有优势的，因为其选择性地使Met(O)还原成Met，而保持分子内和分子间半胱氨酸桥完整。还原可在A链和/或B链纯化之前或之后进行。适当地，反应几乎是定量的。作为溶剂，可以使用水溶液或水与有机溶剂的混合物。RLX1A、RLX2A、RLX1B、RLX2B、RLX1、RLX2、Met (0) 24-RLXl 和 Met (0) 25-RLX2 的纯化可通过HPLC利用任何适合溶剂而进行，但可采用含有TFA、甲酸和乙酸的水和乙腈。纯化的RLX1A、RLX2A、RLX1B、RLX2B、RLX1、RLX2、Met (0) 24-RLXl 和 Met (0) 25-RLX2可适当地通过冷冻干燥或沉淀分离。如果必要，适当地利用离子交换树脂如Dowex进行脱盐。治疗应用本文中制备的所有松弛素类似物已被测试并已被证明具有类似于重组制备的松弛素-2的那些(生物活性)的生物活性。根据本文中所描述的方法制备的松弛素化合物的治疗应用，包括治疗膜腺炎；参见Cosen-Binker LI et al,World K. Gastroenterol. 2006,12 :1558-1568 ;先兆子痫(preeclampsia);参见 Mohaupt, M. Mol. Aspects Med. 2007,28:169-191 ;关节炎；参见 K. Santora et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007, 322 :887-893 ;子宫内膜血管发生(endometrial angiogenesis) ；J. E. Girling et al, Angiogenesis, 2005 ；8 :89-99 ;急性心力衰竭；参见 S. L. Teichman et al, Heart fail. Rev. 2009 ； 14 :321-329 ；心脏过敏性反应并作为一种新的抗过敏药物；参见Daniele Bani, et al. , Curr AllergyAsthma Rep. 2006 Feb. ;6 (I) :14_9，16476189 ;通过降低肾间质纤维化减慢肾病的发展；参见 S L Garber, YMirochnik, et al. ；Kidney Int. 2001Mar ；59 (3) :876-82,11231342 ；年龄相关的肺纤维化发展；参见 Chrishan S Samuel, et al.，FASEB J. 2003Jan ；17(1)121-3，12424226 ;哮喘样反应；参见 D Bani, et al. , Endocrinology. 1997May ；138(5)1909-15,9112386 ;控制人乳腺癌细胞的生长；参见 M. Bigazzi et al, Cancer. 1992AugI ；70(3) :639-43,1320450 ;硬皮病的管理；R.K.Winkelmann，et al. , Semin Cutan MedSurg. 200IMar ；20(1) :27_37，11308134 ;以及焦虑、肥胖症和涉及纤维变性疾病的治疗；参见Emma T. van der Westhuizen et al,Drug Discovery Today,Volume 13,Issues 15-16,August 2008, Pages 640-651。本申请引用的公开特定治疗应用和其使用方法的所有参考文献，均以其全部内容通过参考并入文中。本申请通过下面的非-限制性实施例进行说明。实施例实施例I人RLX1A、RLX2A、Met (0)24-RLXlB 和 Met (0)25-RLX2B 以及它们受保护的片段的固
相合成。一般过程。Al.加载2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂的制备；一般过程
CTC-Cl 树脂(IOOg ;加载 I. 6mmol/g)装入 2L肽反应器中，并用 700ml DCM在 25°C溶胀(swell) 30min。将树脂排空(drain),然后加入IOOmmol Fmoc-氨基酸和300mmol 二异丙基乙胺(diisopropylethylamine, DIEA)在500ml 二氯甲烧(DCM)中的溶液。混合物在氮气下在25°C的温度下搅拌2小时。然后，将保留在2-CTC树脂上的活性位点通过加A IOml MeOH而包封(end-cap) I小时。将树脂排空，并用400ml 二甲基甲酰胺(dimethylformamide, DMF)清洗2次。将树脂排空，然后用500mL 25体积％的哌啶处理30分钟两次。然后树脂用500ml DMF清洗四次。树脂通过用500ml异丙醇(IPA)清洗3次消溶胀(de-swell,退溶胀)。干燥树脂至恒重。树脂上 加载70_95mmol使用的氨基酸。A2.加载 4_ 甲基二苯甲基溴(4-methylbenzhydryl bromide) (MBH)树脂的制备，一般过程MBH-Br树脂(100g ;190mmol)装入2L肽反应器中，并用700mlDCM在25 °C溶胀30min。将树脂排空，然后加入Fmoc-氨基酸和DIEA在500ml DCM中的溶液。混合物在氮气下在25°C温度下搅拌6小时。然后，将保留在MBH树脂上的活性位点通过加入IOml MeOH包封24小时。将树脂排空，并用400ml DMF清洗2次。将树脂排空，然后用500mL25体积％的哌啶处理30分钟两次。然后树脂用500ml DMF清洗四次。树脂通过用500ml IPA清洗3次消溶胀。真空(15Torr，25°C)下干燥树脂至恒重。树脂上加载60-90mmol使用的氨基酸。B.固相分步合成，一般方案以I. Og各种氨基酸-CTC树脂或MBH树脂(按该实施例I的A部分所示加载)开始，在24°C进行固相合成。对于整个合成，使用以下方案BI.树脂溶胀将树脂放置在15ml固相反应器中，并用7mLN-甲基吡咯烷酮(NMP)处理两次，然后排空。B2.氨基酸活化称取Fmoc氨基酸(3. 0当量)和I-羟基苯并三唑(4. 0当量)，用2. 5倍体积的NMP溶解于反应器中并冷却至0°c。然后，加入二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide)(DIC) (3. 0当量)，并将混合物搅拌15min。B3.偶联将制得的B2溶液加入到BI反应器中。烧瓶用I. 0倍体积的DCM清洗并加至反应器中，然后将反应器在25_30°C搅拌1-3小时。取样用于Kaiser测试(Kaiser Test)以检测反应(是否)完成。如果偶联反应在3小时后未完成(阳性Kaiser测试)，则排空反应器，并在新鲜活化氨基酸溶液中进行再偶联。完成偶联反应后，排空偶联溶液(couplingsolution)并将树脂用NMP清洗4次(每次清洗5vol)。B4.去除 Fmoc-基团排空B3中获得的树脂，然后用5ml 25体积％的哌啶处理30min。然后树脂用5mlNMP清洗三次。B5.肽链延伸完成每个氨基酸的引入后，重复步骤B2至B5直至完成肽链。对于单个氨基酸的引入，使用下列的Fmoc-氨基酸衍生物Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met (0)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Glu (tBu)-OH、pGlu、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-0H> Fmoc-Ser(Trt)-0H> Fmoc-Thr(tBu) -0H>Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-0H> Fmoc-Tyr(Clt) - 0H> Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln (Trt) -0H> Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-His(Trt)-0H> Fmoc-Cys(Trt)-0H> Fmoc-Cys(Mmt)-OH和 Fmoc-Cys(Acm)-OH 以及下列 Boc-氛基酸Boc-Arg (Pbf)-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Gln(Trt) -OH、Boc-Lys (Boc)-OH和 Boc-Asp(tBu)-OH。C :在N-末端均包含来自CTC树脂的Fmoc-或Boc-基团的侧链保护的RLXA和RLXB以及其受保护的片段的切割，一般过程如上面所描述的在B1-B5下获得的树脂结合肽或肽片段用5ml NMP清洗4次，用5ml IPA清洗3次，并最终用7ml DCM清洗5次，以除去任何NMP或其他碱性(basic)污染物。然后将树脂冷却到O°C。排空DCM，并将树脂用IOml I %三氟乙酸(TFA)/DCM在5°C预冷却的溶液处理两次，在0°C搅拌20min然后过滤。然后树脂用IOml DCM清洗三次。然后将吡啶加入到合并的滤液(1.3当量，相对于TFA)中以中和TFA。然后将DCM切割溶液与 相对于DCM等体积的水合并。所得混合物在减压下蒸馏以除去DCM(350Torr，在28°C下)。当DCM除去时，肽或肽片段从水中析出。片段用水清洗，然后在15Torr真空下在30_35°C干燥。实施例2线性还原的RLX1A、RLX2A、Met (O) 24-RLXlB 和 Met (O) 25-RLX2B 以及它们的衍生物的脱保护。一般过程按以上在实施例I中所描述获得的受保护的RLX-链A(0. Olmmol)用IOml的TFA/二硫苏糖醇(DTT)/水(90 5 5)的混合物在5°C处理三小时，然后在15°C处理I小时。然后真空浓缩制得的溶液，并通过加入二异丙基醚使溶液沉淀，然后用IOml 二异丙基醚清洗三次。然后真空干燥(25°C，15Torr)获得的固体至恒重。用以氧化甲硫氨酸基团保护的RLX链B重复操作。实施例3单和双环RLXlA、RLX2A、Met (0) 24-RLXlB 和 Met (0) 25-RLX2B 的脱保护。一般过程按以上在实施例I中所描述获得的受保护的RLX (0. 005mmol)用5ml的TFA/三异丙基娃烧(triisopropylsilane,TIPS)/苯甲醚/水(91 : 4 : I : 4)的混合物在5°C处理三小时，然后在15°C处理I小时。然后真空浓缩制得的溶液，并通过加入二异丙基醚使溶液沉淀，然后用5ml 二异丙基醚清洗三次。然后真空干燥(25°C，15Torr)获得的固体至恒重。对于每种链A和链B重复操作。实施例4脱保护的RLX1A、RLX2A、Met (0) 24-RLXlB 和 Met (0) 25-RLX2B 以及其单和双环衍生物的纯化，一般过程粗制脱保护的RLXlAMet (0) 24Met (0)25的三氟乙酸盐溶解于25 %的乙腈水溶液中，并加载到半制备型10x25mm柱上。Lichrospher 100, RP-18,12微米(Merck);相六=乙腈中1% -TFAJg B =水中1% -TFA ;梯度=25% -A至65% -A的线性梯度30min。纯化产率在30-80%之间变化。对于RLX2A、Met (0)24-RLXlB和Met (0)25-RLX2B以及其单和双氧化的衍生物，重复操作。
实施例5受保护肽从CTC-树脂的切割以及同时用碘单氧化。单氧化人松弛素A链和B链、Met (0)24-RLXlB和Met (0)25-RLXB以及它们的片段(图7 (化合物16至17)、8 (化合物18-19)、11 (化合物29-30)、和12 (化合物31至32))的制备。按上面实施例I和实施例2中所描述获得的N-和侧链保护的树脂-结合肽或肽片段用5ml NMP清洗4次，用5ml IPA清洗3次，并最后用7mlDCM清洗5次，以除去任何NMP或其他碱性污染物。然后树脂冷却到0°C。排空DCM，并将树脂用在5°C预冷却的IOmlDCM中的1% -TFA溶液处理两次，其相对于树脂结合肽含有10当量的碘，在0°C搅拌5min然后过滤(代替1% TFA，使用相同体积的二氯甲烷/乙酸/三氟乙醇的混合物作为具有相似结果的溶剂)。然后树脂用IOml DCM清洗三次。然后将合并的滤液在15°C加热并另外搅拌30min。然后加入吡啶(1.3当量，相对于TFA)以中和TFA。然后将DCM切割溶液与相对于DCM等体积的3% -硫代硫酸钠或抗坏血酸水溶液合并以消除过量的碘。通过混合物的脱色对其进行指示。所得混合物然后在减压下蒸馏以除去DCM(350Torr在28°C下)。当 DCM除去时，受保护的肽或肽片段从水中析出。肽用水进一步清洗，然后在15Torr真空下在30-35°C干燥。按在实施例2、3和4中所描述的进行脱保护和纯化。总产率在45-65%之间变化。对于每种物质重复该过程。实施例6受保护的单环人RLXlA和RLX2A通过DMSO氧化的合成。一般过程Al. Cys (Mmt)选择性去除。部分脱保护RLX1A、RLX2A(图9_化合物21-22和图10化合物25至26)按上面所描述的在B1-B5下获得的包含两个由Trt保护的Cys残基以及两个用Mmt保护的Cys残基的N-和侧链保护的树脂-结合肽片段RLXA (0. 005mmol)，用5ml NMP清洗4次，用5ml IPA清洗3次，并最后用7ml DCM清洗5次，以除去任何的NMP或其他碱性污染物。然后树脂冷却到0°C。排空DCM，并将树脂用在5°C预冷却的25ml 1.5%TFA(在图中，这为I. 1% )处理四次，该溶液相对于树脂结合肽含有10当量三乙基硅烷(triethylsilane),在5°C搅拌5min并过滤。合并的滤液然后在15°C另外搅拌两小时。然后加入吡啶(1.3当量，相对于TFA)以中和TFA。然后将DCM切割溶液与相对于DCM与等体积的水合并。制得的混合物然后在减压条件下蒸馏以除去DCM(350Torr在28°C)。当除去DCM时，在S-Mmt残基处部分脱保护的肽或肽片段从水中析出。片段用水清洗，然后在15Torr真空下在30_35°C干燥。重复该过程以产生RLX2A。A2.从游离半胱氨酸至单环的DMSO氧化从以上所描述的Al操作获得的肽类(0. 005mmol)，各自溶解于5mlDMS0中并在25°C搅拌24小时。然后加入5ml水并另外搅拌30min。析出的单环受保护肽用水清洗五次，然后在真空中干燥至恒重(30°C，15Torr)。按在实施例2、3和4中所描述的进行脱保护和纯化。总产率在50-70%之间变化。该操作针对RLXlA和RLX2A的生产进行说明，并也可被用于选择性地去除在RLXlB和RLX2B半胱氨酸残基上的保护基团。实施例7双环人RLXlA和RLX2A以及它们的衍生物的合成。一般过程
Al.通过碘氧化受保护的单环RLX1A、RLX2A，其中两个Cys残基为侧链Trt-保护的(图9化合物22至23和图10化合物26至27)。具有两个用Trt保护的Cys残基的受保护的单环RLXlA(0. 005mmol)，溶解于5mlDCM/TFE(7 : 3)中。溶液在5°C冷却，然后加入5ml DCM中10当量的碘，并将混合物搅拌I小时。然后DCM溶液与相对于DCM其5倍体积的3% -硫代硫酸钠或抗坏血酸水溶液合并以消除过量的碘。通过混合物的脱色对其进行指示。制得的混合物在减压条件下蒸馏以除去DCM(350Torr在28°C )。当DCM除去时，受保护的肽或肽片段从水中析出。析出的受保护的肽随后用水清洗，并在15Torr真空下在30_35°C干燥。按在实施例2、3和4中所描述的进行脱保护和纯化。用RLX2A重复该过程。总产率在50-80%之间变化。A2.通过碘氧化受保护的单环RLX1A、RLX2A，其中两个Cys残基为Acm保护的(图11化合物30-23和图12化合物32至27)。具有两个用Acm保护的Cys残基的受保护的单环RLXlA(0. 005mmol),溶解于5mlAcOH/三氟乙醇(TFE) (5 5)中。溶液在5°C冷却，然后加入5ml TFE中的20当量的碘， 并将混合物搅拌I小时。然后溶液与其5倍体积的3%-硫代硫酸钠或抗坏血酸水溶液合并以消除过量的碘。通过混合物的脱色对其进行指示。然后析出的受保护的肽用水清洗，并在15Torr真空下在30_35°C干燥。按在实施例2、3和4中所描述的进行脱保护和纯化。用RLX2A重复该过程。总产率在50-60%之间变化。A3.通过DMSO氧化脱保护的单环人RLXlA和RLX2A，一般过程单环脱保护的RLXlA或RLX2A(0. 005mmol)溶解于4ml pH = 4的醋酸铵缓冲液中。然后，加入Iml DMS0，并将混合物在15°C搅拌24h。从制得的溶液中，纯化后按实施例4中所描述的分离双环肽。总产率在65-85%之间变化。A4.通过DMSO氧化线性脱保护的RLXAl和RLXA2，一般过程(图13化合物34至24,35和36以及图14化合物38至28、39和40)。脱保护的线性RLXlA(0. 005mmol)溶解于4ml pH = 4的醋酸铵缓冲液中。然后，加入Iml DMSO,并将混合物在15°C搅拌24h。从制得的溶液中，纯化后按实施例4中所描述的分离双环肽。用RLX2A重复该过程。总产率在65-80%之间变化。实施例8单环人Met (0) 24-RLXlB和Met (0) 25-RLX2B的合成，一般过程(图5化合物9至10和图6化合物13至14)脱保护的线性人Met(O) 24_RLX1B(0. 005mmol)溶解于4ml pH = 10. 5的甘氨酸钠缓冲液中。然后，加入Iml DMS0，并将混合物在15°C搅拌24h。纯化后从制得的溶液中按实施例4中所描述的方法分离环状肽。用Met25(0)-RLX2B重复操作。三次纯化的产率平均为45%。实施例9由线性RLXlA 和线性 Met(O) 24_RLX1B 的结合合成人 B-Met24 (0)-RLXlMet (0)24，以及由线性RLX2A和线性Met (0)25-RLX2B的结合合成人B-Met (0)25-RLX2 ;一般过程脱保护的线性人RLXlA (0. 006mmol)和 Met (0) 24_RLX1B Met(O)25 (0. 005mmol)溶解于4ml pH = 10. 5的甘氨酸钠缓冲液/6-N盐酸胍(4 I)中。然后，在12小时期间加入Iml DMS0，并将混合物在15°C另外搅拌4h。纯化后利用实施例4中所描述的方法从制得的溶液中分离Met (O) 24-RLX IMet (0)25。由线性RLX2A和Met (0) 25-RLX2B开始利用相同操作制备 B-Met(0)25-RLX2。三轮的产率平均为B_Met (0)25-RLXl 37%和 B-Met (0)24-RLX2 35%。实施例10由线性RLXlA和环状Met(O) 24_RLX1B的结合合成人B-Met24 (0)-RLXl，以及由线性RLX2A 和环状 Met (0) 25-RLX2B 的结合合成人 B-Met (0) 25-RLXl ;一般过程脱保护的线性人RLXlA(0. 005mmol)和环状 Met (0)24-RLXlBMet (0)25(0. 005mmol)溶解于4ml pH 10. 5的甘氨酸钠缓冲液/6-N盐酸胍(4 I)中，并在15°C搅拌五小时。然后，在12小时期间加入Iml DMS0，并将混合物在15°C另外搅拌4h。纯化后从制得的溶液中利用实施例4中所描述的方法分离Met(0)24-RLX1。重复操作以由线性RLX2A和环状Met(0)25-RLX2B的结合制备人B-Met (0) 25-RLX2。三次纯化的产率平均为基于应用的链B，B-Met(O) 25-RLXl 32%和 B-Met (0)24-RLX2 67%。
实施例U由单环RLNlA或RLN2A和线性Met(O) 24_RLN1B以及Met25 (0)-RLN2B的结合合成人B-Met24 (0) -RLNl 和 B-Met25 (0)-RLN2 般过程脱保护的单环人线性RLNlA 或 RLN2A(0. 006mmol)和 Met24(O)-RLNlB 或Met25 (0) -RLN2B (0. 005mmol)溶解于 4ml pH = 10. 5 的甘氨酸钠缓冲液/6-N 盐酸胍(4 I)中。然后，在12小时期间加入lmlDMSO，并将混合物在15°C另外搅拌4h。纯化后从制得的溶液中利用实施例4中所描述的方法分离Met24 (0) -RLNlB或Met25 (0) -RLN2B。三轮的平均产率为B-Met24(O)-RLNl32%和 B-Met25(O)-RLN2 36%。实施例12由单环RLNlA或RLN2A和环状Met24 (O)-RLNlB以及Met25 (0)-RLN2B的结合合成人B-Met24 (0) -RLNl 和 B-Met25 (0)-RLN2 般过程脱保护的单环人RLNlA 或 RLN2A(0. 006mmol)和环状 Met24(O)-RLNlB 或Met25 (0) -RLN2B (0. 005mmol)溶解于 4ml pH = 10. 5 的甘氨酸钠缓冲液/6-N 盐酸胍(4 I)中。然后，在12小时期间加入lmlDMSO，并将混合物在15°C另外搅拌4h。纯化后从制得的溶液中利用实施例4中所描述的方法分离Met24 (0) -RLNlB或Met25 (0) -RLN2B。三轮的平均产率为B-Met24(O)-RLNl35%和 B-Met25(O)-RLN2 38%。实施例13由双环RLXl 和线性 Met(O) 24_RLX1B 的结合合成人 Met (0) 24-RLXlMet (0) 25-RLX2，以及由双环RLX2和线性Met(O) 25-RLX2B的结合合成人Met (0) 25-RLX2 般过程(图16):脱保护的双环RLXlA (0. 005mmol)和线性 Met (0)24_RLX1B Met(O)25 (0. ImmoI)溶解于4ml pH 10. 5的甘氨酸钠缓冲液/6-N盐酸胍(4 I)中，并在15°C搅拌I小时。然后，在12小时期间加入Iml DMSO,并将混合物在24°C另外搅拌4h。纯化后从制得的溶液中利用实施例4中所描述的方法分离Met (0) 25-RLXl。重复操作以由双环RLX2和线性Met (0) 25-RLX2B的结合制备人Met(O) 25-RLX2。三次纯化的产率平均为基于应用的链B，B-Met (0) 25-RLXl64% 和 B-Met(0)24-RLX2 76%。实施例14由双环RLXlA和环状Met(O) 24_RLX1B的结合合成人B-Met (O)24RLXl,以及由双环RLX2A和环状Met (0) 25RLX2B的结合合成人B-Met (0) 25RLX2 般过程(图17):
脱保护的双环RLX1A(0. Ollmmol)和环状 Met (0) 24_RLX1B 或Met (0)25-RLX2B(0. Olmmol)溶解于 15ml pH 10. 5 的甘氨酸钠/6_N 盐酸胍缓冲液(4 I)中。然后加入0. OOlmmol在3ml THF中的苯硫酚，并在15°C搅拌24小时。纯化后从制得的溶液中利用实施例4中所描述的方法分离Met (0)24_RLX1或Met(O) 25-RLX2。重复操作以由双环RLX2A和环状Met (0) 25RLX2B制备Met (0) 25-RLX2B。三次纯化的产率平均为基于应用的链 B，B-Met (0) 24RLXl 68 %，B-Met (0) 25RLX2 72 %。实施例15
通过用碘化铵分别还原B-Met (0) 24RLXl、B-Met (0) 25RLX2、Met (0) 24RLXlB'Met (0) 25RLX2B、环状 Met (0) 24RLXlB 和环状 Met (0) 25RLX2B 合成人 RLX1、RLX2、RLX1B、RLX2B、环状RLXlB和环状RLX2B，一般过程该过程利用每种含Met (0)的 RLX1、RLX2、RLX1B、RLX2B、环状 RLXlB 和环状 RLX2B的肽或蛋白类似物进行。0. Olmmol Met(O)类似物溶解于25ml水中的90%-TFA。然后，加入Immol的碘化铵，且混合物在24°C搅拌15min。纯化后从制得的溶液中通过HPLC利用实施例4中所描述的方法分离期望的产物(RLX1、RLX2、RLX1B、RLX2B、环状RLX1B、环状RLX2B) o 三次纯化的产率平均为RLXl 91%, RLX2 89%, RLXlB 62%, RLX2B 64%、环状RLXlB 88%和环状 RLX2B 81%。虽然本文中提供了多种示例性实施方式、方面和变体，本领域中的技术人员能够识别这些实施方式、方面和变体的某些改变、变换、添加、和组合以及某些亚-组合。所附权利要求应当被理解为包括实施方式、方面和变体的所有这样的改变、变换、添加、和组合以及某些亚-组合，它们落在所附权利要求的范围内。贯穿本申请所引用的所有文献的全部公开内容以其整体并入本文中供参考。
权利要求
1.一种用于生产具有至少两条肽链，A和B，的胰岛素型肽的方法， 链A和链B通过至少一个二硫键连接，所述方法包括 提供肽链A和链B，其中，每条链包含至少一个半胱氨酸残基且每条链可选地具有分子内二硫键，并且链B包含氧化的甲硫氨酸残基； 在使得形成至少一个分子间二硫键的条件下，使链A和链B结合，以使链A和链B连接在一起；以及 使所述氧化的甲硫氨酸残基还原以产生所述胰岛素型肽。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述胰岛素型肽为松弛素。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述松弛素为松弛素I或松弛素2，并且链A为松弛素A链且链B为松弛素B链,并且其中,在与链A结合后 链B的至少一部分不具有分子内二硫键；或 存在还原剂，以还原链B的分子内二硫键。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，存在还原剂且所述还原剂选自具有游离半胱氨酸残基的链A和具有游离半胱氨酸残基的链B。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述还原剂包含具有游离半胱氨酸残基的链B。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，链B具有游离半胱氨酸基团且链A具有分子内二硫键。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述肽为选自松弛素I和松弛素2的松弛素，并且链A具有两个分子内二硫键，且链B的至少一部分不具有分子内二硫键。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中，所述松弛素为人松弛素1，且所述B链为Met (O) 24RLXlB或人松弛素2，且所述B链为Met (0) 25RLX2B。
9.一种用于生产松弛素的方法，包括 提供具有至少一个分子内二硫键的松弛素A链，以及松弛素B链，其中所述B链的至少一个甲硫氨酸残基被氧化，所述B链可选地包含分子内二硫键； 在使得所述A链和所述B链之间形成至少一个分子间二硫键的条件下，使所述A链和所述B链结合，以将所述链连接在一起；以及 使所述氧化的甲硫氨酸残基还原，以产生所述松弛素。
10.一种合成生产的、分离的人松弛素1，和其药用盐、衍生物或前药。
11.一种用于生产具有至少两条肽链，A和B，的胰岛素型肽的方法，链A和链B通过至少一个二硫键连接并且链B具有至少一个氧化的甲硫氨酸残基，所述方法包括 提供肽链A和链B，每条链包含至少一个半胱氨酸残基并且链B包含氧化的甲硫氨酸残基; 在使得链A中的至少一个半胱氨酸残基和链B中的至少一个半胱氨酸残基结合的条件下，使链A和链B结合，以使所述链连接在一起，从而产生具有氧化的甲硫氨酸残基的所述胰岛素型肽。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述包含甲硫氨酸氧化物的松弛素，通过使以下链结合 线性松弛素A链和线性松弛素B链； 线性松弛素A链和环状松弛素B链；或单环或双环松弛素A链和线性松弛素B链；以及 氧化得到的产物而产生。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述氧化利用DMSO、空气或过氧化氢进行。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述包含甲硫氨酸氧化物的松弛素通过在还原剂的存在下使单环或双环松弛素A链和环状松弛素B链结合而产生。
15.一种包含一个或多个甲硫氨酸亚砜残基的生物活性的、合成松弛素，以及其药用盐、衍生物、或前药。
16.根据权利要求15所述的分离的合成人松弛素，其选自 i)具有在图3中图示说明的序列的人Met(O)24-松弛素I; ii)具有在图4中图示说明的序列的人Met(O)25-松弛素2 ;以及 或ii)的药用盐、衍生物或前药。
17.一种合成的嵌合多肽，包括 i)合成松弛素I、合成松弛素2，在权利要求15或16中限定的、或通过权利要求I至9和11至14中任一项中限定的方法而生产的合成松弛素的全部或部分多肽序列；以及 ii)源自不同松弛素或并非源自松弛素的多肽序列。
18.根据权利要求17所述的合成的嵌合多肽，包含i)RLXlA和RLX2B或Met(O) RLX2B或 ii)RLX2A 和 RLX IB 或 Met(0)RLX2B。
19.一种用于生产松弛素A链的方法，包括将半胱氨酸衍生物酯化到三苯甲基或二苯甲基类型的树脂或连接物上并在固相合成中依序使松弛素A的可选保护的残基反应。
20.根据权利要求I至9、11至14和19中任一项所述的方法，其中，在所述A链或B链中的所述甲硫氨酸氧化物残基利用N-保护的甲硫氨酸氧化物衍生物引入，或将甲硫氨酸残基加入到所述肽链中，然后氧化成甲硫氨酸氧化物残基。
21.一种分离的合成多肽、以及其药用盐、衍生物或前药，所述分离的合成多肽包含合成松弛素A链、合成松弛素B链、合成松弛素A链的甲硫氨酸氧化物类似物、合成松弛素B链的甲硫氨酸氧化物类似物的全部或部分多肽序列。
22.根据权利要求21所述的分离的合成多肽，选自RLX1A、RLX2A、RLX1B、RLX2B、Met (0) 24-RLXlB 和 Met (0) 25-RLX2B。
23.根据权利要求21所述的分离的合成多肽，其中，所述A链具有I或2个分子内硫键并且所述B链具有I个分子内硫键。
24.在权利要求10、权利要求15-18以及权利要求21中任一项中限定的或通过权利要求I至9和11至14以及权利要求19和20中任一项中限定的方法而生产的合成胰岛素型多肽，以及其药用盐、衍生物或前药，其用于通过治疗来处理人或动物体的方法中。
25.根据权利要求24所述的多肽，用于以下中的一种或多种中提供心脏保护、治疗心脏疾病、纤维变性、过敏反应、癌症，以及用于伤口愈合中，和用于要求控制胶原更新的病症治疗中。
26.—种药物组合物，包含在权利要求10、权利要求15至18和权利要求21至24中任一项中限定的或通过权利要求I至9和11至14以及权利要求19和20中任一项中限定的方法而生产的合成多肽，以及药用载体。
全文摘要
一种用于生产胰岛素型肽如松弛素的方法，包括氧化具有半胱氨酸残基的B链上的甲硫氨酸残基，以及使B链与具有半胱氨酸残基的A链结合以形成具有分子间二硫键和生物活性的肽。公开了新的合成松弛素1和甲硫氨酸氧化的松弛素以及溶解性提高的Met(O)B链。
文档编号C07K14/64GK102647996SQ201080034142
公开日2012年8月22日 申请日期2010年5月19日 优先权日2009年6月1日
发明者科尔奥梅尼斯·K·巴洛斯 申请人:帕特拉斯化学与生物制药实验室