一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫的病原是口蹄疫病毒（Foot-andnouth disease virus，FMDV)，属于小 RNA 病毒科，病毒基因组为单股正链RNA，约由8500个核苷酸组成，具有7个血清型（A、0、C、 SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1)和多种亚型。我国主要流行的是0型、C型和亚1型。各血清 型的免疫无交叉保护，疫苗的配制往往随流行而变化。
[0003]目前使用的口蹄疫疫苗是经BHK-21细胞悬浮培养、经双乙烯亚胺灭活、乳化制备 而成，有许多缺点，如需要生物安全水平3级以上的生产设施、病毒灭活不彻底、病毒逃逸 的风险、难以区别动物感染和免疫、许多疫苗主种子批在细胞培养过程的适应性问题。为克 服以上问题，研发新的口蹄疫疫苗成为必然。
[0004] 病毒样颗粒疫苗保持了口蹄疫病毒灭活疫苗良好的免疫原性、高度安全性，可区 别动物是否感染和免疫（DIVA)，其生产过程中避免使用活的口蹄疫病毒，可以无血清悬浮 培养。
[0005] 本发明发现在真核和昆虫细胞表达P12A，其P12A上有3个突变，形成75S病毒样 颗粒，而不需3C的酶解。大多口蹄疫病毒样颗粒是用P12A3C在宿主细胞表达组装，由于3C 对宿主细胞的毒性，使病毒样颗粒的产量低且病毒样颗粒结构不完整，因而造成病毒样颗 粒产量低，生产成本高。本发明克服了筛选高水平稳定表达口蹄疫病毒样颗粒的细胞系较 难的问题，解决了口蹄疫病毒颗粒在表达细胞系组装中消化宿主细胞蛋白而使工程细胞死 亡的问题，从而增加了 口蹄疫病毒的表达量，进而采用昆虫细胞，优选了高表达条件，特别 是驯化了高PH条件下无血清培养高表达生产病毒样颗粒的昆虫细胞。
【发明内容】
[0006] 疫苗免疫原性主要取决于其空间结构和构象，对于口蹄疫病毒样颗粒疫苗则取决 于生产抗原的工程细胞稳定、高效表达重组蛋白且能够组装。本发明首先通过表达P12A(3 个氨基酸位点突变，VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，建立了类似自然标准75SFMDV病毒样 颗粒和无血清悬浮培养BHK21细胞生产类似自然的75S FMDV病毒样颗粒的方法，此方法提 高了 口蹄疫病毒样颗粒的表达量，因而也提高了组装成熟病毒样颗粒的量。在上述基础上， 本发明进一步提供了无血清悬浮培养驯化昆虫细胞SfHpH稳定高效生产口蹄疫病毒颗粒 的方法，同时提供了生产重组口蹄疫病毒颗粒疫苗的检验和评估方法。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] -种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：将口蹄疫病毒 衣壳前体蛋白P12A cDNA序列克隆到真核表达载体中，所得的重组质粒转染哺乳动物细胞， 使其表达口蹄疫病毒衣壳蛋白并组装成口蹄疫病毒样颗粒，纯化、乳化，即得；
[0009] 其中，所述的衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VPl在原始口蹄疫病毒VPl蛋白基因 的基础上进行了以下位点的突变：Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连接处Lys210 - Glu。
[0010] -种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：将口蹄疫病毒 衣壳前体蛋白P12A cDNA序列克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl中，所得的重组杆状转 移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，得到重组杆状质粒，重组杆状质粒转染Sf21昆 虫细胞产生感染性重组杆状病毒，重组杆状病毒转染SfHpH细胞，使其表达口蹄疫病毒衣 壳蛋白并组装成口蹄疫病毒样颗粒，纯化，乳化，即得；
[0011] 其中，所述的衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VPl在原始口蹄疫病毒VPl蛋白基因 的基础上进行了以下位点的突变：Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连接处Lys210 - Glu ; 所述的SfHpH细胞为无血清培养基培养pH7. 0-7. 4适应的昆虫细胞Sf21。
[0012] 在本发明中，优选的，所述的真核表达载体为pTT5或pVIJNS ;所述的哺乳动物细 胞为BHK-21细胞。
[0013] 在本发明中，优选的，所述的SfHpH细胞采用以下方法驯化得到：Sf21细胞首先用 pH 6. 0的无血清培养基完全换液，之后每隔2-5天用调节好pH的无血清培养基换液，经过 2月连续从pH6. 0到7. 4,每次提高0. 2pH单位，不断提升Sf21细胞的pH压力选择，获得了 无血清培养基培养PH7. 0-7. 4适应的稳定的昆虫细胞Sf21，即为SfHpH细胞。
[0014] 在本发明中，优选的，所述的无血清培养基为Sf-90011-BES-MISS培养基， Sf-90011-BES-MISS培养基含50mM N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸、124mM蔗糖、5mM 葡萄糖、50mM氯化钠、20mM氯化钾、3mM氯化HlOmM硫酸镁、0. 1% w/v嵌段式聚醚F-68。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的口蹄疫病毒来源于猪、牛、羊以及骆驼的0型口蹄疫 病毒。
[0016] 进一步的，本发明提供了一种制备所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的方法，其特征 在于，包括以下步骤：
[0017] (1)合成口蹄疫病毒病毒全长传染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf [-]质粒，制成重组质粒 pGEM-FLOSFS ;
[0018] (2)以重组质粒pGEM-FLOSFS为模板，合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12A cDNA序 列，插入质粒PGEM-3Z，制成重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ;
[0019] (3)以重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A为模板，采用PCR方法进行口蹄疫病毒衣壳前体 蛋白P12A的结构蛋白VPl基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连接处Lys210 - Glu的突 变，突变后产物连接到PGEM-3Z克隆质粒上，制成重组质粒pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、 VP1E83K、VP1C134S)，重组质粒在在大肠杆菌DH5 α扩增，纯化，测序确认；
[0020] (4)重组质粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切产物亚克隆至真核表达载体pTT5或pVIJNS中，制成重组质粒pTT5-mP12A 或pVlJNS-FMDV0mP12A，重组质粒在在大肠杆菌DH5 α扩增，纯化，测序确认；
[0021] (5)重组质粒pTT5-mP12A或pVlJNS-FMDV0mP12A转染ΒΗΚ-21细胞，经无血清悬浮 培养后离心收集上清，经纯化制得口蹄疫病毒样颗粒，乳化，即得。
[0022] 本发明还提供了另一种制备所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的方法，其特征在于， 包括以下步骤：
[0023] (1)合成口蹄疫病毒病毒全长传染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf[-]质粒，制成重组质粒 pGEM-FLOSFS ;
[0024] (2)以重组质粒pGEM-FLOSFS为模板，合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12A cDNA序 列，插入质粒PGEM-3Z，制成重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ;
[0025] (3)以重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A为模板，采用PCR方法进行口蹄疫病毒衣壳前体 蛋白P12A的结构蛋白VPl基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连接处Lys210 - Glu的突 变，突变后产物连接到PGEM-3Z克隆质粒上，制成重组质粒pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、 VP1E83K、VP1C134S)，重组质粒在在大肠杆菌DH5 α扩增，纯化，测序确认；
[0026] (4)重组质粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切产物亚克隆至克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl中，制成重组质粒 pFast-Bac-FMDV0mP12A，重组杆状病毒DNA制备是使用Bac-to-Bac系统Tn7,在大肠杆菌 DHlOBac感受态细胞转位获得重组杆状质粒；重组杆状质粒使用Cellfectin-II转染Sf21 细胞产生感染性重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A ;
[0027] (5)重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A转染SfHpH细胞，经无血清悬浮培养后离 心收集上清，经纯化制得口蹄疫病毒样颗粒，乳化，即得。
[0028] (5)重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A转染SfHpH细胞，经无血清悬浮培养后离 心收集上清，经纯化制得口蹄疫病毒样颗粒，乳化，即得。
[0029] 在本发明中，优选的，步骤（1)所述的改造的pGEMR_7Zf [-]质粒为采用快速定点 试剂盒在质粒pGEMR-7Zf(_)多克隆位点进行定点突变形成NdeI、NheI、NotI、SpeI限制酶 切位点；步骤（2)所述的合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12A cDNA序列的引物序列为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2/所示，或者为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3所示；步骤（3)所述 的PCR方法中的引物序列为SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:9所示。
[0030] 更进一步的，本发明提供了所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗在制备预防或防治口蹄 疫药物中的应用。
[0031] 一、BHK-21细胞制备重组口蹄疫病毒样颗粒
[0032] BHK-P12A细胞培养后不仅生产75S病毒样颗粒、也产生5S的原体颗粒、12S的五 聚体，这些蛋白和灭活口蹄疫疫苗一样，以相同剂量在小鼠模型上诱导免疫反应。P12A前体 蛋白免疫小鼠无特异性的抗体检出，但形成病毒样颗粒后免疫小鼠则产生抗体反应，表明 口蹄疫病毒样颗粒作为疫苗抗原使用的效果。P12A形成的病毒样颗粒诱导抗体在加强免疫 后显著提高，且保护率为100 %，不仅有抗体的作用，也有细胞免疫的作用。
[0033] BHK-P12A表达的病毒结构能被口蹄疫疫苗免疫牛血清识别，进一步揭示重组的病 毒样颗粒模拟了口蹄疫"真病毒"。本发明的口蹄疫病毒样颗粒疫苗是口蹄疫亚单位疫苗， 容易制备、容易纯化，具有常规灭活全病毒疫苗的安全和效果。
[0034] BHK-P12A细胞稳定高效表达生产口蹄疫病毒样颗粒是通过除去口蹄疫病毒蛋白 酶3C的毒性，引入了自主组装标签（VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，从而使宿主细胞稳定 并不受到破坏。P12A产物高效表达且自我组装成75S病毒样颗粒。
[0035] 因为没有蛋白酶3C的表达而没有对宿主细胞蛋白损害。口蹄疫病毒其他蛋白单 一表达，表达水平远低BHK-P12A表达。BHK-P12A中表达的VPO、VP3、VPl至少含一个口蹄 疫构象表位，理论上应能被单抗识别，但转染细胞裂解物不能被口蹄疫构象表位单抗识别， 这种组装的差异可能在P12A表达盒表达前体蛋白时，结构蛋白浓度和组装要求浓度适宜 是否正确方式组装病毒颗粒有关。因此，P12A表达盒稳定转染BHK细胞使重组口蹄疫病毒 颗粒的质量和数量有明显提高。BHK-P12A无血清全悬浮培养是大量生产口蹄疫病毒样颗粒 的关键因素，一是有活性的细胞密度增大，二是无血清培养基减少了后续步骤和纯化。
[0036] 重组病毒样颗粒口蹄疫疫苗的生产工艺和灭活纯化全病毒口蹄疫疫苗的生产工 艺相似，灭活后乳化配制成疫苗，前期工艺步骤不需悬浮细胞培养具有传染性的病毒工艺 步骤，排除了高水平生物安全等级设施需求。
[0037] 二、昆虫细胞系和重组杆状病毒制备重组口蹄疫病毒样颗粒
[0038] 在本发明一个具体实施例中，重组口蹄疫病毒样颗粒通过以下方法制备得到：
[0039] (1)合成口蹄疫病毒病毒全长传染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf [-]质粒，制成重组质粒 pGEM-FLOSFS ;
[0040] (2)以重组质粒pGEM-FLOSFS为模板，合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12A cDNA序 列，插入质粒PGEM-3Z，制成重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ;
[0041 ] ((3)以重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A为模板，采用PCR方法进行口蹄疫病 毒衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VPl基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连 接处Lys210 - Glu的突变，突变后产物连接到pGEM-3Z克隆质粒上，制成重组质粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A (VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，重组质粒在在大肠杆菌 DH5 α 扩增，纯 化，测序确认；
[0042] (4)重组质粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切产物亚克隆至克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl中，制成重组质粒 pFast-Bac-FMDV0mP12A，重组杆状病毒DNA制备是使用Bac-to-Bac系统Tn7,在大肠杆菌 DHlOBac感受态细胞转位获得重组杆状质粒；重组杆状质粒使用Cellfectin-II转染Sf21 细胞产生感染性重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A ;
[0043] (5) Sf21细胞对高pH培养的适应和驯化
[0044] Sf21细胞慢速轻微离心后用pH 6. 0Sf-900II-BES-MISS培养基完全换液，每隔 2-5天用已经调好Sf-90011-BES-MISS培养基换液，经过2月连续从pH6. 0到7. 4,每次提 高0. 2pH单位，不断提升Sf21细胞的pH压力选择，获得了无血清培养基培养pH7. 0-7. 4适 应的稳定的昆虫细胞Sf21，命名为SfHpH，冷冻保存；
[0045] 其中，所述的Sf-90011-BES-MISS培养基含50mM N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙 磺酸（BES)、124mM鹿糖、5mM葡萄糖、50mM氯化钠、20mM氯化钾、3mM氯化|丐、IOmM硫酸镁、 0· 1% w/v 嵌段式聚酿 F-68 (Pluronic F-68);
[0046] (6)高pH条件下制备口蹄疫病毒样颗粒
[0047] 采用Sf-900II无血清培养基培养SfHpH细胞，使其密度达到3.6X106细胞/ ml时，按MOI = 0.1 pfu/细胞接种重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A，27°C培养24h后， SfHpH细胞200Xg离心除去Sf-900II无血清培养基，用Sf-900II-BES-MISS培养基彻底 换液，重悬于pH7. 4Sf-900II-BES-MISS培养液中制备口蹄疫病毒样颗粒，培养72~96h ; Sf-900II-BES-MISS培养液的pH通过加入无菌的IN NaOH溶液进行调节，使培养液的pH始 终维持在7. 0-7. 4 ;
[0048] (7) 口蹄疫病毒样颗粒的纯化
[0049] 离心感染感染重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A的SfHpH细胞，收获上清液，上 清中加入终止蛋白酶抑