一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质bhk-21细胞残留的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种检测口蹄疫疫苗中培养细胞残留的方法，特 别涉及一种利用实时荧光定量PCR的方法检测口蹄疫疫苗中BHK-21细胞残留的方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫是偶蹄动物携带的一种急性、热性和可快速远距离传播的传染病，感染对 象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生的偶蹄动物，易感动物多达70多种。传播快、 感染性强，给畜牧业造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易。素有"政治经济病"之称。由 于其防控口蹄疫的措施主要是扑杀发病动物和应用质量可靠的灭活疫苗免疫易感动物。因 此高质量安全的灭活疫苗对于口蹄疫防控至关重要。
[0003] 口蹄疫疫苗的制备通常采用BHK-21细胞作为基质。BHK-21细胞又称幼仓鼠肾成 纤维细胞，该细胞系是由I. A. Macpherson和M. G. P. Stoker于1961年从1日龄的仓鼠科仓 鼠亚科金仓鼠属金仓鼠种金仓鼠肾脏建立了 BHK-21亲本，随后84天连续培养，通过单细胞 分离建立了 13号克隆。这株细胞可用作转染宿主，用于表达包含选择及扩增标记的DNA的 载体。BHK-21细胞广泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒等病毒疫苗的生产基质。然而在口 蹄疫疫苗的制作过程中容易残留培养基质细胞时所用的血清、水解乳蛋白，基质细胞蛋白 等多种非目的蛋白成分。这些异源蛋白不仅导致注苗动物经常出现不同程度的不良反应， 轻者减食、停食或发生流产，重者发生死亡，而且能够裂解病毒粒子，降低疫苗效力。目前口 蹄疫的制苗工艺往往不能完全去除非目的蛋白成分，因此建立一种快速准确的非目的蛋白 残留的检测方法，对于提高疫苗的生产效率和质量控制具有重要意义。
[0004] 线粒体Cytb基因（细胞色素 B基因）是一种蛋白质编码基因，几乎在所有真核生 物和许多原核生物的线粒体中都有发现，在不同物种间序列长度没有明显差异，并且遗传 变异小，但具有种间的差异。目前Cytb基因被广泛用于系统学研究，该基因片段包含着种 内到种间甚至到科间的遗传进化信息，且在系统进化和分类研究、群体遗传结构研究等方 面有很强的适用性。因此，本发明采用BHK-21细胞中的Cytb基因作为检测口蹄疫疫苗中 是否含有基质细胞蛋白残留的特异性检测基因。该技术还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口蹄疫疫苗培养细胞BHK-21 细胞残留物的快速检测方法，该方法具有简便迅速，结果准确和重复性好的特点，易于推广 应用。
[0006] 本发明采用的技术方案如下：
[0007] Cytb质粒标准品的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库（Genbank)中检 索获得BHK-21细胞Cytb基因的保守片段，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的 标准质粒分子。
[0008] 口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，是由1对引物BHK-I和 BHK-2组成，序列如下：
[0009] 上游引物 BHK-I :5' -GGCTACGTACTACCATGAGG-3' ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] 下游引物 BHK-2 :5' -TCTGGGTCTCCGAGAACATC-3'。（SEQ ID NO. 2)
[0011] 本发明还提供一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，使 用上述的口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，包括以下步骤：
[0012] 步骤（1)，使用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳；
[0013] 步骤（2)，对步骤（1)破乳得到的水相层进行总RNA的提取；
[0014] 步骤（3)，将步骤⑵得到的总RNA反转录为cDNA后，以cDNA为模板，以BHK-I和 BHK-2为上下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增产物；
[0015] 步骤（4)，根据10倍梯度稀释Cytb质粒标准品的标准曲线，计算步骤（3)得到的 扩增产物中Cytb的含量；如果含有Cytb，则为阳性，反之，为阴性，即无残留；
[0016] 步骤（5)，将步骤（3)得到的扩增产物用限制性内切酶Stu I进行直接酶切，进一 步验证基因的特异性，如果得到243bp和131bp条带大小为阳性，反之则阴性。
[0017] 上述技术方案中，步骤（1)中，使用正丁醇作为破乳剂，在4°C的条件下静置60分 钟，使油水分层，分离出含有抗原和细胞残留物的水相层；其中，破乳剂的加入的体积是口 蹄疫疫苗体积的15%。
[0018] 上述技术方案中，步骤（2)中，使用RNAiso Plus、氯仿和异丙醇进行总RNA的提 取，具体的提取方法为：
[0019] 向200 μ L水相层加入800 μ L RNAiso Plus，混匀，4 °C静置lOmin，然后在 10000rpm、4°C的条件下，离心10min，取上清液；
[0020] 向上清液中加入体积为上清液体积一半的氯仿，混匀后，室温静置lOmin，接着在 10000rpm、4°C的条件下，离心10min，取上清液并向该上清液中加入等体积的异丙醇，混勾 后，室温静置l〇min，再在10000rpm、4°C的条件下，离心10min，取沉淀；
[0021] 向沉淀中加入乙醇700 yL，并在10000rpm、4°C的条件下，离心5min，去上清，并将 沉淀吹干，最后加入至30 μ L DEPC水中，混匀，置于-80°C进行保存。
[0022] 上述技术方案中，将步骤⑵得到的总RNA反转录为cDNA的反应体系为10 μ L，包 括：
[0023] RNase Free dH20 4. 5 μ L ；
[0024] 5 X PrimeScript Buffer 2 μ L ;
[0025] PrimeScript RT Enzyme Mix I 0. 5 μ L ；
[0026] Random 6mers (lOOmol/L) 0. 5 μ L ；
[0027] Oligo dT Primer (50mol/L) 0. 5 μ L ；
[0028] 总 RNA 2 μ L ;总计 25 μ L ;
[0029] 反应程序为：37°C，15min ;85°C，5s。
[0030] 上述技术方案中，步骤（3)中所述的荧光定量PCR的方法的PCR反应体系为 25 μ L，其中包括：
[0031] SYBRk Premix Ex taqTM II 12. 5 μ L ；
[0032] 上游引物 BHK-1，10uM，0. 5 μ L ;
[0033] 下游引物 ΒΗΚ-2，10μΜ，0· 5yL ;
[0034] ddH20 9· 5 μ L ;
[0035] cDNA 2 μ L ;总计 25 μ L ;
[0036] 扩增程序为：
[0037] @95。(：预变性3〇8〇。；
[0038] ②95°C变性30s，62°C退火5s，共35个循环；
[0039] ③每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测；
[0040] 结束后，样本4°C保存。
[0041] 上述技术方案中，步骤（4)中，所述的Cytb质粒标准品为含Cytb基因片段的 pMD?-18T重组质粒；所述Cytb基因片段是以权利要求1所示核苷酸序列为引物，以Cytb 基因为模板扩增得到的。
[0042] 上述技术方案中，步骤（4)中，所述10倍稀释的Cytb质粒标准品，其稀释浓度分 别为：①IX IO8拷贝/ μ L ;②IX 10 7拷贝/ μ L ;③IX 10 6拷贝/ μ L ;④IX 10 5拷贝/ μ L ; ⑤I X IO4拷贝/ μ L ;⑥I X 10 3拷贝/ μ L ;⑦I X 10 2拷贝/ μ L。
[0043] 上述技术方案中，步骤（4)中，所述计算扩增产物中Cytb的含量，将梯度稀释的标 准品进行实时荧光定量PCR，以标准品拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，再将 待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测残留物的拷贝量，即得 到扩增产物中Cytb的含量。
[0044] 上述技术方案中，步骤（5)进一步鉴定扩增产物的特异性时，使用Stu I对荧光 PCR产物在37°C进行单酶切