一种口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种口蹄疫全病毒颗 粒疫苗组合物及其制备方法和应用，本发明属于医药生物技术领域
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病，主要危害牛、羊、猪、骆驼等，发 病率极高，传播速度极快。世界动物卫生组织将其列为A类人兽共患病首位。虽然该病的 死亡率不高（幼畜除外），但可造成动物生产性能下降，且扑杀动物需花费大量的人力、物 力和财力，还会影响国际贸易，造成严重的经济损失和生物恐怖。
[0003] 口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属。目前已知有7个血清型，A、0、C、 SAT1、SAT2、SAT3、ASIA1，每个血清型又有很多亚型。我国流行3个血清型且致病力最强、 分布最广泛，分别为A型、0型以及ASIAl型。
[0004] 疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控 制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的 过程中发挥着重要作用，但在疫苗制备过程中和产品中的一些宿主细胞残余蛋白、核酸、牛 血清白蛋白、化学试剂等如果不加以控制去除，免疫接种动物则引起动物严重副反应甚至 死亡、特别是可能使动物致癌或影响肉类动物食品安全。
[0005] 口蹄疫疫苗生产环节、冷链运输、田间使用中，适合的温度保存原液、半成品、成品 对疫苗抗原活性或效价非常重要，但疫苗抗原活性稳定的温度范围非常狭窄，一般在每段 工艺单元完成之间、疫苗库或抗原库、冷链运输、使用时保存在2-8°C，但不能冷冻，避免温 度升高或低于零下破环抗原结构或活性。为保持疫苗稳定性或工艺过程中贮备抗原的稳 定，多对疫苗或抗原进行冻干或冷冻，但由于灭活纯化抗原需要加入佐剂如铝盐、油佐剂增 强其免疫作用，冻干或冷冻使抗原凝聚变性或分层，失去免疫原性和生物活性，因此有必要 对口蹄疫抗原的稳定保护剂进行研宄，筛选，以便应对规模化生产大量抗原处理、贮存或抗 原库稳定需要，但不能影响后续乳化工艺配制疫苗和疫苗的最终田间使用，选择医学或兽 医学允许使用安全疫苗抗原保护剂。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种含有新型稳定冷冻保护剂的口蹄疫全病 毒颗粒疫苗组合物及其制备方法和应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0008] 本发明的一种口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物，其特征在于含有口蹄疫病毒的全病 毒颗粒以及稳定冷冻保护剂，所述的稳定冷冻保护剂由以下物质组成：多元醇、缓冲溶液以 及非离子表面活性剂。
[0009] 在本发明中，优选的，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有口蹄疫病毒的全病毒 颗粒1-20微克/mL，多元醇10-50% (v/v)，非离子表面活性剂0. 003-0. 03mg/mL，IO-IOOmM 的缓冲溶液，疫苗pH介于7. 0和9. 0之间。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的多元醇为甘油、聚乙二醇以及聚氧丙烯甘油醚 (polyoxypropylene glycerol ether)中的至少一种。
[0011] 在本发明中，优选的，所述的聚乙二醇为聚乙二醇300或聚乙二醇400。
[0012] 在本发明中，优选的，所述的非离子表面活性剂为吐温-20或土温-80。
[0013] 在本发明中，优选的，所述的缓冲溶液是磷酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液 的一种或几种的混合物。
[0014] 进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的疫苗组合物在制备预防或治疗口蹄 疫疾病药物中的应用。
[0015] 本发明提供口蹄疫标记疫苗稳定冷冻保护剂配方和制备工艺方法涉及病毒学、免 疫学、疫苗学和过程工艺学，特别涉及口蹄疫病毒标记疫苗配方以及制法，包括规模化口蹄 疫病毒的纯化工艺、质量控制方法和指标。配方的制法包括生物反应器全悬浮无血清培养 BHK-21和口蹄疫病毒疫苗株生产种子批，经过反复冻融、裂解或超声、核酸酶解、深层过滤、 阴离子交换层析、灭活、PEG沉淀、酚氯仿抽取、蔗糖密度梯度离心纯化、分子筛凝胶纯化、除 菌过滤、稀释乳化配制。可用于商用BHK-21适应或减毒株口蹄疫疫苗的纯化，也包括在其 他敏感细胞系增殖的各型或亚型口蹄疫病毒疫苗，主要为BHK-21细胞系作为口蹄疫疫苗 生产基质的各型或亚型的口蹄疫病毒标记抗原制备和贮存、运输、使用。
[0016] 本发明所使用的稳定冷冻保护剂的特点和优点：
[0017] 1、本发明提供的标记冷冻保护性配方，使疫苗抗原稳定，保护了标记疫苗的效价 和效果；可在液体、冷冻的条件下较长时间保持标记抗原的效价或活性，有利于生产过程、 冷链过程标记疫苗抗原的贮存。
[0018] 2、配方中不含外源性的蛋白、多肽、寡肽，降低了动物疫病的传播风险。
[0019] 本发明提供了 口蹄疫标记疫苗改良、贮存稳定配方以及制法、使用。本发明的一种 口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物含纯化灭活的完整的口蹄疫颗粒146S标记抗原和稳定冷冻 保护剂。稳定冷冻保护剂可使口蹄疫标记抗原在4-8 °C贮存24月。本发明的稳定冷冻保护 剂由以下物质组成：多元醇、缓冲溶液以及非离子表面活性剂，该冷冻保护剂有效维持口蹄 疫标记抗原146S的完整性、活性，在具体实施中贮存在不同温度下仍能够保持70-99. 9% 的病毒完整性或感染性。40°C液体贮存6个月，口蹄疫标记抗原仍能够保持80%的感染性 或完整性。在本发明提供的多元醇为甘油、聚乙二醇以及聚氧丙烯甘油醚中的至少一种，在 疫苗有效剂量中含10-50% (v/v)，研宄表明甘油在疫苗原液中含30% (v/v)可维持口蹄 疫病毒99. 9%的感染性。根据发明，非离子表面活性剂为吐温-20或土温-80,在疫苗有效 剂量中的含〇. 003-0. 03mg/mL。疫苗配方pH介于7. 0和9. 0之间。缓冲液是磷酸缓冲液、 Tris缓冲液，HEPES缓冲液的一种或混合物，摩尔浓度介于10和IOOmM之间。
[0020] 本发明实例中提供长期稳定贮存口蹄疫抗原的方法，包括口蹄疫病毒原液、半成 品、成品的方法以及用多元醇和缓冲液混合后，口蹄疫病毒液完整病毒颗粒保持的情况。
[0021] 本发明的主要目的之一是口蹄疫病毒原液和疫苗成品在4_8°C以外的条件下保持 其效价的稳定性或免疫原性的稳定性，在生产过程和使用过程超低温保存（_60°C以下）病 毒制备液，克服贮存、运输和临床使用或田间使用时疫苗效价下降或无效的问题。发明提 供了液体配方，保持口蹄疫病毒146S颗粒的完整性和含量稳定，在4°C下至少保存6月， 60-100%的病毒完整、含量稳定。
[0022] 本发明提供更重要的是冻干配方，可保持高度纯化口蹄疫病毒长期稳定，以便高 效稳定的抗原库的建立和维持。
[0023] 液体配方
[0024] 本发明提供的液体长期贮存稳定的口蹄疫完整病毒颗粒配方需要多元醇，单独使 用甘油时，甘油的浓度可达20-30% v/v，4°C贮存完整口蹄疫病毒长达6月，易于高压消毒， 多用于药用的注射制剂，安全，是各个国家和地区批准使用的赋型剂之一。可保护多种病毒 的完整性。
[0025] 另外一种多元醇是聚乙二醇，由多种分子量的形式，只有PEG 400和PEG 300用于 注射制剂，浓度可达30% v/v，无毒和无辐射。此外，聚氧丙烯甘油醚也无毒、多用于口服和 注射药用制剂，并有防腐抗菌的作用。
[0026] Tween-20或Tween-80,本发明筛选医学或兽医学允许使用的原辅材料，非动物来 源的非离子表面活性剂Tween-20或Tween-80,和传统有佐剂中的司本-80,性质类似，可使 用在本发明的赋型剂或病毒保护剂中，但需要低浓度使用方可发挥保护病毒结构、大小和 活性的作用，高浓度则起反作用，使疫苗效果降低或失效。选用吐温-20,在疫苗有效剂量中 的含 0· 003-0. 03mg/mL。
[0027] 药