一种抗o型口蹄疫的疫苗组合物及其制备和应用
【专利摘要】本发明公开了三种O型口蹄疫病毒样颗粒以及抗O型口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法。本发明提供的病毒样颗粒结构，口蹄疫的表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，可以很好地刺激B、T细胞，引起免疫应答；在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效期长，持续刺激免疫反应，尤其是O型口蹄疫病毒Ⅰ病毒样颗粒，为CATHAY型变异株，解决了CATHAY型变异株一直以来免疫原性较差的问题，可以有效应对CATHAY型变异株的侵袭；本发明还提供一种优化的病毒样颗粒结构，提高了病毒样颗粒的稳定性，不仅温度稳定性及酸性环境稳定性增加，而且意外发现，优化后的病毒样颗粒的疫苗组合物免疫持续期显著增长。
【专利说明】
一种抗0型口蹄疫的疫苗组合物及其制备和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及一种抗〇型口蹄疫的疫苗 组合物。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是 哺乳类动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭 受口蹄疫危害的动物包括牛、羊、山羊和猪。致病因子，口蹄疫病毒（FMDV)，是小核糖核酸 病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型（A、0、C、Asia l、SATl、SAT2jPSAT3 型），其中0型口蹄疫病毒流行最为广泛。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有 效措施。传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗，他们虽然具有较好的免疫原性，也确实在 FMD的预防和控制中起到了非常重要的作用。但是也存在以下几个缺点：1.病毒必须在高 度密封的设备中生产，以防止污染周围环境；生产过程中，病毒有可能没有完全杀死或充分 减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。 2.有效期很短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的难度。3.灭活苗 免疫与感染FMD的动物区分不开，限制了动物出口。4.生产依赖于FMDV，故而不能彻底消 灭FMDV。目前使用的灭活疫苗和减毒疫苗防控已不能适应当前畜牧业的健康发展。
[0003] 基因工程疫苗相比来说安全稳定性比较好，同时能给被免疫的动物提供有效的保 护效果。但是仅仅是用抗原决定簇的表达蛋白来做疫苗，由于其分子小，结构简单，往往并 不能起到很好的免疫效果；只有将抗原决定簇与大分子物质（如脂质体或者蛋白等）一起 免疫才能诱导机体产生有效的免疫反应。
[0004] 病毒样颗粒（VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自主包装成病毒外壳结 构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs 疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为 理想的疫苗形式。然而，〇型口蹄疫病毒抗原性很弱，尤其是我国流行的CATHAY型变异株， 其抗原发生较大变异，原有疫苗对其保护力明显下降，加之自身免疫原性较弱，不能诱导动 物机体产生足够的免疫力。因此，筛选理想的毒株序列制备病毒样颗粒是当务之急，也符合 国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。
[0005] 此外，0型口蹄疫各亚型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫，在我国，0型 口蹄疫CATHAY型及其变异株长期流行，加上近年SEA型的流行，使得0型口蹄疫的流行更 趋复杂化，迫切需要能同时防治三种亚型感染的新型疫苗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，要解决的第一个技术问题是提供一种0型 口蹄疫病毒样颗粒，其中，病毒样颗粒由结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成。
[0007] 优选地，本发明提供的0型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO. 2, VP2氨基酸序列为SEQ ID NO. 4, VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 6, VP1氨基酸序列为 SEQ ID NO. 8。
[0008] 优选地，本发明提供的0型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO. 10, VP2氨基酸序列为SEQ ID NO. 12, VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 14, VP1氨基酸序列 为 SEQ ID NO. 16。
[0009] 优选地，本发明提供的0型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO. 18, VP2氨基酸序列为SEQ ID NO. 20, VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 22, VP1氨基酸序列 为 SEQ ID NO. 24。
[0010] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种预防和/或治疗0型FMDV感染的疫 苗组合物，包含0型口蹄疫病毒氨基酸序列为SEQ ID N0. 2所示的VP4、SEQ ID N0. 4所示的 VP2、SEQ ID NO. 6所示的VP3、SEQ ID NO. 8所示的VP1组成的病毒样颗粒和/或氨基酸序 列为 SEQ ID NO. 10 所示的 VP4、SEQ ID NO. 12 所示的 VP2、SEQ ID NO. 14 所示的 VP3、SEQ ID NO. 16所示的VP1组成的病毒样颗粒和/或氨基酸序列为SEQ ID NO. 18所示的VP4、SEQ ID NO. 20所示的VP2、SEQ ID NO. 22所示的VP3、SEQ ID NO. 24所示的VP1组成的病毒样 颗粒及佐剂。
[0011] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗0型FMDV感染的疫苗组合物，所述编码0 型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4的核苷酸序列为SEQ ID N0. 1，VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3, VP3的核苷酸序列为SEQ ID NO. 5, VP1的核苷酸序列为SEQ ID NO. 7。
[0012] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗0型FMDV感染的疫苗组合物，所述编码0 型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4的核苷酸序列为SEQ ID N0.9，VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO. 11，VP3的核苷酸序列为SEQ ID NO. 13, VP1的核苷酸序列为SEQ ID NO. 15。
[0013] 优选地，本发明提供的预防和/或治疗0型FMDV感染的疫苗组合物，所述编码0 型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4的核苷酸序列为SEQ ID NO. 17，VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO. 19, VP3的核苷酸序列为SEQ ID NO. 21，VP1的核苷酸序列为SEQ ID NO. 23。
[0014] 作为本发明的另外一种实施方式，本发明提供的预防和/或治疗0型FMDV感染的 疫苗组合物包含氨基酸序列为SEQ ID N0. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24及核苷酸序 列为 SEQ ID N0. 1，3, 5, 7, 9, 11，13, 15, 17, 19, 21，23 所示的变体。
[0015] "变体"旨在表示基本上类似序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸之内 的一个或更多位点的一个或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一个 或更多位点的一个或更多核苷酸的取代。如本文所用，"天然"多核苷酸或多肽分别包含天 然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸（即，参照多核苷酸）的变体 也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分率序 列同一性来评价。"变体"蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多 氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而 源于天然蛋白的蛋白。本发明包括的变体蛋白有生物学活性，即，它们有引发免疫应答的能 力，能对0型FMDV攻击具有保护性反应的能力。
[0016] 变体包括等位基因变体。术语〃等位基因变体〃指称含有导致蛋白的氨基酸序列 变化及在天然的群（例如，病毒物种或变种）之内存在的多态性的多核苷酸或多肽。该天 然的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽的1%~5%变异。等位基因变体可通过在 许多不同物种中测序目的核酸序列来鉴定，其可通过使用鉴定那些物种中的相同的遗传座 位的杂交探针来容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或是天然的等位 基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的变异旨在本发明的范围之内。
[0017] 术语"预防"指通过其与0型FMDV相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语 "治疗"指通过与〇型FMDV相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
[0018] 术语"保护性反应"意为在动物中预防0型FMDV相关疾病或由0型FMDV导致的 感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
[0019] 本发明涉及的0型FMDV蛋白，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发 明实施方式的蛋白序列包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0020] "基本上相同"可以理解为本发明的蛋白优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID N0 :2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24中所示的序列的部分或全部具有至少70%同 源性，或甚至优选地80 %同源性，或甚至更优选地90 %同源性，或最优选地95 %同源性。
[0021] 在本文中术语"同源性"还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简 单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具），本领域技术人员公知的程序进 行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0022] 术语"佐剂"指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知 的佐剂包括，但不限于：（1)氢氧化错，阜苷（Saponine)(例如QuilA)，阿夫立定，DDA，（2) 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或（3)疫苗可以 以水包油，油包水或水包油包水乳剂形式制成。
[0023] 尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃， 特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油 酸乙基酯，丙二醇二（辛酸酯/癸酸酯），甘油三（辛酸酯/癸酸酯），丙二醇二油酸酯；分 支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非 离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸（例如油酸），脱水山梨糖醇、甘露醇（例如脱 水甘露醇油酸酯）、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、 羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇（例如油醇）的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚 物，特别是 PluronicR，尤其是 L121(参照 Hunter 等，1995, "The Theory and Practical Application ofAdjuvants"（Steward_Tull，D.E.S 主编）John Wiley andSons，NY，51_94; Todd 等，Vaccine，1997,15, 564-570)〇
[0024] 特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化 合物被称作卡波姆。
[0025] 优选地，本发明选用佐剂ISA 206 (法国赛比克公司），制备水包油包水乳剂。
[0026] 在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10 %到60% V/V，优选从30 %到50% V/V，更优选 50% V/V。
[0027] 本发明通过在结构蛋白VP2第93位氨基酸突变为半胱氨酸、VP1第17位氨基酸 突变为天冬氨酸，在核苷酸水平上，相当于用编码半胱氨酸和天冬氨酸的密码子置换原来 的密码子，提高了病毒样颗粒的稳定性，无论在热环境条件下，还是在酸环境条件下，其稳 定性大大增强。不仅如此，意外发现，通过结构优化的病毒样颗粒制备的疫苗组合物在免疫 持续期显著长于优化前的病毒样颗粒制备的疫苗组合物。
[0028] 在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗0型FMDV感染的疫苗组合 物，由三种0型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成；
[0029] 所述病毒样颗粒由0型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4 的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2，VP2的氨基酸序列为SEQ ID N0.4，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 6，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 8,但SEQ ID NO. 4第93位氨基酸突变为半胱氨酸，SEQ ID N0. 8第17位氨基酸突变为天冬氨酸；
[0030] 所述病毒样颗粒由0型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4 的氨基酸序列为SEQ ID NO. 10，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO. 12，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 14, VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 16,但SEQ ID NO. 12第93位氨基酸突变为半胱氨 酸，SEQ ID NO. 16第17位氨基酸突变为天冬氨酸；
[0031] 所述病毒样颗粒由0型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4 的氨基酸序列为SEQ ID NO. 18，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO. 20，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 22, VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 24,但SEQ ID NO. 20第93位氨基酸突变为半胱氨 酸，SEQ ID NO. 24第17位氨基酸突变为天冬氨酸。
[0032] 本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗0型FMDV感染的疫苗组合物的 制备方法，包括：
[0033] (1)制备0型口蹄疫病毒样颗粒的步骤；
[0034] (2)加入佐剂，乳化的步骤。
[0035] 本发明疫苗组合物进一步包含亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒和/或A型口蹄疫病毒 样颗粒。
[0036] 优选地，本发明所述的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒为亚洲1型口蹄疫病毒JSL株 制备。
[0037] 优选地，本发明所述A型口蹄疫病毒样颗粒为A型口蹄疫病毒WH/09株制备。
[0038] 本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本 发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂（如：a _干扰素、0 _干扰素、y -干 扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)和白介素 2 (IL2))，抗氧化剂，表面活性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了 制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
[0039] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在 组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年 龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0040] 优选地，本发明疫苗组合物每种病毒样颗粒含量为50-150 y g/ml。
[0041] 更优选地，所述疫苗组合物每种病毒样颗粒含量为100 y g/ml。
[0042] 本发明具有以下突出的优点：
[0043] (1)本发明提供的疫苗组合物制备安全，无减毒疫苗、灭活疫苗可能引起的致病作 用；
[0044] (2)本发明提供的病毒样颗粒结构，口蹄疫的表位被有效呈递在病毒样颗粒的表 面，可以很好地刺激B、T细胞，引起免疫应答；
[0045] (3)本发明提供病毒样颗粒疫苗的结构在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效 期长，持续刺激免疫反应，尤其是〇型口蹄疫病毒I病毒样颗粒，为CATHAY型变异株，解决 了 CATHAY型变异株一直以来免疫原性较差的问题，能很好地对机体提供免疫保护，可以有 效应对CATHAY型变异株的侵袭；
[0046] (4)本发明还提供一种优化的病毒样颗粒结构，提高了病毒样颗粒的稳定性，不仅 温度稳定性及酸性环境稳定性增加，而且意外发现，优化后的病毒样颗粒的疫苗组合物免 疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。
[0047] 序列表中：
[0048] 序列1为0型口蹄疫病毒I VP4蛋白核苷酸序列；
[0049] 序列2为0型口蹄疫病毒I VP4蛋白氨基酸序列；
[0050] 序列3为0型口蹄疫病毒I VP2蛋白核苷酸序列；
[0051] 序列4为0型口蹄疫病毒I VP2蛋白氨基酸序列；
[0052] 序列5为0型口蹄疫病毒I VP3蛋白核苷酸序列；
[0053] 序列6为0型口蹄疫病毒I VP3蛋白氨基酸序列；
[0054] 序列7为0型口蹄疫病毒I VP1蛋白核苷酸序列；
[0055] 序列8为0型口蹄疫病毒I VP1蛋白氨基酸序列；
[0056] 序列9为0型口蹄疫病毒II VP4蛋白核苷酸序列；
[0057] 序列10为0型口蹄疫病毒II VP4蛋白氨基酸序列；
[0058] 序列11为0型口蹄疫病毒II VP2蛋白核苷酸序列；
[0059] 序列12为0型口蹄疫病毒II VP2蛋白氨基酸序列；
[0060] 序列13为0型口蹄疫病毒II VP3蛋白核苷酸序列；
[0061] 序列14为0型口蹄疫病毒II VP3蛋白氨基酸序列；
[0062] 序列15为0型口蹄疫病毒II VP1蛋白核苷酸序列；
[0063] 序列16为0型口蹄疫病毒II VP1蛋白氨基酸序列；
[0064] 序列17为0型口蹄疫病毒III VP4蛋白核苷酸序列；
[0065] 序列18为0型口蹄疫病毒III VP4蛋白氨基酸序列；
[0066] 序列19为0型口蹄疫病毒III VP2蛋白核苷酸序列；
[0067] 序列20为0型口蹄疫病毒III VP2蛋白氨基酸序列；
[0068] 序列21为0型口蹄疫病毒III VP3蛋白核苷酸序列；
[0069] 序列22为0型口蹄疫病毒III VP3蛋白氨基酸序列；
[0070] 序列23为0型口蹄疫病毒III VP1蛋白核苷酸序列；
[0071] 序列24为0型口蹄疫病毒III VP1蛋白氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0072] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0073] 本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7. 4的PBS，配制方法： NaCl 8. 0g，KC1 0? 2g，KH2P040 . 24g，Na2HP04 ? 12H20 3. 628g，溶于 800ml 蒸馏水中，用盐酸 调pH值为7. 4,蒸馏水定容至1000ml，121°C高压灭菌20min，室温保存。
[0074] 实施例1
[0075] 具有序列 SEQ ID N0. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 的口蹄疫的蛋白表达
[0076] 1.用做模板的口蹄疫基因片段的制备
[0077] 分别将序列SEQ ID N0. 1、3、5、7所示的0型口蹄疫病毒I VP4、VP2、VP3、VP1基 因，序列3￡〇10勵.9、11、13、15所示的0型口蹄疫病毒11￥?4、￥?2、￥?3、￥?1基因，序列5￡〇 ID N0. 17、19、21、23所示的0型口蹄疫病毒IIIVP4、VP2、VP3、VP1基因全长由生工生物工 程（上海）股份有限公司合成。所合成的基因片段全长分别为255bp、654bp、660bp、639bp， 255bp、654bp、660bp、639bp，255bp、654bp、660bp、639bp。在此人工合成的口蹄疫基因片段 的基础上制备本发明的口蹄疫基因的模板。
[0078] 2. 口蹄疫基因表达载体的构建
[0079] 以前一步骤所合成的口蹄疫基因模板。分别设计引物（见表1)，扩增获得0型口 蹄疫病毒1￥?4、￥?2、￥?3、￥?1基因 ；0型口蹄疫病毒11￥?4、￥?2、￥?3、￥?1基因；0型口蹄 疫病毒III VP4、VP2、VP3、VP1 基因。
[0080] 表1引物表
[0083] 在PCR仪上按如下条件（见表2)进行PCR反应：
[0084] 表2PCR扩增条件
[0086] 分别将不同血清亚型的0型口蹄疫扩增得到的VP4、VP2、VP3、VP1基因DNA片 段分别与pBLUE-T Vector载体连接，将连接成功的重组克隆分别经BamH I/EcoR I、 PstI/XbaI、Sac I/Sal I、Hind Ill/Xho I酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切 的pET 28a载体连接，得到插入0型口蹄疫病毒I ￥?4、￥?2、￥?3、￥?1基因的阳性克隆 pET28a- I -VP4-VP2-VP3-VP1 ;插入 0 型口蹄疫病毒 II VP4、VP2、VP3、VP1 基因的阳性克隆 pET28a- II -VP4-VP2-VP3-VP1 以及插入 0 型口蹄疫病毒III VP4、VP2、VP3、VP1 基因的阳性 克隆pET28a- III -VP4-VP2-VP3-VP1。将连接好的质粒转化到用CaC12制备的DH5a感受态 细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆 至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37°C 230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。
[0087] 3.将上述的插入0型口蹄疫病毒I VP4、VP2、VP3、VP1基因的阳性克隆 pET28a- I -VP4-VP2-VP3-VP1 ;插入 0 型口蹄疫病毒 II VP4、VP2、VP3、VP1 基因的阳性克 隆 pET28a- II -VP4-VP2-VP3-VP1 以及插入 0 型口蹄疫病毒 111￥?4、￥?2、￥?3、￥?1基因的阳 性克隆pET28a- III -VP4-VP2-VP3-VP1分别转化40 y 1以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37°C静置培养10-12小时至单菌落清晰 可见时，挑取单克隆至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37°C，230转/分振荡 培养12小时，从中取lml菌液于-80°C冻干保存。
[0088] 4?蛋白的大量表达
[0089] 从-80 °C 中取出带有重组质粒 pET28a- I -VP4-VP2-VP3-VP1、 pET28a- II -VP4-VP2-VP3-VP1 和 pET28a- III -VP4-VP2-VP3-VP1 的大肠杆菌菌种分别接种 卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37°C，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB 液体培养基中，37°C大量表达，等0D_值达到0. 6后，加入0.1 mM的IPTG，诱导蛋白表达， 20°C过夜。
[0090] 使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121°C 灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到0D 6。。大约10左右时将 培养温度降至25°C，加入4gIPTG诱导培养12小时。终浓度大约为40左右（0D_)下罐，离 心收集菌体大约2. 5kg。
[0091] 按照lg菌体对应10ml裂解液的比例重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌 体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15% SDS-PAGE电泳检测，此时上清中三个 血清亚型中的四个串联表达的蛋白其各自表达量均在20%左右。采用硫酸铵分级沉淀法进 行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了 纯化和富集。
[0092] 通过磷钨酸负染及电镜观察可见三种口蹄疫蛋白均形成了类病毒样颗粒，并且形 成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将这三种口蹄疫病毒样颗粒置于4°C 下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。 说明本发明筛选的序列制备的三种口蹄疫蛋白均形成了稳定的类病毒样颗粒。
[0093] 实施例2
[0094] 抗0型口蹄疫的疫苗组合物的制备
[0095] 取实施例1制备的0型口蹄疫病毒I病毒样颗粒、0型口蹄疫病毒II病毒样颗粒 和0型口蹄疫病毒III病毒样颗粒，缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为SOOrpm乳化 机搅拌12min，混匀，4°C保存，即为抗0型口蹄疫的疫苗组合物。具体配比见表3。适用于 本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本实施例中，选用佐剂ISA 206(法国 赛比克公司）。
[0096] 表3抗0型口蹄疫的疫苗组合物成分配比
[0097]
[0098] 实施例3
[0099] 抗0型口蹄疫的单价疫苗的免疫原性试验
[0100] 1 ?免疫程序
[0101] 利用口蹄疫〇型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛20 头，随机分为4组，每组5头。1-3组分别为本发明实施例2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3免 疫组，第4组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射lml，PBS对照组免疫等量的 PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21日。
[0102] 2.抗体水平检测
[0103] 对采集的血清使用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果 显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天不同疫苗免疫的牛只抗体水平均 开始上升，免疫后21天均能达到1 :128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。具体 结果见表4。
[0104] 表4不同疫苗免疫牛只后口蹄疫ELISA抗体水平
[0105]
[0106] 证明本发明制备的三种病毒样颗粒均能快速形成高水平的特异性抗体，解决了 0 型口蹄疫免疫原性较差的问题，尤其是CATHAY型变异株免疫原性较差的问题，能对机体起 到很好的免疫保护作用。
[0107] 实施例4
[0108] 抗0型口蹄疫的多价疫苗的免疫原性试验
[0109] 1 ?免疫程序
[0110] 利用口蹄疫〇型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛25 头，随机分为5组，每组5头。1-4组分别为本发明实施例2制备的疫苗4、疫苗5、疫苗6、 疫苗7免疫组，第5组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射lml，PBS对照组免 疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21日。
[0111] 2.抗体水平检测
[0112] 对采集的血清使用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果 显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天不同疫苗免疫的牛只抗体水平均 开始上升，免疫后21天均能达到1 :128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。具体 结果见表5。
[0113] 表5多价疫苗免疫牛只后口蹄疫ELISA抗体水平
[0114]
[0116] 证明本发明制备的多价疫苗组合物能快速形成高水平的特异性抗体，能对机体起 到很好的免疫保护作用。
[0117] 实施例4
[0118] 抗0型口蹄疫的疫苗组合物的免疫原性比较试验
[0119] 1 ?免疫程序
[0120] 利用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体阴性的6月龄的健康黄牛15头， 随机分为3组，每组5头。第1组为本发明实施例2制备的疫苗6免疫组，第2组为市售商 品化0型口蹄疫全病毒二价灭活疫苗（金宇保灵生物药品有限公司生产，批号4136011)， 第3组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射，第1组免疫lml，第2组免疫2ml， PBS对照组免疫2ml的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后 21日。
[0121] 2.抗体水平检测
[0122] 对采集的血清使用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果 显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天不同疫苗免疫的牛只抗体水平均 开始上升，免疫后21天均能达到1 :128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。详细 抗体检测情况见表6,表明本发明疫苗组合物能产生更高的抗体水平。
[0123] 表6不同疫苗免疫牛只后ELISA抗体水平
[0125] 证明了本发明提供的疫苗组合物，其抗原表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面， 比全病毒疫苗能更好地刺激B、T细胞，引起免疫应答。与全病毒疫苗相比，本发明提供的疫 苗组合物在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效期长，持续刺激免疫反应，其抗体水平 远高于全病毒疫苗。
[0126] 实施例5
[0127] 抗口蹄疫的疫苗组合物病毒样颗粒结构的优化
[0128] 将SEQ ID N0. 4第93位氨基酸Ser突变为Cys，SEQ ID N0. 8第17位氨基酸Asn 突变为Asp，SEQ ID NO. 12第93位氨基酸Ser突变为Cys，SEQ ID NO. 16第17位氨基酸 Asn突变为Asp，SEQ ID N0. 20第93位氨基酸Ser突变为Cys，SEQ ID N0. 24第17位氨基 酸Asn突变为Asp。根据突变后的氨基酸序列参考实施例1的方法制备抗0型口蹄疫的病 毒样颗粒。
[0129] 实施例6
[0130] 优化的抗口蹄疫的疫苗组合物病毒样颗粒结构的稳定性检验
[0131] 将实施例1及实施例5制备的病毒样颗粒分别置于50°C水浴中1小时及pH6. 0条 件下处理30分钟，然后在电镜下观察。结果显示优化的病毒样颗粒无论是在热环境下还是 在酸性条件下，其病毒样颗粒大小均匀，呈空心形态；而未优化的病毒样颗粒出现聚团，颗 粒大小不一。具体结果见表7。
[0132] 表7 口蹄疫病毒样颗粒稳定性检验
[0134] 证明了本发明提供的优化后的疫苗组合物的病毒样颗粒结构的稳定性进一步增 强，其有利地保障了疫苗组合物在不同环境下结构的稳定性，有利于储存与运输，保证了疫 苗性状的稳定性。
[0135] 实施例7
[0136] 优化的抗口蹄疫的疫苗组合物的制备
[0137] 取实施例5制备的0型口蹄疫病毒I病毒样颗粒、0型口蹄疫病毒II病毒样颗粒 和0型口蹄疫病毒III病毒样颗粒，按照实施例2的制备方法制备抗0型口蹄疫的疫苗组合 物。具体配比见表8。
[0138] 表8优化的抗0型口蹄疫的疫苗组合物的成分配比
[0139]
[0140] 实施例8
[0141] 优化的抗口蹄疫的疫苗组合物免疫持续期对比试验
[0142] 1 ?免疫程序
[0143] 利用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体阴性的6月龄的健康黄牛15头， 随机分为3组，每组5头。第1组为本发明实施例2制备的疫苗6免疫组，第2组为本发 明实施例7制备的疫苗8免疫组，第3组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射 lml，PBS对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每月采血，连续采血至免 疫后6个月。
[0144] 2.抗体水平检测
[0145] 对采集的血清分使用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒进行抗体的检测。结果显 示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后4个月疫苗6免疫的牛只抗体水平均开始 下降，而疫苗8依然保持较高的抗体水平。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。详细抗体 检测情况见表9。
[0146] 表9免疫持续期对比试验ELISA抗体水平
[0148] 证明了本发明提供的优化的病毒样颗粒结构，提高了病毒样颗粒的稳定性，不仅 温度稳定性及酸性环境稳定性增加，而且意外发现，优化后的病毒样颗粒的疫苗组合物免 疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。
[0149] 实施例9
[0150] 抗口蹄疫的疫苗组合物的功效应用
[0151] 1.免疫程序
[0152] 利用田间猪场200头，随机分为10组，每组20头，免疫本发明制备的疫苗6,免疫 途径为颈部肌肉注射lml。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21 曰。
[0153] 2.抗体水平检测
[0154] 对采集的血清使用口蹄疫0型抗体ELISA检测试剂盒进行抗体的检测。结果显示， 疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，免疫后7天疫苗免疫的猪只抗体水平均开始上升， 免疫后21天均能达到1 :128以上。详细抗体检测情况见表10。
[0155] 表10疫苗免疫猪只后ELISA抗体平均水平
[0156]
[0157] 证明了本发明提供的疫苗组合物能快速形成高水平的特异性抗体，对猪只起到良 好的免疫保护作用。
[0158] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽 然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种0型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由0型口蹄疫病毒的结 构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中，所述的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO. 2， VP2氨基酸序列为SEQ ID NO. 4，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 6，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 8。2. -种0型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由0型口蹄疫病毒的结 构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中，所述的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO. 10， VP2氨基酸序列为SEQ ID NO. 12, VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 14, VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 16。3. -种0型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由0型口蹄疫病毒的结 构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中，所述的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO. 18， VP2氨基酸序列为SEQ ID NO. 20, VP3氨基酸序列为SEQ ID NO. 22, VP 1氨基酸序列为SEQ ID NO. 24。4. 一种抗0型口蹄疫的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1和/或权 利要求2和/或权利要求3所述的0型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂。5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物中每种病毒样颗粒含 量为 50-150 μ g/ml。6. 根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物中每种病毒样颗粒含 量为 100 μ g/ml。7. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含亚洲1型口 蹄疫病毒样颗粒和/或A型口蹄疫病毒样颗粒。8. -种抗0型口蹄疫的疫苗组合物，其特征在于， 所述疫苗组合物由三种〇型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成； 所述第一种病毒样颗粒由〇型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中 VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2, VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO. 4, VP3氨基酸序列为 SEQ ID NO. 6, VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 8,但SEQ ID NO. 4第93位氨基酸突变为半胱 氨酸，SEQ ID NO. 8第17位氨基酸突变为天冬氨酸； 所述第二种病毒样颗粒由〇型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中 VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO. 10，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO. 12，VP3氨基酸序列为 SEQ ID NO. 14, VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 16,但SEQ ID NO. 12第93位氨基酸突变为半 胱氨酸，SEQ ID NO. 16第17位氨基酸突变为天冬氨酸； 所述第三种病毒样颗粒由〇型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中 VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO. 18，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO. 20，VP3氨基酸序列为 SEQ ID NO. 22, VP1氨基酸序列为SEQ ID NO. 24,但SEQ ID NO. 20第93位氨基酸突变为半 胱氨酸，SEQ ID NO. 24第17位氨基酸突变为天冬氨酸。9. 一种制备权利要求4-8所述疫苗组合物的方法，其中，所述的制备方法包括： 1) 制备口蹄疫病毒样颗粒的步骤； 2) 加入佐剂，乳化的步骤。10. 权利要求1-3所述的病毒样颗粒以及权利要求4-8所述的疫苗组合物在制备抗0 型口蹄疫相关的药物中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK105821011SQ201510006557
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】张许科, 袁于人, 孙进忠, 陈红英, 肖燕, 田克恭
【申请人】普莱柯生物工程股份有限公司, 斯澳生物科技（苏州）有限公司