一种铁蛋白轻链单克隆抗体及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种铁蛋白轻链(Ferritin light chain)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的抗体的应用。所述单克隆抗体能够用于检测肿瘤的诊断、疗效等。CGMCC No. 1204320160310
【专利说明】
一种铁蛋白轻链单克隆抗体及其应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种铁蛋白轻链(Ferritin light chain)的单克隆抗体、分泌该单克 隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的抗体的应用。
【背景技术】
[0002] 铁是细胞生存必需的微量元素之一，铁缺乏导致人体的缺铁性贫血、儿童发育迟 缓;但细胞内的铁过多则可诱发自由基增多，进而造成脂质、蛋白质、碳水化合物及核酸等 生物大分子的损伤，最终导致细胞死亡。铁蛋白对于保持细胞内的铁平衡至关重要。
[0003] 铁蛋白（Ferritin，Fer)为机体内一种贝士存铁的可溶组织蛋白，是一种含24个亚单 位的球形糖蛋白，分子量约为450KD。每个亚单位由Fer轻链(Ferritin light chain，肝脏 型)和Fer重链(Fer heavy chain，心脏型)两种亚基复合而成。Fer轻链和Fer重链的相对分 子质量分别为19KD和21KD。铁分子以水合氧化铁的无机形式储存在Fer内部（lhFer的主要 作用是贮存和调节铁，当体内铁增加时，Fer可以将铁摄入并贮存，这就避免了细胞内高浓 度游离铁对细胞的毒性作用，当体内需铁量增加时，Fer可随时释放铁，供机体需要。Fer水 平降低是缺铁性贫血的表现，水平升高则反映了包括恶性肿瘤、炎症、肝脏疾病和反复输血 等诸多因素的影响。近年来研究发现，肿瘤组织可以合成和分泌Fer，F er水平升高可见于肝 癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病等多种恶性肿瘤中（2)。
[0004] 铁参与肿瘤细胞增殖，铁与过氧化物反应引起DNA的氧化损伤从而引发肿瘤。体内 铁存储量高与癌症的发生危险呈负相关。Fer水平是反映体内铁存储的指标，大多数恶性肿 瘤，特别是有淋巴结、肝脏等转移时，Fer水平显著增加。铁蛋白轻链（Ferritin light chain，FTL)是组成细胞内铁蛋白复合体的重要亚基之一，可加速铁从亚铁氧化酶中心向铁 核内的转移，提高铁蛋白结合铁的能力，对长期储存铁非常重要。它大部分位于细胞质中， 极少量位于细胞外如血清和脑脊液中（3)。研究表明当细胞内氧化应激增高时，铁蛋白轻链 能够与肿瘤抑制基因P53发生相互作用，进而诱导p53的表达（4)。肿瘤坏死因子aUumor necrosis factorya，TNF-a)能够诱导细胞内FTL蛋白降解，说明FTL参与调节细胞内应激信 号通路(5)。
[0005] Fer作为肿瘤标志物之一，联合其他肿瘤标志物检测，可提高诊断的准确度，为肿 瘤的诊断、疗效、预防以及是否转移和多发的判断指标。
【发明内容】
[0006] 为了克服以上问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细 胞系的保藏号为CGMCC No.12043。
[0007] 另一方面提供了一种由前述的杂交瘤细胞系分泌的铁蛋白轻链的单克隆抗体，其 特征在于，其能够特异地结合铁蛋白轻链，优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。
[0008] 另一方面提供了前述的杂交瘤细胞及前述的单克隆抗体在检测靶结构铁蛋白轻 链中的应用。
[0009] 另一方面提供了前述的杂交瘤细胞和/或前述的单克隆抗体的试剂盒。
[0010] 另一方面提供了前述的杂交瘤细胞及前述的单克隆抗体在检测癌细胞的试剂盒 中的应用，所述癌细胞优选为肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病。
[0011] 另一方面提供了前述的杂交瘤细胞及前述的单克隆抗体在用于肿瘤的诊断、疗 效、预防的试剂盒中的应用。
[0012] 本发明还提供了前述杂交瘤和单克隆抗体的制备方法：
[0013] 1 ?抗原制备
[0014] (1)获得目的基因
[0015] 从北京义翘神州生物技术有限公购买铁蛋白轻链基因的cDNA模板，货号： HG16460-G，并以cDNA为模板PCR扩增Ferritin light chain基因。
[0016] (2)构建重组表达载体
[0017]将步骤（1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体 pET41a，构建重组质粒pET41a-Ferr it in light chain。载体经过酶切和测序鉴定后用于转 化表达细菌。
[0018] (3)获得含重组表达质粒的表达菌种
[0019]将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单克隆用于抗原表达。
[0020] (4)诱导表达和纯化
[0021]将含有表达质粒的R〇setta(DE3)细菌单克隆接种于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37度，220rpm培养10hr。将菌液按1:100稀释倍数接种于200ml新鲜的LB培养 基，培养至0D值为0.6，加入0.1 mM IPTG诱导表达，20度5hr，收集菌液超声破碎，从上清中纯 化重组抗原Ferritin light chain。
[0022] 2.单克隆抗体的制备和纯化 [0023] (1)免疫动物
[0024] 一般使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射。 [0025] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液（100ul纯化的重 组蛋白Ferritin light chain(用1XPBS稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原）。
[0026] 第二次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul纯化的 重组蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原）。 [0027]第三次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul纯化的重组蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含 l〇〇ug抗原）。
[0028]测效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用常规的western法检 测效价，选择效价达到1:1000的小鼠用于融合。
[0029]加强免疫融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体（含 60ug抗原，溶剂为1 X PBS，pH7 ? 4)。
[0030] (2)细胞融合
[0031] 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平皿 中研磨，制备细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合剂聚乙二醇（50% )。采用HAT选择培养基，进行杂交瘤细胞的选 择性培养和筛选。
[0032]用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:将抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓 冲液)稀释为8ug/ml加入96孔酶标板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被过夜。弃去包被液，用 PBST (磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板三次，加入封闭液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸盐缓冲液），l〇〇ul/孔，37 °C孵育1小时。弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板lOOul/well，同时加入PBST(磷酸盐缓 冲液)作为阴性对照。37°C孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul终止液（2mol/L硫酸）。使用酶标仪测 定，酶标仪设置为:450nm比色。和阴性对照相比，如果是0D值2.5倍之上就是阳性。最后筛选 得到一株效价最好的抗Ferritin light chain的杂交瘤细胞株，命名为1A2,亚型鉴定为 IgG2b。
[0033]将筛选出的阳性杂交瘤细胞株1A2进行单克隆筛选(有限稀释法），获得能产生高 效价（间接ELISA稀释比>1:5，000)单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培 养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人Ferritin light chain杂交瘤细胞系1A2， 该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12043。
[0034] (3)单克隆抗体的制备与纯化
[0035]将步骤(2)获得的细胞株1A2接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中纯 化抗体(所获抗体命名为anti-Ferritin light chain)。
[0036] 抗Ferritin light chain单克隆抗体的纯化:使用Protein G亲和纯化法。将用PB 溶液平衡好的Protein G填料装入纯化柱中，加入经PB溶液稀释的单克隆抗体anti-Ferritin light chain的腹水过柱。上样结束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然 后用0.1M pH3.0的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，收集整个洗脱峰的溶液。洗脱液经过透析浓缩并 更换为?83溶液。505^^6￡结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。
[0037]本发明的小鼠杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 12043,保藏单位为中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所;保藏日期为2016年3月10日。
【附图说明】
[0038] 图l、Ferritin light chain抗体十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE)检测。
[0039]图2、Ferritin light chain抗体的酶联免疫吸附试验（间接法）。
[0040] 图3、Ferritin light chain抗体的酶联免疫吸附试验(夹心法）。
[0041 ] 图4、Ferritin light chain抗体夹心ELISA检测人血清中铁蛋白。
【具体实施方式】
[0042]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
[0043] 试剂、酶、载体及细胞株：
[0044] (1)细胞株:HeLa (ATCC? CCL-2?)、大肠杆菌Rosetta (DE3) (Novagen)、骨髓瘤细 胞 SP2/0( ATCC?CRL-1581?)
[0045] (2)实验动物:雌性BALB/c小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）；
[0046] (3)载体：pET41a(Novagen)
[0047] (4)酶及抗体试剂:构建载体过程和PCR过程的各种酶购自Fermentas，ELISA实验 所用抗体anti-mouse IgG/HRP(Jackson ImmunoResearch)，ELISA底物TMB(Sigma)、逆转录 试剂盒(Fermentas)，BSA购自（北京元亨金马生物科技有限公司）
[0048] (5)其他试剂如无特别说明为国产分析纯。
[0049] 实施例1:杂交瘤细胞株1A2及其产生的单克隆抗体的获得
[0050] 1.抗原制备
[0051] (1)获得目的基因
[0052]从北京义翘神州生物技术有限公购买铁蛋白轻链基因的cDNA模板，货号： HG16460-G，并以cDNA为模板PCR扩增Ferritin light chain基因。
[0053] (2)构建重组表达载体
[0054]将步骤（1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体 pET41a，构建重组质粒pET41a-Ferr it in light chain。载体经过酶切和测序鉴定后用于转 化表达细菌。
[0055] (3)获得含重组表达质粒的表达菌种
[0056]将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单克隆用于抗原表达。
[0057] (4)诱导表达和纯化
[0058]将含有表达质粒的Rosetta(DE3)细菌单克隆接种于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37度，220rpm培养10hr。将菌液按1:100稀释倍数接种于200ml新鲜的LB培养 基，培养至0D值为0.6，加入0.1 mM IPTG诱导表达，20度5hr，收集菌液超声破碎，从上清中纯 化重组抗原Ferritin light chain。
[0059] 2.单克隆抗体的制备和纯化
[0060] (1)免疫动物
[0061] 一般使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射。 [0062] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液（100ul纯化的重 组蛋白Ferritin light chain(用1XPBS稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原）。
[0063] 第二次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul纯化的 重组蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原）。 [0064]第三次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul纯化的重组蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含 l〇〇ug抗原）。
[0065]测效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用常规的western法检 测效价，选择效价达到1:1000的小鼠用于融合。
[0066]加强免疫融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体（含 60ug抗原，溶剂为1 X PBS，pH7 ? 4)。
[0067] (2)细胞融合
[0068] 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平皿 中研磨，制备细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合剂聚乙二醇（50% )。采用HAT选择培养基，进行杂交瘤细胞的选 择性培养和筛选。
[0069]用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:将抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓 冲液)稀释为8ug/ml加入96孔酶标板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被过夜。弃去包被液，用 PBST (磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板三次，加入封闭液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸盐缓冲液），1 〇〇ul/孔，37°C孵育1小时。弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板lOOul/well，同时加入PBST(磷酸盐缓 冲液)作为阴性对照。37°C孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul终止液（2mol/L硫酸）。使用酶标仪测 定，酶标仪设置为:450nm比色。和阴性对照相比，如果是0D值2.5倍之上就是阳性。最后筛选 得到一株效价最好的抗Ferritin light chain的杂交瘤细胞株，命名为1A2,亚型鉴定为 IgG2b。
[0070]将筛选出的阳性杂交瘤细胞株1A2进行单克隆筛选(有限稀释法），获得能产生高 效价（间接ELISA稀释比>1:5，000)单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培 养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人Ferritin light chain杂交瘤细胞系1A2， 该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12043。
[0071] (3)单克隆抗体的制备与纯化
[0072]将步骤(2)获得的细胞株1A2接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中纯 化抗体(所获抗体命名为anti-Ferritin light chain)。
[0073] 抗Ferritin light chain单克隆抗体的纯化:使用Protein G亲和纯化法。将用PB 溶液平衡好的Protein G填料装入纯化柱中，加入经PB溶液稀释的单克隆抗体anti-Ferritin light chain的腹水过柱。上样结束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然 后用0.1M pH3.0的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，收集整个洗脱峰的溶液。洗脱液经过透析浓缩并 更换为?83溶液。505^^6￡结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。
[0074]实施例2:单克隆抗体鉴定及应用
[0075] 1 ?小鼠抗Ferritin light chain单克隆抗体(anti-Ferritin light chain)的间 接ELISA检测鉴定
[0076]用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:将抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓 冲液)稀释为lug/ml加入96孔酶标板中，100ul/孔，放入4°C冰箱中包被过夜。弃去包被液， 用TOST (磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板三次，加入封闭液3 % BSA-PBST (加入3 %牛血清白蛋白 的磷酸盐缓冲液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小时。弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗 板一次，甩干板子。将anti-Ferritin light chain按照不同的稀释比稀释后加入酶标板 lOOul/we 11，同时加入PBST(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。37 °C孵育1小时。弃上清，用洗板 机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小时。弃上 清，用洗板机PBST洗板三次，加底物了1?10〇111/?611，1^，避光37°(：，1〇-15111111后加入5〇111终 止液(2mol/L硫酸）。使用酶标仪测定，酶标仪设置为：450nm比色。
[0077]将不同抗体浓度下检测的0D值绘制成抗体ELISA滴定曲线，如图2所示，anti-Ferritin light chain的抗体效价可以达到0.17ng/ml〇
[0078] 2?小鼠抗Ferritin light chain单克隆抗体(anti-Ferritin light chain)的夹 心ELISA检测鉴定
[0079] 将anti-Ferritin light chain抗体用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲液)稀释 为lug/ml加入96孔酶标板中，100ul/孔，放入4°C冰箱中包被过夜。弃去包被液，用TOST(磷 酸盐缓冲液，PH7.4)洗板三次，加入封闭液3 % BSA-PBST (加入3 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓 冲液），100ul/孔，37°C孵育1小时。弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板一次，甩干 板子。将Ferritin light chain抗原按照不同的浓度加入酶标板100u 1 /we 11，浓度范围从 0. l-100ng/ml，同时加入PBST(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。37 °C孵育1小时。弃上清，用洗 板机TOST洗板三次，加入稀释好的anti-Ferritin兔多抗，lOOul/wel 1，37°C孵育1小时。弃 上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-rabbit IgG/HRP，100ul/Well，37°C孵育 1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加底物TMBlOOul/wel 1，RT，避光37°C，10_15min后 加入50ul终止液(2mol/L硫酸）。使用酶标仪测定，酶标仪设置为:450nm比色。
[0080] 将不同的抗原浓度检测的0D值绘制成浓度检测曲线，如图3所示，anti-Ferritin light chain抗体检测铁蛋白抗原的灵敏度可以达到0.5ng/ml。
[0081]随机挑选2种正常人的血清，并稀释成不同的浓度，采用上述的夹心ELISA方法检 测人血清中的Ferritin蛋白。从图4所示，anti-Ferritin light chain抗体能够很好的识 别人血清中的Ferritin蛋白，并且将人血清样品稀释64倍后也能够检测到明显的信号。表 明anti-Ferritin light chain抗体能够应用于临床检测人血清中Ferritin蛋白含量。 [0082] 参考文献
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[0084] 2.Shpyleva SI,Tryndyak VP,Kovalchuk 0.(2011)Role of ferritin alterations in human breast cancer cells[J].Breast cancer res treat,126(1): 63-71
[0085] 3.Paolo Arosio,Rosaria Ingrassia,Patrizia Cavadini.(2009)A family of molecules for iron storage,antioxidation and more[J].Biochimica et Biophysica Acta,1790(7):589-599
[0086] 4.Lee JH,Jang H,Cho EJ,Youn HD.(2009)Ferritin binds and activates p53under oxidative stress[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,389(3):399-404
[0087] 5.Stefania Recalcati,Pietro Invernizzi,Paolo Arosio,et al.(2008)New functions for an iron storage protein:the role of ferritin in immunity and autoimmunity[J].Journal of Autoimmunity,30(1-2):84-89。
【主权项】
1. 一种分泌的铁蛋白轻链的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细 胞系的保藏号为CGMCC No.12043。2. -种由权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌的铁蛋白轻链的单克隆抗体，其特征在 于，其能够特异地结合铁蛋白轻链，优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。3. 权利要求1所述的杂交瘤细胞及权利要求2所述的单克隆抗体在检测靶结构铁蛋白 轻链的应用。4. 一种包含权利要求1所述的杂交瘤细胞和/或权利要求2所述的单克隆抗体的试剂 盒。5. 权利要求1所述的杂交瘤细胞及权利要求2所述的单克隆抗体在检测癌细胞的试剂 盒中的应用，所述癌细胞优选为肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病。6. 权利要求1所述的杂交瘤细胞及权利要求2所述的单克隆抗体在用于肿瘤的诊断、疗 效、预防的试剂盒中的应用。
【文档编号】G01N33/574GK105821004SQ201610257559
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】聂子梅, 邱俊康, 张泰川, 蒋洪娇
【申请人】成都正能生物技术有限责任公司