一种抗gus蛋白质的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种可W识别人GUS(目-葡糖巧酸酶)蛋白质的单克隆分子及可分泌 该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗GUS分子的单克隆抗体，对该抗体 重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可W用于通 过人工或自动化方式，W流式细胞术、免疫组织化学染色（I肥)、酶联免疫吸附（ELISA)或 免疫印迹（WesternBlot)方式检测转基因植物（水稻、棉花、玉米等）、动物、细胞及微生 物中的GUS蛋白，也可用于含GUS蛋白的生物样本富集和分离，属于生物检测和分析领域。
[0003]
【背景技术】
[0004]GUS基因编码目-D-葡萄糖巧酶，该酶催化底物形成目-D-葡萄糖巧酸，它在植物 体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、英光等进行检测，是目前常用的一 种报告基因。但该种基于酶活性的检测方法，易受温度变化及加工过程的影响。报告基因 在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化 生物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现 已应用到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因该一 探路者的作用会更明显。
[0005] 随着转基因植物的不断发展及其商品化的种类不断增加，转基因生物本身的安全 性W及它们对人类健康和生态环境的潜在威胁成为国际社会和广大民众广泛关注的热点 问题之一。包括我国在内的越来越多的国家制定并实施了转基因食品的强制标识制度。因 此，转基因产品的科学管理和应用需要得到转基因产品及其成分检测技术的支持。
[0006]目前，转基因产品及成分检测最常用的方法有两类；一类是针对其外源核酸成分 的检测技术；另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法。基于DNA的检测方法只 能在核酸水平上反映转基因样品是否含有外源DNA，不能检测其外源基因是处于沉默还是 表达状态，此类检测技术对判读外源蛋白质丰度无指导性意义。对于某些转基因植物的产 品，DNA在加工过程中会降解掉而难W检测，此时，需要利用免疫分析法来检测转基因的组 分。基于外源蛋白质的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现对转基因植 物样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体。目前虽有抗GUS 兔单克隆抗体制备的报道(沈金儿倪庚郑晓冬，抗目-葡萄糖巧酸酶（目-GU巧兔单克 隆抗体的制备和鉴定。中国食品学报，2012,第11期)，但该抗体对重组蛋白的检测限仅为 5〇113/111以且并未对转基因生物进行检测而验证其应用能力。
[0007]
【发明内容】
[000引本发明的第一个目的是提供一种能针对转基因植物中常见的GUS蛋白质的广谱 单克隆抗体杂交瘤及其制备方法。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种特异性好的单克隆抗体的制备方法，该抗体能 特异结合GUS重组抗原和转基因生物。
[0010] 本发明的第H个目的是提供一种将本抗体用于W水稻为代表的转基因生物检测 方法。
[0011]本发明的第四个目的是提供一种利用GUS单克隆抗体与抗原的结合能力，完成表 达GUS报告基因在转基因植物、转基因动物、转基因微生物、细胞或其他材料中的分选和富 集方法。
[0012] 解决技术问题所采用的技术手段 本发明制备了一株杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括W下步骤： 1)对在对转基因植物中常用的GUS基因的抗原表位分析后，选按照公布的序列进行分 析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性W及二级结构，选择适宜可溶 表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达可溶表达，表达在含有祀T-GUS质粒的大肠 杆菌化21 (化3)中表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫 Ba化/c小鼠； 2) 获取融合细胞生长克隆；从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细 胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆； 3)应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得高效分 泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0013] 上述技术方案中，步骤1)中，制备重组GUS蛋白的方法可W按照本领域技术人员 熟知的DNA和蛋白质表达操作技术进行基因的分离、核巧酸片段的切割与连接、克隆和表 达载体的构建及扩增、核巧酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，重组蛋白的纯化。具 体地，可参考《分子克隆实验指南(第H版)》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译， 2009年，科学出版社)。
[0014] 本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的杂交瘤细胞株，该细胞株所分 泌的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No;3和SEQ ID No;4所示的DNA序列 所编码，分别具有SEQ ID No ;5和SEQ ID No ;6所示的氨基酸序列，为一种鼠源IgGla亚 型单克隆抗体，亲和常数为1. 1 X 109,能特异识别重组的GUS蛋白W及转基因生物中的GUS 报告基因。
[0015] 采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有W下两种： 1) 在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离 纯化所需单克隆抗体； 2) 在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗 体。
[0016] 本发明同时要求保护该抗GUS抗体在对含GUS生物样本的免疫学检测中的应用。 可W检测的生物样本包括转基因植物、转基因动物、转基因微生物和转基因动物细胞。可 W应用的免疫学检测方法包括但不限于利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附检测 (ELISA)、免疫印迹（WesternBlot)、流式细胞术（FACS)、免疫组织化学（me)检测或者免 疫PCR检测方法。在免疫学检测中，该抗体可单独或与通过化学键偶联，静电吸附或者亲疏 水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP)，碱性磯酸酶(AP)，生物素（Biotin)， 异硫氯酸英光素（FITC)，切3、切5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。
[0017] 本发明还要求保护该抗GUS抗体在对含GUS生物样本进行基于免疫学的生物分离 中的应用。该基于免疫学的分离方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流式 细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。
[0018] 本发明的优点及有益效果 (1) 本发明获得的杂交瘤（71381S-2)分泌产生的单克隆，能识别GUS重组蛋白质，具 有检测多种转基因植物的GUS蛋白的特性，具有广阔的用途。
[0019] 本发明获得的杂交瘤（71381S-2)为一种IgGla类抗体，与GUS蛋白的结合有极强 特异性和敏感性，最低检测限为4ng， (2) 可对转基因材料中的GUS蛋白质含量进行定量分析 (3) 可对单粒水稻种子进行分析，确定种子中GUS蛋白质的有无。
[0020] 可检出GUS含量仅为0. 02%。的生物样本。
[0021] (4)本发明获得的杂交瘤（71381S-2)产生的单克隆抗体可独立或与生物素、辣根 过氧化物酶、碱性磯酸酶等偶联，用于免疫印记（Westernblotting)、双抗体夹也化ISA、间 接化ISA、免疫组织化学、免疫PCR等方法对转基因生物进行检测和筛查，特异性和灵敏度 高，具有很高的使用价值。
[0022] (5)本发明的抗体可W通过与琼脂糖、磁珠结合，进行生物样本的亲和富集和分 离。
[0023] (6)通过将本发明的抗体与FITC、切3、切5等英光分子偶联，用于转基因细胞的流 式细胞术分析与分选，进而完成qPCR、ELISpot或单细胞分析。
[0024]
【附图说明】
[00巧]图1 ;纯化的GUS重组抗原蛋白所纯化的重组GUS蛋白为可溶状态，可W部分保留 天然构象，其纯度在90%左右，浓度高于1. 5mg/ml。
[0026] 图2 ;71381s-2抗体的识别特性和实际应用效果应用纯化的71381S-2单克隆抗体 可W在免疫印迹杂交中特异地检出GUS重组蛋白及转基因水稻中的GUS蛋白。
[0027] 图3 ;71381s-2抗体的检测灵敏度纯化的71381S-2单克隆抗体的最低检测限为 4ng，可对GUS蛋白质含量进行定量分析。
[002引图4 ;71381s-2抗体的检测适应性应用纯化的71381S-2单克隆抗体检测不同部位 的水稻样本，均具有很高的特异性。
[0029]图5 ;71381s-2抗体在检测转基因大米中的应用应用纯化的71381S-2单克隆抗体 可W在免疫印迹杂交中特异地检出大米中的转基因GUS蛋白。
[0030]
【具体实施方式】
[0031] 下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，W使本领域技术人员可 W更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
[003引实施例1重组GUS蛋白质的制备 一、 基因克隆 按照Genbank中AA巧3706的氨基酸序列，参照质粒地1101中公布的巧W基因编码序 列U12639,分别设计特异性上游引物GUS-F : G鮮H墨ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCC和 下游引物GUS-R ; CCGC化樹GTTGTTTGCCTCCCTGCTGCGG，从细菌基因组中扩增完整的卵s编 码基因。在PCR的过程中在基因5'和3'端分别加入公I和Z如I酶切位点。PCR产物 经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体祀T30a 进行I和ZAoI酶切，再次电泳回收，WT4DM连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌 感受态细胞化21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白 基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用 二、 蛋白表达和纯化 按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mlLB培养基，加入终浓度为50yg/ml的卡那霉素，37°C振荡培养至ODe。。为0. 6~0. 8。加入0.1mol/L的IPTG，25°C震荡培养 她，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用媒柱进行蛋白质的亲和纯化。用不 同浓度的咪哇溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，图1为 在祀T30a中融合组氨酸标签的重组GUS蛋白的表达和纯化结果。重组GUS蛋白的纯度在 90%W上，浓度约为1-1. 51113/111以可^满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。
[0033] 实施例2杂交瘤细胞系的建立 一、免疫 将实施例1中交联的多肤用弗氏完全佐剂（Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Ba化/C小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为 60嗦/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司)乳化，剂量为30嗦/ 只。第3次加强免疫后7天W间接化ISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效 价，效价最高的小鼠W尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50嗦/只。
[0034] 二、细胞融合 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞息液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 (ATCC)W5:l