一种高亲和力的抗egfr单克隆抗体的制作方法

专利名称：一种高亲和力的抗egfr单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的抗 EGFR单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位，其中，转移性结直肠癌(CRC)是世界范围内第三大常见肿瘤类型，每年新诊断病例估计达950，000，同时它还是欧洲和北美的第二大致死癌种。一项调查表明，2005年欧共体地区预计新发病280，000例，死亡150，000例。I期和II期病人的治疗以手术为主，大部分患者适用于根治性切除术，但10%至15%的病人伴有转移性肿瘤，术后复发或肿瘤相关致死率很 I^J。表皮生长因子受体(EGFR)家族(HER家族)由4个相关的蛋白酪氨酸激酶受体组成，分别为(l)EGFR，erb B-I, c-erb-B ； (2) erb B-2/neu，Her-2/neu ； (3) erb B_3，Her-3 ； 与(4) erb B-4, Her_4。EGFR在肿瘤细胞中转导调节多种不同的影响恶性生长的细胞功能网络，包括增殖、存活、损伤修复、粘附、迁移以及新血管生成。EGFR在多种人上皮组织来源的癌症中有不同水平的表达。表达EGFR的上皮肿瘤通常包括膀胱、乳腺、宫颈、结肠、头颈、 肾、肺、胰腺、以及前列腺等。EGFR在CRC表达率为25-77%，且与肿瘤的恶化以及不良预后相关。EGFR的特异性配体为EGF和EGF相关多肽，包括转化生长因子α (TGF-α)，双调蛋白以及肝素结合EGF样生长因子。EGF和TGF-α刺激跃迁通过临近细胞周期Gl期末端的限制点——R点——所必须的分子事件。一旦过了 R点，即使在没有生长因子的情况下细胞仍可以继续通过细胞周期的其它期。为了激活EGFR，配体EGF(单体)同时结合并连接两个相邻的受体链，使受体的胞内激酶局域在多个酪氨酸上相互磷酸化，酪氨酸激酶活性提高从而可以激活数个信号通路如ras-MAPK通路，PI3激酶通路以及JAK/STAT通路等。EGFR受体过表达或突变后结构激活(不需要配体)以及自分泌刺激导致的过度EGFR功能与多种癌症发生相关。人结肠、头颈、胰腺、肺、乳腺、肾、卵巢、脑和膀胱肿瘤频发EGFR的过表达。 EGFR的致瘤效应包括DNA合成启动，促进细胞生长、侵袭以及转移。特异性敲除EGFR可导致细胞周期俘获、细胞凋亡以及癌细胞的分化。Cetuximab是Imclone公司开发的鼠/人嵌合的单克隆抗EGFR抗体。在两个重链上有两个N-连接的糖基化位点，分子量大约为152kD (包括糖部分)。Cetuximab可以与 EGFR受体胞外域高亲和力结合，从而竞争性拮抗配体与EGFR的结合，封锁受体与配体的结合继而抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的激活。作为结果，肿瘤细胞或肿瘤微环境中的基质细胞中多种由EGFR信号通路调节的细胞过程被阻断，包括EGFR下调，细胞内信号的抑制，细胞周期的抑制，凋亡的诱导，DNA修复的抑制，血管生成的抑制，肿瘤细胞运动性、侵袭性以及转移性的抑制等等。抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)可以导致EGFR的降解。美国 FDA于2004年2月批准该抗体用于结直肠癌的治疗，2006年又增加头颈部肿瘤的适应症。虽然目前已经有相关的抗EGFR单克隆抗体应用于临床，为了增强抗体的特异性，提高检测灵敏度，增强抗体的功能同时降低抗体的用量，进而提高对肿瘤的杀伤效果仍然需要亲和力更高的抗体。

发明内容
本发明的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技术构建了多种具有高亲和力的抗EGFR单克隆抗体突变体。这些突变抗体与Cetuximab相比具有更高的亲和力活性，能够更加有效的识别EGFR抗原。高亲和力的抗EGFR单克隆抗体突变体可用于制备治疗EGFR 的过表达疾病如结直肠癌及头颈部肿瘤的药物。与Cetuximab相比，突变抗体亲和力提高， 抗体特异性增强，对肿瘤的杀伤效果也显著提高。本发明公开了 1，一种高亲和力的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体与EGFR的亲和力和 Cetuximab相比提高至少2倍。2，上述1所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO :5所示的重链可变区和/或如SEQ ID NO :6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸被取代的抗体，所述位点为重链可变区第57、102位和/或轻链可变区第93 位氨基酸的位置。3，上述2所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述氨基酸被谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。4，上述3所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为 SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11， 或 SEQ ID NO 14 之一。5，上述4所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :12。6，上述1、2或3所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体与EGFR的亲和力和Cetuximab相比提高至少4倍。7，上述6所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为 SEQ ID NO -J, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :14 之一.8，上述7所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :12。9，上述1、2或3所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体与EGFR的亲和力和Cetuximab相比提高至少10倍。10，上述9所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO 14.11，上述10所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区(VL) 的氨基酸序列为SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :12。12，一种制剂，含有上述1至11任一所述的抗EGFR单克隆抗体和 可药用的载体。13，上述1至12任一所述的抗EGFR单克隆抗体或其制剂在制备抗结直肠癌及头颈部肿瘤的药物中的用途。更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先参照美国专利US7060808公开的抗EGFR单抗资料及序列，构建了抗EGFR嵌合抗体C225的轻、重链可变区和恒定区基因，然后通过表达、纯化，获得嵌合抗体C225。根据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlapPCR 的方式对嵌合抗体C225进行构建，其构建与表达、纯化的方法与未突变的嵌合抗体C225相同。所述突变抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置，取代氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸。对 于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。本发明的申请人对上述C225突变抗体进行了亲和力检测。实验结果表明，申请人构建的C225抗体的亲和力与市售的Cetuxiamb的亲和力相似。相对于未突变的原本 C225抗体或市售的Cetuxiamb，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为重链可变区第57 位谷氨酸或第102位赖氨酸取代的突变抗体(H57TE或H102YK)，亲和力提高了至少4倍左右；重链可变区第102位精氨酸或丝氨酸或苏氨酸取代的突变抗体(H102YR或H102YS或 H102YT)，亲和力提高了 2倍左右；轻链可变区第93位精氨酸取代的突变抗体(L93NR)，其亲和力也提高了。针对上述重链可变区和/或轻链可变区的突变点进行两点或三点的组合突变，亲和力均提高了 10倍以上，最终提高亲和力程度最高的组合突变抗体为重链可变区第57位谷氨酸、第102位赖氨酸，以及轻链可变区第93位精氨酸三个突变点同时取代的突变抗体(H57TE，H102YK, L93NR)。以上实验结果说明，高亲和力的C225突变抗体，其最佳突变位点为重链可变区第 57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置；取代的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸，其中，最佳取代的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸或精氨酸。并且，多个单点组合突变抗体的亲和力要高于单点突变抗体。申请人:还针对Cetuximab突变体(C225突变抗体)的功能进行研究。通过对 Cetuximab突变体的ADCC功能检测，随着Cetuximab突变体亲和力的提高，ADCC功能也显著增强，三点组合突变Cmut8的ADCC杀伤活性显著高于Cetuximab。通过对Cetuximab突变体凋亡功能检测，结果显示，亲和力的提高不能显著地增加Cetuximab突变体的凋亡功能， 但是三突变体CmutS却显示出了较强的促凋亡能力；虽然加入不同浓度的caspasd半胱氨酸蛋白酶)抑制剂可以部分的抑制CmutS引起的凋亡，但是其仍然显示出了较强的促凋亡能力。通过研究高亲和力Cetuximab突变体(Cmut8)对Cetuximab抵制型细胞的杀伤，结果显示，CmutS不能提高对Cetuximab抵制型细胞的补体介导的细胞毒(CDC)杀伤，但是能够引起较强的ADCC杀伤；CmutS在Cetuximab抵制型细胞株上仍然表现出较强的促凋亡能力。通过高亲和力Cetuximab突变体体内小鼠生存实验，结果显示，Cmut8较Ceuximab在 A431细胞动物模型上，显示出良好的治疗效果(P < 0. 01)。本发明公开上述高亲和力的C225突变抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述C225突变抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合， 其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)； poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量应使C2B8突变抗体颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。上述制剂为包含高亲和力的C225突变抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为预防和/或治疗肿瘤的药物使用。
本发明中C225突变抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0. 1 3000mg/天。本发明公开的C225突变抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；钼类化合物如顺钼、卡钼和草酸钼等；丝裂霉素 (MMC) ； (2)影响核酸合成的药物二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、 表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼白硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂 氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素_2 ；胸腺肽类；4、单克隆抗体Cetuximab (C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin) ；5、 其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的C2B8突变抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。本发明所指的肿瘤包括结直肠癌、头颈部肿瘤及肺鳞状细胞癌等EGFR阳性的上皮来源肿瘤，这里不再一一列举。本发明所称的抗肿瘤药物，指具有预防和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。


图1. Cetuxiamb (又称C225抗体)重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列；图中第一行序列表示Cetuxiamb的重链、轻链的碱基序列，第二行序列表示氨基酸序列，其中有下划线的地方表示构建突变体的突变点。图2. biacore检测Cetuxiamb及C225抗体突变体；不同突变体按照相同浓度，等倍比稀释在50 μ 1/min流速和25°C环境下进行检测；图中所示为不同C225抗体突变体在相同浓度下的sensorgram图，其中WT表示申请人自行构建的未突变的C225抗体图3. Cetuximab突变体结合饱和曲线；检测125碘标记的不同cetuximab突变体对 A431细胞的结合饱和曲线；对不同的抗体突变体按照相同浓度等倍比稀释，37°C孵育2h， 通过离心分离，检测结合在细胞上的125碘标记的抗体片段；饱和结合实验的数据通过非线性最小二乘法进行拟合并确定结合常数。图4. Cetuximab突变体ADCC功能检测；图中4-1 4-4分别显示的是E T为 50 1,25 1，5 1和1 1四种比率下，ADCC杀伤作用与不同浓度Cetuximab突变体的关系。图5. Cetuimab突变体凋亡功能检测；图5_1显示不同条件下的Cetuximab突变体的凋亡功能检测结果；图5-2 5-3显示加入不同浓度的caspase抑制剂ZVAD (图5_2)和 VDVAD(图5-3)后，Cetuximab突变体的凋亡功能检测结果。图6.高亲和力Cetuximab突变体小鼠生存率实验；每日观察小鼠状况，当肿瘤体积大于2000mm3时，处死该小鼠；生存曲线做图参照Kaplan-Meier的方法进行，组间比较采用 log-rank 检验进行分析[Bland JM, Altman DG. Survival probabilities (the Kaplan-Meier method). BMJ. 1998 ；317 :1572·]。
具体实施例方式以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J.，Fritsch，Ε. F. andManiais, Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual， 2ndedition, Cold springHarbor Laboratory Press.在本发明的下述实施例中，使用的淋巴细胞分离液购自鼎国生物技术发展公司， Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司，Lipofectamine2000 Reagent 购自 Invitrogen 公司， HRP-羊抗人 IgG(κ )购自 Southern Biotechnology Associates 公司，Human myeloma IgGl, κ购自Sigma公司，羊抗人IgG(Fe)购自(Zymed公司)，人EGFR分子购自R&D公司， LDH试剂盒购自Promega公司，ZVAD和VDVAD均购自Sigma公司，EGTA购自Sigma公司，羊抗人 κ F(ab' )2 的片段购自 Southern Biotechnology, Annexin V-Fluos 试剂盒购自 BD 公司。在本发明的下述实施例中，使用的pGEM-T载体购自promega公司，质粒 pcDNA3. 1(+)购自美国Invitrogen公司，pcDNA3. 1载体(是否与质粒pcDNA3. 1(+)不同？) 购自美国 Invitrogen 公司，CH0-K1 细胞为 ATCC CRL-9618，A431 细胞为 ATCC CRL-1555， SCID小鼠购自必凯公司。在本发明的下述实施例中，使用的Protein A亲和柱和SA芯片均购自GE公司。实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂提取总RNA，根据文献(Clonedhuman and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genesconserve homology infunctional segments. Hieter PA,Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr,Leder P. Cell. 1980 Nov ；22(lPt 1) : 197—207.)和文献(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma1 gene. Ellison JW,Berson BJ,Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10 ；10(13) :4071_9·)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链恒定区和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆，其中，SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQ IDNO :3和SEQ ID NO :4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。将本例中的重链恒定区的正确克隆记作pGEM-T/ CH,轻链恒定区的正确克隆记作pGEM-T/CL。实施例2.抗EGFR嵌合抗体C225的表达载体构建 参照美国专利US7060808公开的抗EGFR单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗EGFR单克隆抗体C225重链可变区基因(C225VH)及轻链可变区基因(C225VL)。图1显示了 C225重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。以C225VH基因和pGEM_T/CH载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体重链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟。得到 PCR产物C225VHCH，其5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I，信号肽基因序列如SEQ ID N0:15所示。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体重链片段 C225VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1⑴进行连接，构建成嵌合重链真核表达载体 pcDNA3. 1 (+) (C225VHCH)。以C225VL基因和pGEM_T/CL载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体轻链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟。得到 PCR产物C225VLCL，其5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3‘端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I，信号肽基因序列如SEQ ID NO 16所示。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体轻链片段C225VLCL， 与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1载体进行连接，构建成嵌合轻链真核表达载体 pcDNA3. 1(C225VLCL)。实施例3.嵌合抗体的稳定表达与纯化于加有含血清培养基的3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞，细胞培养至 90% -95%融合时进行转染，具体转染过程如下取质粒IOyg (质粒 pcDNA3. 1 ( + ) (C2 2 5VHCH) 4 μ g 禾口质粒 pcDNA3. 1 (C225VLCL) 6 μ g)和 20 μ 1 Lipofectamine2000 Reagent 分别溶于 500 μ 1 无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到培养皿中，置于CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的 DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。 转染进行24h后，用含600 μ g/ml G418选择培养基筛选抗性克隆，其中，筛选方法为取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆，筛选过程如下
将羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myeloma IgGl, κ，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ )进行结合反应，37°C温育lh，加入TMB (四甲基联苯胺)于37°C作用5分钟，最后用H2SO4终止反应，测A45tl值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化嵌合抗体C225。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。实施例4. C225抗体突变体的构建及表达采用overlapPCR的方式进行C225抗体突变体的构建，其构建与表达、纯化的方法与C225嵌合抗体相同，构建的抗体突变体共10个，分别命名为Cmutl CmutlO，各突变抗体的突变位点分别如表1所示，其中，突变抗体的重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO :5 14，其中，SEQ ID NO :5为C225的重链可变区氨基酸序列， SEQ ID NO :6为C225轻链的可变区氨基酸序列，SEQ ID NO :7为C225重链可变区氨基酸序列的57位氨基酸残基由T突变为E的突变序列，SEQ ID NO :8为C225重链可变区氨基酸序列的102位氨基酸残基由Y突变为R的突变序列，SEQ ID NO 9为C225重链可变区氨基酸序列的102位氨基酸残基由Y突变为S的突变序列，SEQ ID NO 10为C225重链可变区氨基酸序列的102位氨基酸残基由Y突变为T的突变序列，SEQ ID NO 11为C225重链可变区氨基酸序列的102位氨基酸残基由Y突变为K的突变序列，SEQ ID NO :12为C225轻链可变区氨基酸序列的93位氨基酸残基由N突变为R的突变序列，SEQ ID NO 13为C225轻链可变区氨基酸序列的93位氨基酸残基由N突变为K的突变序列，SEQ ID NO 14为C225 重链可变区氨基酸序列的57位氨基酸残基由T突变为E且102位氨基酸残基由Y突变为 K的突变序列。实施例5. C225及突变体的biacore鉴定将SA芯片在50 μ 1/min的PBS溶液中25°C平衡30min，然后用IM NaCl和50mM NaOH的活化液活化3次，每次Imin ；将biotin标记的人EGFR分子稀释成终浓度为1 μ g/ ml,以10μ 1/min的流速进行包被(ARu = 1000)；然后用PBS缓冲液50 μ 1/min平衡 IOmin0将平衡后的芯片用0.04%的生物素溶液封闭芯片。将抗体以等两倍比稀释五个浓度，50 μ 1/min上样75秒，然后用PBS解离10分钟。在相同样品浓度下，突变抗体Cmutl、 5、6和8的biacore检测的sensorgram结果如图2所示；突变抗体的亲和力的相对值如表 1所示。图2和表1的结果显示申请人构建的C225抗体的亲和力与市售的Cetuxiamb的亲和力相似。相对于未突变的原本C225抗体，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为=Cmutl 和Cmut5亲和力分别提高了 6. 08和3. 96倍；Cmut2，3，4，亲和力提高了近2倍。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体CmutS，其亲和力最终提高了 15. 47倍。相对于市售的Cetuxiamb，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为=Cmutl和 Cmut5亲和力分别提高了 7. 73和5. 04倍；Cmut2，3，4，亲和力提高了 2倍多。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体CmutS，其亲和力最终提高了 19. 68 倍。
表1. biacore检测抗体突变体的亲和力
权利要求
1.一种高亲和力的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体与EGFR的亲和力和 Cetuximab相比提高至少2倍。
2.权利要求1所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQID N0:5所示的重链可变区和/或如SEQ ID NO :6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸被取代的抗体，所述氨基酸位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93 位氨基酸的位置。
3.权利要求2所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述氨基酸被取代为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
4.权利要求3所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为 SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 或 SEQID NO :14 之一。
5.权利要求4所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
6.权利要求1至3中任一项所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体与EGFR 的亲和力和Cetuximab相比提高至少4倍。
7.权利要求6所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为 SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 14 之一。
8.权利要求7所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
9.权利要求1至3中任一项所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体与EGFR 的亲和力和Cetuximab相比提高至少10倍。
10.权利要求9所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO :14ο
11.权利要求10所述的抗EGFR单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
12.—种制剂，含有权利要求1至11任一所述的抗EGFR单克隆抗体和可药用的载体。
13.权利要求1至11任一所述的抗EGFR单克隆抗体或其制剂在制备治疗EGFR的过表达疾病药物中的用途。
14.权利要求13所述的用途，其中EGFR的过表达疾病为结直肠癌或头颈部肿瘤。
全文摘要
本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的抗EGFR单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途；其中重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ IDNO14，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO6或SEQ ID NO12的抗体与EGFR的亲和力和Cetuximab相比提高至少10倍。
文档编号C07K16/28GK102219855SQ201010148069
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者侯盛, 寇庚, 戴建新, 李博华, 王皓, 赵健, 郭亚军 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司