专利名称：一种抗vWF单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种高亲和力的抗vWF(v0n Willebrand factor)单克隆抗体，这种抗体能与人vWF特异结合，也能与vWF和凝血因子 VIII的复合体结合。同时还涉及一种利用该抗体纯化vWF的方法和一种利用该抗体纯化凝血因子VIII的方法。
背景技术：
凝血过程是一个复杂的过程，它包括一系列的生化反应，涉及十多种凝血因子。任何凝血因子的缺失或功能变异都会导致凝血相关疾病。血友病就是一种缺乏凝血因子VIII 或vWF(von Willebrand factor)而导致的出血性疾病。vWF存在于血浆中，它是凝血因子VIII的载体，能够稳定凝血因子VIII，并防止凝血因子VIII被蛋白酶水解。同时VWF是一种黏附性糖蛋白，在血小板的黏附中起着核心作用。通过血小板在受损血管壁的粘附，启动凝血过程。vWF是由230kD亚基组成的多聚体， 其分子量从5 X IO5到107Da。vWF含有5_6%的糖，这些糖对于vWF结合血小板的功能非常重要。vWF是在内皮细胞(endothelial cell)和巨核细胞(megakaryochtes)中合成。并通过二硫键形成二聚体。再以聚体为基础连接形成高聚体。高分子量的vWF多聚体在凝血过程中非常重要。各种vWF活性异常会导致von WiIlebrand综合症。过多的vWF会增加血栓的风险，而vWF水平过低会导致出血的倾向，由于抑制了血小板的聚集，受伤后的出血时间延长。vWF的缺乏还会表现出甲型血友病的症状，这是由于vWF对于凝血因子VIII的稳定性非常重要，vWF的缺乏导致凝血因子VIII的半衰期缩短，从而使血液中凝血因子VIII 的活性降低而表现出甲型血友病的症状。治疗von Willebrand综合症的常规方法是用血浆中提取的vWF，也可以用纯化的vWF或vWF-FVIII复合物。EP-A-0503991和W0-A-8912065 提供了用离子交换纯化vWF的技术。US 6605222和US 6579723提供了制备vWF-FVIII复合物的技术。凝血因子VIII是凝血级联反应中的重要因子。它是一个分子量^OkD的糖蛋白， 包含200kD和80kD两条肽链。凝血因子VIII被凝血酶活化后可以加速因子X的活化，最终形成血块。甲型血友病就是凝血因子VIII的缺失的一种性染色体连锁疾病，占男性人口的万分之一。血友病的症状是受伤后血液不能形成血凝块或血凝块形成很慢，导致出血不止或出血时间过长。血友病的主要治疗手段就是补充凝血因子VIII。在早期，采用输入全血或血浆的办法来为血友病病人止血。但这种方法输血体积大，输入的凝血因子VIII量也少，只能治疗轻度血友病病人。对于严重的血友病病人不能有效治疗。1974年美国专利 US3803115发明一种冷沉淀法制备凝血因子VIII的浓缩物，随后US Re 29698对此方法进一步改进，得到了活性更高的浓缩物。利用凝血因子VIII的浓缩物治疗血友病，可以输入更多的凝血因子VIII，大大改善了血友病的治疗效果。虽然冷沉淀浓缩物中凝血因子VIII 的比活性与比血浆相比大幅度提高，但仍含有大量杂蛋白，输注后导致的免疫反应等副作用仍然很大，输注量也很大。冷沉淀浓缩物中凝血因子VIII的稳定性和冷沉淀浓缩物冻干后的溶解性也不够理想。于是人们在冷沉淀浓缩物基础上通过各种技术手段进一步纯化凝血因子VIII。US Re. 32011提供一种纯化凝血因子VIII的方法，其过程包括先用抗VWF 单克隆抗体亲和吸附凝血因子VIII与vWF的复合体，再洗脱凝血因子VIII，然后用氨己基琼脂糖纯化。其制备的凝血因子VIII比活性与血浆相比提高160000倍，活性达到2300u/ mg。虽然目前从血浆提取的凝血因子VIII的纯度已经非常高，但是存在着感染传染病的风险。随着基因技术的提高，现在已成功克隆出凝血因子VIII的基因并成功在细胞中表达。 重组凝血因子VIII与血浆提取的凝血因子VIII相比具有很大优势首先是减小了血液传染病的风险，其次是不受血浆来源的限制，可以大量生产满足市场需要。再次，重组凝血因子VIII产品的纯度极高，相比血源凝血因子VIII副作用更小。重组的凝血因子VIII在国外有取代血浆提取凝血因子VIII的趋势。目前市售的重组的凝血因子VIII有全长凝血因子VIII和B区删除的凝血因子VIII两种。B区删除后凝血因子VIII稳定性大幅度提高， 有利于生产工艺中的控制。但使用效果两者没有明显区别。无论是全长凝血因子VIII还是B区删除的凝血因子VIII，其纯化过程都包括一系列复杂的层析纯化，但所有已商品化的重组凝血因子VIII的生产过程都包含了抗凝血因子VIII单克隆抗体的免疫亲和层析。 免疫亲和层析的优点是浓缩倍数高，产品纯度好。最近美国专利US 5597711和US 5994310 又开发出来用肽来代替抗体的亲和层析技术。目前抗vWF抗体广泛地用于vWF的检测。美国专利US 5916805，和US6^0731提供了一组抗vWF单克隆抗体，能够阻止血小板的聚集，具有潜在的治疗血栓的用途。美国专利US 6228360提供的抗vWF抗体的亲和力Kd在100 0. InM之间。本发明提供了一种抗 vWF单克隆抗体，既能与vWF结合也能与vWF和凝血因子VIII的复合体结合，既能用于纯化 vWF也能用于纯化凝血因子VIII。本发明提供的抗vWF抗体与vWF的亲和力Kd为0. 06nM。 亲和力高于已知同类抗体。用于亲和纯化时，高亲和力的抗体能得到高的产品纯度。
发明内容
本发明提供一种高亲和力的抗vWF鼠单克隆抗体，它能与人vWF特异结合，也能与vWF和凝血因子VIII的复合体结合。该抗体的特征在于其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO :1，重链氨基酸序列为SEQ ID NO :2 ；其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:3，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ；轻链上互补决定区⑶R1，⑶R2，⑶R3的氨基酸序列分别为 SEQ ID NO 5, SEQID NO :6，SEQ ID NO 7 ；重链上互补决定区 CDRl，CDR2, CDR3 的氨基酸序列分别为SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10。该抗体与vWF的亲和力Kd 为0. 06nM。该抗体制备过程如下采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以重组人vWF蛋白为免疫原，免疫剂量为50 μ g/只，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次，4天后取免疫小鼠脾细胞，按4 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用重组人vWF蛋白作为包被抗原， 用ELISA法测定细胞上清液，选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，得到稳定分泌vWF特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择分泌所需抗体的细胞株，收集培养的细胞，按照说明书 (Invitrogen)加入TRIzol，提取总RNA，电泳检测RNA质量，UV测定浓度。按Roche反转录试剂盒操作说明反转为cDNA，-20°C冻存备用。采用专业领域人员已知的技术方案，参考文献(Ying W et al.，BMCBioinformatics. 2006 ；7 (Suppl 4) :S9))设计引物，以 cDNA 为模板分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。将轻链和重链片段TA到可用于真核细胞表达的 pcDNA3T载体上，构建pcDNA3-anti-vWF-L和pcDNA3-anti-vWF_H表达载体。转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，测序鉴定。分析测序结果，获得正确的轻链和重链氨基酸序列。鼠杂交瘤以及抗体基因克隆技术是成熟技术，工艺步骤是本领域科研人员熟知的。本发明还提供一种利用该抗体纯化vWF的方法。首先将抗vWF的单克隆抗体固定在层析介质上制成亲和层析介质。然后让含有vWF的料液与亲和层析介质接触，vWF即与亲和层析介质上的抗vWF的单克隆抗体结合。洗涤层析介质洗去其他杂质，然后改变溶液条件使vWF与单克隆抗体解离，即得到纯化的vWF。固定抗体所用层析基质可以是任何活化的或未活化的层析基质，包括但不限于如下材料S印harose CL 4B, Separose 4 Fast Flow, Sepharose 6 Fast Flow，溴化氰活化的 S印harose 4 Fast Flow，NHS 活化的 S印harose， ECH Sepharose, EAHSepharose, Affi-Gel 10, Affi-Gel 15, Toyopearl-AF-Tresyl, Toyopearl-AF-Formyl, Toyopearl-AF-Carboxy, ProSep 5 CHO, ProSep 9 CHO 等。使用活化的层析基质只需按照供应商说明书进行抗体偶联。使用未活化的层析基质需先进行活化，然后再将抗体与活化的层析基质偶联。以溴化氰进行活化为例，活化的主要步骤为S印harose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0. IMol/L pH 9. 0NaHC03液洗涤；在冰浴搅拌下加入溴化氰，小心滴加2Mol/LNaOH，使pH保持在11左右，反应lOmin。 在Imin aiiin迅速调整pH为8. O 11. O维持lOmin。将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以冷的0. IMol/L pH 9.0NaHC03抽洗。即得到活化的 Sepharose0活化后的基质与预先活化基质的使用相同，可参照供应商的说明书。抗vWF亲和层析介质吸附vWF的过程须在pH 6 8的中性环境中进行，一般的细胞培养液或血清不需要调整PH或更换缓冲液，可以直接进行吸附。吸附后要用pH 6 8的中性缓冲液洗去未结合的杂质，缓冲剂可选用任何在中性范围内有缓冲能力的试剂，例如 Tris, HEPES, MES，磷酸盐，咪唑，组氨酸等。洗脱vWF —般选用pH2 3的酸性溶液洗脱， 如PH3. O的甘氨酸缓冲液，也可选用变性剂，例如尿素，盐酸胍，硫氰酸钾等洗脱。用酸性溶液洗脱后要尽快用Tris缓冲液将缓冲液调整至中性，用变性剂洗脱后要尽快利用超滤将vWF置换到非变性溶液中。亲和层析分离是本领域人员所掌握的，可根据具体的情况灵活掌握。本发明还提供一种利用该抗体纯化凝血因子VIII的方法。在血液中凝血因子 VIII是与VWF结合状态存在。在重组凝血因子VIII生产中，也可以将VWF与凝血因子VI11 共表达，以提高凝血因子VIII的稳定性。对于这种与vWF结合的凝血因子VIII本发明提供了一种方便的纯化方法。首先将抗vWF的单克隆抗体固定在层析介质上制成亲和层析介质。然后使料液与与亲和层析介质接触，凝血因子VIII与vWF的复合体即与亲和层析介质上的抗vWF的单克隆抗体结合。洗涤层析介质洗去其他杂质，然后改变溶液条件使凝血因子VIII与vWF解离，就得到了较纯的凝血因子VIII。最后再改变溶液条件洗脱vWF使亲和层析介质再生。抗vWF亲和层析介质吸附vWF/凝血因子VIII复合体的过程须在pH6 8的中性环境中进行，一般的细胞培养液或血清不需要调整pH或更换缓冲液，可以直接进行吸附。吸附后要用PH 6 8的中性缓冲液洗去未结合的杂质，缓冲剂可选用任何在中性范围内有缓冲能力的试剂，例如Tris，HEPES，MES，磷酸盐，咪唑，组氨酸等。下一步是通过解离vWF/凝血因子VIII复合体来洗脱凝血因子VIII。解离的溶液是含有200 300mM CaCl2 pH 6 8的中性缓冲液。解离后的vWF还结合在亲和介质上。最后洗脱vWF—般选用pH2 3的酸性溶液洗脱，如pH3. 0的甘氨酸缓冲液，也可选用变性剂，例如尿素，盐酸胍，硫氰酸钾等洗脱。
图1.抗vWF抗体亲和力测定结果图2.纯化后vWF的电泳3.纯化后凝血因子VIII的电泳图
具体实施例方式实施例1、单克隆抗体的制备重组人vWF 0. 5mg/ml溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，用乳化器制成乳化剂后常规皮下多点注射Balb/c小鼠，每点注射50ul，共注射4点。以后每隔3周取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠腹腔加强免疫一次，4天后取出脾脏，用常规方法分离脾脏细胞，并确定细胞活性大于90%。将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞4 1混合离心，取沉淀，在37°C 加入PEG(1400MW)进行细胞融合。在96孔板中培养，24小时后加入HAT选择培养液，每天更换新鲜培养基，直至长出克隆。用重组人vWF蛋白作为包被抗原，用ELISA法测定细胞上清液，选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，得到稳定分泌vWF特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选取杂交瘤细胞株，采用专业领域人员已知的技术方案，利用培养瓶或生物反应器进行细胞培养，收集细胞培养上清，利用蛋白G进行亲和纯化，鉴定抗体纯度和浓度后分装，于-20°C低温保存。实施例2、单克隆抗体基因的获得与表达载体的构建收集培养的细胞，按照说明书(Invitrogen)加入TRIzol，提取总RNA，电泳检测 RNA质量，UV测定浓度。按Roche反转录试剂盒操作说明反转为cDNA，-20°C冻存备用。采用专业领域人员已知的技术方案，参考文献(Ying W et al.，BMC Bioinformatics. 2006 ； 7 (Suppl 4) :S9))设计引物，以cDNA为模板分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。将轻链和重链片段TA到可用于真核细胞表达的pcDNA3 T载体上，构建pcDNA3-anti-VWF_L和 pCDNA3-anti-vWF-H表达载体。转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，测序鉴定。分析测序结果，获得正确的轻链和重链氨基酸序列。轻链的氨基酸序列见SEQ ID NO :1，重链的氨基酸序列见 SEQ ID NO :2ο实施例3、抗体亲和常数的测定用2ug/ml vWF包被酶标板，4°C包被过夜。室温用2% BSA封闭1小时。将抗vWF 抗体稀释成一系列不同浓度，浓度分别为0. 023,0. 046,0. 092,0. 188,0. 375,0. 75，1. 5,3, 6ug/ml。然后将稀释后抗体分别加入到包被vWF的酶标板中，室温作用18小时以上。通过 Elisa检测反应前总的抗vWF单抗浓度以及反应后剩余的抗vWF单抗浓度[F]，通过两者的差值得到结合的抗体量即[B]值。然后通过以[B]值为X轴，以[B]/[F]值为Y轴绘图(见图.1)，计算得到Kd为0. 06nM。
实施例4、重组抗vWF抗体生产取处于对数生长期的人胚肾细胞四3细胞，离心传代到细胞密度为0. 5X106cells/ ml, IOOml的三角瓶中每瓶放30ml的培养物。放摇床中，100 130rpm，36. 5V,5% CO2下培养。第二天进行转染，分别取轻链pcDNA3-anti-vWF-L和重链pcDNA3-anti-VWF_H载体 DNA各15ug，混合稀释到1. 5ml的150mM NaCl溶液中，混合均勻，取90ul的高效转染试剂 Sinofection(北京义翘神州生物技术有限公司)稀释到1. 5ml的150mM NaCl溶液中，混合均勻，然后将两中溶液混合均勻，配制成DNA-Sinofection的混合液。室温下孵育10 20min，然后逐滴加入要转染的细胞悬浮液中。转染后的细胞继续在100 130rpm，36. 5°C, 5% CO2摇床中培养5天。收获细胞培养液，3000g离心10分钟，取上清，0.45um微滤膜过滤。取装有Iml protein G Sepharose (GE)的层析柱，用20mM磷酸盐pH 7. 0缓冲液平衡层析柱，细胞培养液的上清以0. 5ml/分钟流过层析柱，再用20mM磷酸盐pH 7. 0缓冲液洗至流出液的吸光度降至基线。用IOOmM甘氨酸pH 3.0溶液洗脱抗体，洗脱液立即用IM Tris pH 8. 0溶液中和至中性。所得抗体-20°C保存。实施例5、固定化单克隆抗体亲和介质的制备纯化好的单克隆抗体用脱盐柱将缓冲液换成0. IM NaHCO3, pH 8. 3的缓冲液。溴化氰活化的琼脂糖凝胶(GE)按照说明书用ImM HCl洗涤5次。取Iml处理好的琼脂糖凝胶与6mg单克隆抗体混合，室温反应4小时。加入aiil pH 8. 0的0. IM Tris缓冲液，继续反应2小时。用PBS洗涤偶联好的琼脂糖凝胶，4°C保存备用。实施例6、用固定化单克隆抗体亲和介质纯化vWF取实施例5制备的亲和层析介质装入Iml层析柱，用平衡缓冲液OOmMTris，500mM NaCl，pH 7. 4)平衡。50ml表达vWF的细胞培养液，4000g离心10分钟，取上清用0. 45um微孔滤膜过滤。然后以0.5ml/min流速进样。进样结束后用平衡缓冲液洗去未结合的杂质， 然后用洗脱液(IOOmM甘氨酸，IOmMNaCl，pH 3.0)洗脱。洗脱液用IM pH 8. OTris溶液调至中性。纯化后的vWF的电泳图见图2。实施例7、用固定化单克隆抗体亲和介质纯化凝血因子VIII取实施例5制备的亲和层析介质装入Iml层析柱，用平衡缓冲液OOmMTris，500mM NaCl，pH 7. 4)平衡。50ml同时表达vWF和凝血因子VIII的细胞培养液，4000g离心10分钟，取上清用0.45um微孔滤膜过滤。然后以0.5ml/min流速进样。进样结束后用平衡缓冲液洗去未结合的杂质，然后用解离缓冲液(50mM Tris,250mM CaCl2,pH 7. 3)洗脱凝血因子 VIII。最后用再生缓冲液(IOOmM甘氨酸，IOmM NaCl,pH 3.0)洗脱vWF再生层析介质。纯化后的凝血因子VIII的电泳图见图3。
权利要求
1.一种抗VWF单克隆抗体，其特征在于轻链互补决定区包含序列为SEQ IDNO 5的 ⑶Rl，序列为SEQ ID NO 6的⑶R2，序列为SEQ ID NO 7的⑶R3 ；重链互补决定区包含序列为 SEQ ID NO 8 的 CDR1，序列为 SEQ ID NO 9 的 CDR2，序列为 SEQ ID NO 10 的 CDR3。
2.权利要求1所述抗体，其轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO :3 ；重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO :4ο
3.权利要求1所述抗体，其轻链氨基酸序列为SEQID NO 1 ；重链氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
4.权利要求1所述抗体是小鼠单克隆抗体或其他方式改构的单克隆抗体。
5.权利要求1所述抗体是通过杂交瘤细胞或基因重组细胞制备的单克隆抗体。
6.一种利用权利要求1所述抗体纯化vWF的方法，其特征在于⑴将抗vWF抗体固定在固相基质上，制成亲和吸附材料；(2)用制成的亲和材料吸附原料溶液中的vWF ； (3)用洗脱缓冲液洗脱vWF。
7.权利要求6所述纯化vWF的方法，其特征在于洗脱缓冲液是pH2 pH3的酸性缓冲液。
8.一种利用权利要求1所述抗体纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于(1)将抗 vWF抗体固定在固相基质上，制成亲和吸附材料；(2)用制成的亲和材料吸附原料溶液中的 VffF-FVIII复合体；C3)用解离缓冲液洗脱凝血因子VIII ； (4)用再生缓冲液洗脱vWF。
9.权利要求8所述纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于解离缓冲液是含有200 300mM CaCl2 pH 6 8的中性缓冲液。
10.权利要求8所述纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于再生缓冲液是pH2 pH3 的酸性缓冲液。
全文摘要
本发明提供一种抗vWF(von Willebrand factor)单克隆抗体，这种抗体能与人vWF特异结合，也能与vWF和凝血因子VIII的复合体结合。将这种单克隆抗体固定在层析基质上制成亲和介质，可用于纯化vWF，也可用来纯化凝血因子VIII。
文档编号C07K16/18GK102532316SQ20101060366
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者孙春昀, 张建东, 盖文琳, 罗春霞, 谢良志 申请人:神州细胞工程有限公司