专利名称：一种抗pedf单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗PEDF单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
糖尿病微血管并发症(diabetic microvascular complication)是糖尿病患者致残、致死的主要原因。越来越多的研究表明由于血管新生(angiogensis)的受抑制，糖尿病患者的局部创伤愈合(wound healing)出现障碍,研究估计15%的糖尿病患者出现糖尿病足(diabetic foot)。目前国内外尚无特效治疗手段，每年导致72，000病人截肢。糖尿病足发生的病因除了反复创伤、细菌感染外，创伤愈合受损(impaired wound healing)是其中一个重要因素。在特定的情况下，如糖尿病的发生，血管生成受阻，创伤愈合过程被打破或延迟，则慢性损伤(chronic wound)发展起来,最终可能导致溃瘍、截肢。 血管新生，即从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程。血管新生在创伤和外周循环闭塞情况下具有恢复血供和促进伤口愈合的积极作用。新生血管的形成受血管新生刺激因子和血管新生抑制因子的平衡调控，刺激因子包括血管内皮生长因子(vascular endothelial grow factor, VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor , FGF)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)等，抑制因子包括血管抑素 angiostatin、内皮抑素 endostatin、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)等。PEDF是目前发现的活性较强的血管增生抑制因子，同时具有抑制肿瘤血管新生作用，其细胞学基础是通过诱导激活的内皮细胞凋亡。最近研究报道PEDF在I型、II型糖尿病和代谢综合症病人血中显著上调；我们的预实验结果发现高脂诱导的胰岛素抵抗小鼠血清PEDF明显高于正常饮食对照组。糖尿病升高的PEDF可能诱导微血管内皮细胞凋亡，抑制糖尿病外周血管新生，从而介导其阻碍糖尿病足创伤愈合过程，阻断PEDF具有防治糖尿病足创伤愈合障碍的潜在应用价值。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种可以成为制备治疗PEDF升高的糖尿病及代谢综合症等的创伤愈合缓慢的潜在药物蛋白。本发明上述方法通过以下技术方案予以实现
一种抗PEDF单克隆抗体的制备方法，是用PEDF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗PEDF单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体。本发明抗PEDF单克隆抗体可以用于制备治疗PEDF升高的糖尿病及代谢综合症等的创伤愈合疾病的药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果糖尿病微血管并发症(diabetic microvascular complication)是糖尿病患者致残、致死的主要原因。越来越多的研究表明由于血管新生(angiogensis)的受抑制,糖尿病患者的局部创伤愈合(wound healing)出现障碍,研究估计15%的糖尿病患者出现糖尿病足溃瘍(diabetic foot ulcers),目前国内外尚无特效治疗手段,每年导致72，000病人截肢。本研究首次提出PEDF单克隆抗体可以用于制备治疗PEDF升高的糖尿病及代谢综合症等的创伤愈合疾病的药物。
图I为本发明重组PEDF蛋白SDS-PAGE结果 图2为纯化后PEDF单抗非变性胶电泳 图3为不同稀释度PEDF单抗的免疫效价检测(western blotting)；图4为PEDF单抗检测内源性PEDF蛋白(western blotting)；
图5为注射PEDF蛋白及对照GST的伤口愈合率统计；
图6为注射PEDF蛋白及对照GST的伤口愈合情况；
图7为糖尿病组及PEDF单抗组的伤口愈合率统计；
图8为糖尿病组及PEDF单抗组的伤口愈合情况。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。以下实施例中的方法、设备、材料，如果未特别说明，均为本领域常规的方法、设备和材料。实施例I PEDF单克隆抗体制备及鉴定 一、PEDF单克隆抗体制备
I. PEDF重组蛋白制备
选用pET30a(+)(购自Novagen)作为载体，根据人源PEDF基因序列设计引物，PCR扩增PEDF基因的cDNA，选用EcoRI和HindIII限制性内切酶(购自Takara)酶切纯化后的PEDF cDNA，与经过同样酶切的pET30a(+)连接，得到连接产物pET30a(+)-PEDF。将pET30a(+)-PEDF质粒转化大肠杆菌BL-21 DE3，经IPTG诱导后收集细菌，用Bindingbuffer重悬,超声离心后获得可溶性重组蛋白。再将蛋白与Ni-NTA树脂(购自Novagen)4°C充分结合,之后上柱,用Washing buffer洗去杂蛋白，最后用Elution buffer将蛋白洗脱下来，再经过SDS-PAGE鉴定作为免疫源(见图1)，最终获得的PEDF蛋白浓度3. 3mg/ml,纯度>98%，蛋白得率>15mg/L。2.动物免疫
采用5只6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠，并通过标准程序加强免疫，共4次免疫，从第二次开始ELSA检测效价，在正常状态，第四次最终免疫，并通过ELISA的结果选出最佳免疫应答的两只小鼠。3.杂交瘤细胞融合筛选
将最佳免疫应答的两只小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到的杂交瘤细胞通过增殖和ELISA筛选得到高效价的克隆，通过有限稀释法对2-5个阳性母细胞进行亚克隆并鉴定亚类，最终获得6个细胞株，每个细胞株有2个亚克隆。4.单克隆抗体的生产及纯化
I) ELISA法和Western blot检测细胞培养上清的免疫效价和特异性(见表1)，选择进一步用于免疫小鼠的细胞株2D9F10。表I
权利要求
1.一种抗PEDF单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体的制备方法是用PEDF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗PEDF单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体。
2.权利要求I所述抗PEDF单克隆抗体在制备治疗PEDF升高的创伤愈合疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗PEDF单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明所述抗PEDF单克隆抗体的制备方法是用PEDF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗PEDF单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体。本发明单克隆抗体可以用于制备治疗PEDF升高的创伤愈合疾病的药物。
文档编号A61P17/02GK102757497SQ20121024512
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者戴智育, 杨霞, 高国全, 齐炜炜 申请人:中山大学