专利名称：一种防治自然流产的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及一种防治自然流产的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
自然流产是妊娠早期常见的并发症，发生率约占全部妊娠的15-20%。近年来，自然流产率在全球呈现了逐年上升的变化趋势，引起国内外学者的深切关注。由于我国的人口基数大，其中育龄夫妇的数量尤为可观，以2007年的统计数据为例，育龄妇女的人数约为
3.61亿，而在妊娠早期发生自然流产者远远超过100万。因此深入研究女性自然流产发生的机制开始成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。近年来研究显示细胞凋亡在胚胎着床、胎盘的发育老化以及胎儿的生长发育中具有重要作用。各种原因所致的自然流产最终是以细胞凋亡实现的。目前，细胞凋亡在妊娠中的作用日益受到重视，越来越多的研究表明正常妊娠过程中胎盘、蜕膜的凋亡和增殖处于一种平衡状态，一旦发生异常凋亡，平衡状态被打破就可能导致病理妊娠，引发自然流产的发生。`gClqR是补体Clq受体，由于日本学者发现gClqR可介导单核细胞的凋亡，且能够锚定在线粒体上影响单核细胞的功能，在多种细胞凋亡中发挥关键作用。Clq-gClqR复合体在哺乳动物细胞的正常通讯中起抑制作用的观点是近年来提出的新理论。近年来，单克隆抗体在疾病的诊断和治疗预防方面特异性强，灵敏度高，显示了非常明显的优越特性。但是，目前尚没有gClqR单克隆抗体对自然流产有何种影响的报道，也没有利用gClqR单克隆抗体制备防治自然流产的药物上市。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种防治自然流产的单克隆抗体。本发明还有一个目的是提供上述单克隆抗体在制备防治自然流产的药物中的应用。本发明的目的是通过下列技术措施实现的—种抗自然流产的单克隆抗体,该单克隆抗体为gClqR单克隆抗体。优选该gClqR单克隆抗体为美国Millipore公司货号为AB2991的产品。gClqR单克隆抗体在制备防治自然流产药物中的应用。gClqR单克隆抗体在制备抑制滋养层细胞凋亡的药物中的应用。本发明证明了 gClqR单克隆抗体具有防治自然流产的功能，可用于制备防治自然流产的药物。以下是更为详细的说明。在我们实验结果中显示自然流产患者其蜕膜组织中滋养层细胞凋亡明显，且电镜下有凋亡小体形成，而细胞膜、细胞器却相对完整，呈现细胞凋亡的典型特征(见图1、2)。我们采用Western blot技术对自然流产者蜕膜组织中gClqR蛋白表达进行检测，结果发现其gClqR蛋白表达水平显著上调(见图3)。据此，我们提出科学问题自然流产的机制由Clq-gClqR复合体致线粒体功能损伤的机制介导，gClqR基因在自然流产患者体内表达显著上调可通过线粒体功能障碍的机制，导致滋养层细胞凋亡，最终引发流产。应用gClqR 单克隆抗体(gClqR monoclonal antibody, gClqR mAb)封闭 gClqR,使 Clq 和 gClqR 的结合受阻，从而抑制了 Clq-gClqR复合体致线粒体功能损伤，减少了滋养层细胞的凋亡，有效降低自然流产的发生率。我们以体外培养的胎盘滋养层细胞株HTR-8/SVneo为研究工具，探索gClqR mAb对滋养层细胞凋亡的影响。结果发现①gClqR mAb干预滋养层细胞后，滋养层细胞凋亡显著减少(见图4)-’②GFP-gClqR vector干预滋养层细胞后，电子显微镜下观察发现细胞中线粒体数量减少，嵴断裂、减少、消失，部分线粒体肿胀，甚至呈空泡状；荧光定量PCR检测发现细胞中线粒体拷贝数显著减少，突光探针H2DCFDA (2’，7’ -Dichlorofluoresceindiacetate, 2'，7’ - 二氯荧光黄双乙酸盐)检测发现细胞内活性氧ROS含量显著升高(见图5A-5C)，而gClqR mAb组，上述滋养层细胞线粒体形态、数量、功能无显著改变。分析上述结果可见①GFP-gClqR vector干预下发现滋养层细胞株HTR-8/SVneo中gClqR蛋白表达量明显上调的同时也获得了线粒体形态、数量、功能变化的实验结果；②gClqR单克隆抗体干预不·但抑制了滋养层细胞株HTR-8/SVneo的凋亡，而且线粒体功能受损显著减少，进一步为gClqR单克隆抗体防治自然流产发生的机制提供了支持依据。因此我们得出结论gClqR引发自然流产，主要由Clq-gClqR复合体致线粒体功能损伤的机制介导，通过线粒体功能障碍的机制，导致滋养层细胞凋亡，最终引发自然流产。故由gClqR蛋白引发自然流产防治的环节可立于线粒体功能改善的层面,而且也可在gClqR作为干预靶标的层面。本发明有益效果本发明研究证明了 gClqR单克隆抗体具有防治自然流产的作用，可用于制备防治自然流产的药物，为防治自然流产提供了更多选择。
图1为流产患者蜕膜组织滋养层细胞凋亡情况。图2为流产患者蜕膜组织滋养层细胞凋亡小体。图3为蜕膜组织中gClqR蛋白的表达水平。图1、2、3中A :人工流产蜕膜组织，B 自然流产蜕膜组织。图4滋养层细胞HTR-8/SVneo的凋亡情况。图5A滋养层细胞HTR-8/SVneo的线粒体形态。图5B滋养层细胞HTR-8/SVneo中线粒体拷贝数。图5C滋养层细胞HTR-8/SVneo内活性氧ROS的影响。图 4、5A、5B、5C 中 A:GFP_gClqR vector 组，B gClqR mAb 组。具体实施方法以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1一、实验材料与方法(一)材料
1、研究对象收集2008年I月2010年12月在南京医科大学附属南京市妇幼保健院行自然流产患者50例，以频数匹配法选择正常妊娠行人工流产50例作为对照，且患者和其家属知情同意。手术取材后立即置于_80°C冻存备用。2、细胞株滋养层细胞株HTR-8/SVneo购自山东大学齐鲁医院中心实验室。3、仪器与试剂MEM (minimal essential medium,最低必须培养基)培养基购自Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。青霉素、链霉素来源于上海生工生物技术公司。抗小鼠二抗及ECL化学发光试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司(货号610_4312)。Annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate,异硫氰酸突光素)/PI (propidiu-m iodide,碘化丙碇)流式细胞仪检测试剂盒购自Invitrogen公司。小鼠抗大鼠 gClqR单克隆抗体(gClqR monoclonal antibody, gClqR mAb)购自 Millipore 公司(货号AB2991)，小鼠抗actin 单克隆抗体，购自Millipore公司(货号AB3265)。胰蛋白酶、DMSO (二甲基亚讽)购自美国Sigma公司。Trizol来源于Invitrogen公司。Oligo (dT) 15、RNA酶抑制剂、逆转录酶M_MLV、Taq DNA酶及dNTPs购自美国Promega公司。DEPC(二乙基焦碳酸乙酯)来源于上海森雄科技实业有限公司提供。Western blot试剂高分子量蛋白质Marker (KD)购于武汉博士德公司。硝酸纤维素膜来源于上海博亚生物技术有限公司。乙腈(分析纯)，氯化钠(分析纯)，丙酮(色谱纯)。(二)试验方法1、滋养层细胞株HTR-8/SVneo的培养将细胞接种于完全营养液中，每25m2培养瓶中，每瓶含5mL完全营养液(含15%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，非必需氨基酸10ml/L及MEM，pH7. 2)，置于5%C02、饱和湿度、37°C培养箱内培养，待细胞贴壁生长，于3d后换液,去非贴壁细胞,此后每3d换液I次,并在倒置显微镜(日本Olympus公司)下观察细胞形态。2、滋养层细胞株HTR-8/SVneo的传代培养IOd左右，贴壁细胞70_80%融合时，用无Ca2+、Mg2+的Hanks液冲洗培养瓶两次,每25m2培养瓶中加入O. 5%胰蛋白酶/0. 53mmol/LEDTA1. 5mL,于37°C孵箱中孵育消化5min后，在倒置显微镜下观察，细胞间隙增大，细胞胞质回缩，细胞变圆时立即加入完全营养液终止反应，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱落形成细胞悬液，收集细胞悬液于离心管1000r/min，离心5min。吸去上清，用完全营养液稀释至所需浓度转种于培养瓶内(按1:2的比例接种传代)，置于5%C02、饱和湿度、37°C培养箱内培养。细胞在对数生长期(3-4d)可继续传代。3、电镜将滋养层细胞株HTR-8/SVneo接种于25m2培养瓶，接种后第二天，将培养瓶中的细胞用细胞刮刮下，离心，沉淀的细胞团用2. 5%戊二醛及1%锇酸双固定，Epon812包埋，超薄切片、染色，在JEM-1010透射电镜下观察细胞(凋亡、坏死)超微结构的病理改变。4、重组载体的构建根据GenBank上gClqR cDNA序列，由杭州赫贝科技有限公司设计合成 2 条引物gl:5' -GCC AAG CTT AAT GGC AGA TGA TTT-3'，g2:5/ -GTG CGCGCC AGT CTT CGA AGT AG-3'。在引物中分别加入Xho I和BamH I酶切位点。取O. 5 μ LcDNA模板，以gl/g2引物进行PCR扩增，反应程序94°C预变性lmin，94°C变性lmin，58°C退火45s，72 °C延伸1. 5min，30个循环。PCR产物用天为时代的PCR纯化试剂盒(型号D6492)进行回收纯化。用Xho I和BamH I双酶切PCR纯化回收产物及载体pcDNA_3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)。在O. 5mL离心管内依次加入T4DNA连接酶缓冲液I μ L、T4DNA连接酶(lOU/i! L) 0. L、载体pcDNA3.1 (酶切纯化产物)lOOng、目的基因(PCR酶切纯化产物)10ng、加入ddH20使得总体积10 u L，室温连接2h，构建pcDNA3. 1-gClqR。参照分子克隆方法，转化DH5ci大肠埃希菌，筛选3-5个阳性克隆、扩增。抽提阳性克隆的重组质粒，进行Xho I和BamH I双酶切，以琼脂糖凝胶电泳鉴定。用PCR筛选阳性转化子，重组子插入片段的序列测定由上海博亚公司协助完成。5、免疫印迹提取流产患者蜕膜组织的胞浆蛋白，每个样本取IOOy g总蛋白上样，湿法电转移至硝酸纤维素膜上。硝纤膜置于封闭液中室温封闭l_2h后放进含抗gClqR单克隆抗体(Temecula, CA，USA)释液中，37°C孵育2h，TBST洗涤15minX3次。将膜放进含抗大鼠IgG 二抗(中国北京达科为生物技术有限公司)稀释液中，在摇床上室温孵育lh，TBST洗涤15minX3次。加入显色液，避光反应5min，在暗室中剪适合大小的胶片压在膜上20s，将胶片放入显影液中反应lmin，取出滴干液体放入水中冲洗，然后放入定影液中定影5s，蒸馏水冲洗。6、蜕膜组织细胞凋亡检测将冰冻组织切片置10%的中性甲醛中，于室温固定IOmin后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇乙酸(体积比2 :1)的溶液中，于-20°C处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液(Trlzma碱3. 63g用0.1N HCl调节pH至7. 2，加ddH20定容到IOOOmL ;再加入二甲砷酸钠29. 96g和氯化钴0. 238g)，置室温l_5min。用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上滴加54 ii LTdT酶反应液(TdT酶32 ii L ；TdT酶缓冲液76 u L)，置湿盒中于37V反应lh，(注意阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液)。将切片置于染色缸中，加入已预热到37°C的洗涤于终止反应缓冲液，于37°C保温30min,每IOmin将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动。用PBS洗漆3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。PBS洗涤4次，每次5min。在切片上直接滴加新鲜配置的0. 05%DAB溶液，室温显色3-6min ;蒸馏水洗涤4次，前3次每次lmin，最后I次5min ;于室温用甲基绿进行复染IOmin0蒸馏水洗涤3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后一次静置30s。依同样的方法用100%正丁醇洗三次。用 二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。7、滋养层细胞株HTR-8/SVneo凋亡检测流式细胞技术0. 25%胰酶消化对数期细胞，梭形细胞大部分变圆后，加入含血清培养基终止消化，用吸管反复吹打贴壁细胞，使细胞脱离，制成细胞悬液。细胞直接收集到IOmL的离心管中，500-1000r/min离心5min,弃去培养液。用预冷，4°C无菌的PBS充分洗涤细胞两次，用250 ii L结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为lX106/mL。取IOOii L的细胞悬液于5mL流式管中，加入5 ii L Annexin V-FITC和10 u L20 u g/mL的PI溶液，混匀后室温下避光孵育10_15min。孵育后加入400uL结合缓冲液，立即上流式细胞仪分析(实验必须在一小时内完成)。流式细胞仪分析流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的带通滤器(band pass filter)检测FITC突光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。8、滋养层细胞株 HTR-8/SVneo 内活性氧(reactive oxygen species, R0S)产生的突光测定应用突光染料分子探针H2DCFDA (2’ , 7’ -Dichlorofluorescein diacetate,2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐)。具体实验步骤为将滋养层细胞浓度调整至I X106/mL，接种至6孔培养板，实验如上述分组，滋养层细胞培养至指定时间，加入10 μ M H2DCFDA孵育20min后，用倒置荧光显微镜观察细胞内ROS产生，以相对对照组的荧光强度作为细胞内ROS水平。激发光和发射光波长分别为488nm和530nm，进行独立实验10次。9、细胞内线粒体膜电位的测定应用新型突光探针JC-1 (tetrechloro-tetraethylb-enzimidazo-1 carbocyanine iodide,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物)标记线粒体，检测线粒体膜电位变化；具体实验步骤为将滋养层细胞株HTR-8/SVneo浓度调整至I X 106/mL,接种至6孔培养板，实验如上述分组，滋养层细胞培养至指定时间，在培养基中加入终浓度为10 μ M的JC-1，37°C稳定培养20min ;荧光显微镜下检测荧光变化，检测JC-1单体时(激发波长485nm，发射波长530nm)，以相对对照组的荧光强度作为细胞内线粒体膜电位。二、统计学处理用SPSS16. O统计软件，计量资料用均数土标准差(x±^ )表示，各组间均数比较采用单因素方差分析(AN0VA)，方差分析显著时进行多重比较，方差齐性采用LSD法，方差不齐者采用Games-Howell法。以P〈0. 05为差异有统计学意义。三、实验数据1、流产患者蜕膜组织中滋养层细胞凋亡检测本研究在于确定流产患者蜕膜组织中滋养层细胞凋亡检测，Tunel技术原位观察显示，自然流产蜕膜组织凋亡细胞数明显高于正常妊娠人工流产蜕膜组织(图1)。2、自然流产患者蜕膜组织中滋养层细胞在电镜下有凋亡小体形成，而细胞膜、细胞器却相对完整，呈现细胞凋亡的典型特征(图2)。3、采用Western blot技术对自然流产者脱膜组织中gClqR蛋白表达进行检测，结果发现其gClqR蛋白表达水平显著上调(图3)。
4、体外培养滋养层细胞凋亡检测本研究在于确定体外培养滋养层细胞施加不同因素后凋亡检测，流式细胞仪检测显示，GFP-gClqR vector组，细胞凋亡明显高于gClqRmAb组(图4)5、GFP_gClqR vector干预滋养层细胞后，电子显微镜下观察发现细胞中线粒体数量减少，嵴断裂、减少、消失，部分线粒体肿胀，甚至呈空泡状(图5A);荧光定量PCR检测发现细胞中线粒体拷贝数显著减少(图5B);荧光探针DCFDA检测发现细胞内活性氧ROS含量显著升高(图5C)，而gClqRmAb组，上述滋养层细胞线粒体基本特性无显著改变。四、实验结论本研究系列观察了 gClqR mAb对滋养层细胞线粒体功能的保护作用，阐明了gClqR基因致线粒体损伤的证据；评估线粒体功能变化在gClqR基因致滋养层细胞凋亡中的作用，论证gClqR基因致滋养层细胞凋亡引发自然流产的线粒体机制。gClqR基因的研发将为自然流产的机制提供新理论，gClqR mAb为自然流产的早期防治提供新线索和潜在的干预靶标，可用于制备防治自然流产的药物或者制备抑制滋养层细胞凋亡的药物。
_序歹丨j 表_
<110>南京市妇幼保健院<120〉一种防治自然流产的单克隆抗体及其应用<160〉 2
<210〉 I<211〉 24<212〉 DNA〈213〉人工序列<220〉
<223〉上游引物<400〉 I
gccaagctta atggcagatg attt 24
<210〉 2<211〉 23<212〉 DNA
<213〉人工序列<220〉
〈223〉下游引物<400〉 2
gtgcgcgcca gtcttcgaag tag 2权利要求
1.一种抗自然流产的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体为gClqR单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于该gClqR单克隆抗体为美国Millipore公司货号为AB2991的产品。
3.gClqR单克隆抗体在制备防治自然流产药物中的应用。
4.gClqR单克隆抗体在制备抑制滋养层细胞凋亡的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药领域，公开了一种防治自然流产的单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体为gC1qR单克隆抗体。该单克隆抗体具有抗自然流产功能，可用于制备防治自然流产药物。
文档编号C07K16/28GK103044551SQ20121052110
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者高玲娟, 顾平清, 宫辉, 吕康泰, 李秀玲 申请人:南京市妇幼保健院