针对egfr的单克隆抗体修饰的pamam自组装转基因组合物及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了针对EGFR的单克隆抗体修饰的PAMAM自组装转基因组合物及应用。本发明提供了一种用于核酸转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、针对EGFR的单抗和核酸复合制成。本发明具有以下优点：1)本发明利用表皮细胞生长因子受体(EGFR)为靶点，利用单抗与肿瘤细胞EGFR介导的内吞作用，提高PAMAM载体对细胞的靶向性；2)通过单克隆抗体(mAb)对PAMAM的修饰，可降低PAMAM载体过强的正电荷强度，有利于降低细胞毒性和溶血现象的发生；3)采用自组装方法制备mAb/PAMAM?G5/DNA组合物，与化学合成相比，分子自组装方法可以更方便、灵活的对体系进行修饰，并且保持配体的生物活性。
【专利说明】针对EGFR的单克隆抗体修饰的PAMAM自组装转基因组合物 及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种针对EGFR的单克隆抗体修饰的PAMAM自 组装转基因组合物及应用。
【背景技术】
[0002] 新兴的基因治疗手段是通过将外源性基因片段如质粒DNA、寡聚核苷酸、小干扰 RNA转入细胞内部，调控基因表达以纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进 展，杀灭病变的细胞，从而达到治疗的目的。由于基因治疗可以跨越传统治疗手段的瓶颈， 基因治疗技术自问世以来就受到各种科学家和政府的高度重视，发展尤为迅速，其有效性 也已被证实，也成为重大恶性疾病治疗领域（例如癌症、重大恶性传染病、遗传类疾病）的 前沿和热点。
[0003] 载体技术一直为基因治疗研究的核心领域之一，也是影响基因治疗效果的关键因 素。基因治疗的成功实现取决于基因载体能否高效、安全、靶向将治疗性基因片段递送到 靶向组织和细胞，并且在胞内高效而且可控地进行基因表达。常用的基因递送载体分为病 毒类载体和非病毒纳米基因递送载体两大类。病毒载体比非病毒载体更能够在体内转染效 率更为高效，但由于安全性、运载基因片段长度受限制等原因，同时病毒载体规模生产难度 大、成本大、产业化比较困难，限制了其在基因治疗领域中的应用。与病毒载体相比较，非病 毒载体具有良好的安全性，高稳定性，低免疫源性，导入基因容量大、易放大生产并且成本 低进行表面修饰且运载基因片段的大小更具有灵活性等优点越来越多地受到人们的青睐。 但非病毒载体转染效率较低，靶向性低，是其比较大的问题和缺陷。
[0004] 新型树枝状高分子聚酰胺-胺（PAMAM)，以其独特的分子结构和表面性质，成为 了治疗性基因载体研究的热点。以末端为胺基的PAMAM树枝状大分子为例，它在生理 PH 条件下具有很好的溶解性；由于能够通过其所带的阳离子和DNA所带的阴离子的静电相 互作用，不但可以实现更多数量基因的运载，提高转染效率；而且体系稳定，非常适合作 为DNA的载体，能有效地在不同的细胞类型间转移遗传物质；可介导外源基因在宿主细 胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因的长期、稳定表达；能够保护目的基因不受体内 血浆或组织细胞中各种酶的破坏，因而可以实现体内的有效转染[Pr 0c. Natl. Acad. Sci. USA, 93:4897-4902]。
[0005] 众多研究表明，PAMAM纳米基因递送系统在体外转染中表现良好的应用前景，但 PAMAM作为纳米基因递送载体在体内应用尚存在以下几个问题需要解决：;〇转染效率相对 较低；2)在体内环境下，PAMAM可以非特异性的结合大量的负电大分子和红细胞，影响转染 效率并且发生溶血现象； 3)如何实现PAMAM纳米基因递送系统的靶向性。
[0006] 为了解决上述问题，目前研究多直接在PAMAM分子上进行修饰，如在PAMAM表面修 饰鸟氨酸等残基[Int J ?1!31111，2010,392:294 - 303]，增强？4腿1分子表面正电性以増强转 染效率，但此方法在增强过多正电性的同时，也提高了细胞毒性；另一方面，对PAMAM表面 修饰PEG [Nanotechnology, 2009, 20:105-103]，以提高生物相容性，减少非特异性的结合血 浆中的负电大分子和红细胞，另外，在PEG末端修饰特定蛋白如乳铁蛋白[BiomaterialS，2 008, 29 (2) : 2：38-246]，以实现组织靶向性，但PEG的修饰增加了 PAMAM分子和DNA分子结合 的空间位阻，降低了转染效率。
[0007]表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是一种具有酿氨 酸激酶活性的生长因子受体，在正常细胞表达率低，而在多种肿瘤如肺癌、大肠癌、肾癌和 头颈部鳞癌等多种肿瘤细胞中存在过度表达。EGFR信号通路在癌症的发生发展中起着重要 作用，EGFR的异常表达常与恶性肿瘤的特征如细胞增殖、免疫逃避、转移复发、肿瘤血管形 成以及化疗抗拒、不良预后等相关，为以EGFR为靶点的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路 的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。
[0008]目前以EGFR为靶点的肿瘤治疗方式中单克隆抗体为常见治疗方法，EGFR单克隆 抗体与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生 抗肿瘤效应，也可与抗癌药物或毒素相偶联，从而达到特异性抑制肿瘤生长的目的。
[0009] 例如，尼妥珠单克隆抗体（Nimotuzumab，h-R3)为抗人EGFR人源化单克隆 抗体（mAb)，具有人源性、高选择性和半衰期长的特点，能够竞争性抑制内源性配体与 EGFR的结合，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，阻断由EGFR介导的下游信号转导通路。体 内外研究表明，h-R3有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成以 增加放化疗敏感性的作用[Expert Rev Anticancer Ther, 2003, 3(3) :367-380 ;Lung Cancer, 2013, 79(3)270-275]。
[0010] 西妥昔单克隆抗体（Cetuximab)为抗EGFR人/鼠嵌合单克隆抗体，可特异性地 与正常细胞和肿瘤细胞膜表面EGFR结合，竞争性抑制EGF和TGFa等配体与EGTO的结 合。Cetuximab与放疗结合用于治疗局部区域性早期头颈部鳞状细胞癌，与伊立替康合用治 疗EGFR阳性、伊立替康化疗无效的转移性结直肠癌。[Eur J Cancer, 2007, 43 (1):35-45 ; Drugs, 2010, 70 (15) :1987-2010 ；Eur J Cancer, 20 1 3, 49 (2) 439-448.] Panitumumab(VEXTIBIX，ABX-EGF)是一种由 XenoMouse 技术生产的完全人源 IgG2 抗 EGFR 单克隆抗体，无鼠源蛋白。与其他抗EGFR抗体一样,panitumumab的作用机制也是通过阻断 EGF和TGF α与肿瘤细胞上EGFR的结合，诱导EGFR的内化，进而消除EGFR介导的细胞效应。 panitumumab与氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康合用或在化疗后用于治疗EGFR阳性的转移性 直结肠癌[Clinical Therapeutics, 2008, 30 (1) 14-30 ;Critical Reviews in Oncology/ Hematology, 2010, 74(1), 16-26 ；Clinical Colorectal Cancer, 2012, 11(1) 14-23 ；]
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的是提供一种用于核酸转基因的组合物。
[0012] 本发明提供的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、针对EGFR的 单抗和核酸复合制成。
[0013] 上述组合物中，所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均分子量为28824· 81。
[0014] 上述组合物中，所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述核酸的氮/磷比为1:卜60:1。
[0015] 上述组合物中，所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述核酸的氮/磷比为10:1、20:1 或40:1。
[0016] 上述组合物中，所述单抗与所述核酸的质量比为〇· 1:1-5:1。
[0017] 上述组合物中，所述单抗与所述核酸的质量比为1:1。
[0018] 上述组合物中，所述针对EGFR的单抗为尼妥珠单抗h-R3，其他EGFR单克隆抗体也 可以实现本发明；
[0019] 所述核酸为DNA或siRNA，所述DNA可为抗肿瘤基因。
[0020] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述的用于核酸转基因的组合物的方法。
[0021] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0022] 将末端为氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与DNA混合后，孵育条件下自 组装形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与DNA的组合物；再将所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与 DNA的组合物中加入到所述针对EGFR的单抗中，孵育条件下自组装形成聚酰胺-胺树枝状 聚合物、所述针对EGFR的单抗和DNA的组合物，即得到所述用于核酸转基因的组合物
[0023] 上述的组合物在制备治疗肿瘤细胞产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0024] 或上述的组合物在靶向运输核酸或在制备运输核酸产品中的应用也是本发明保 护的范围；
[0025] 或上述的组合物在制备逆转肿瘤细胞多药耐药产品中的应用也是本发明保护的 范围。
[0026] 上述应用中，所述产品为药物，所述肿瘤细胞为表达EGFR的肿瘤细胞，所述表达 EGFR的肿瘤细胞具体为Η印G2。
[0027] 本发明的实验证明，本发明具有以下优点：
[0028] 1)本发明利用表皮细胞生长因子受体（EGFR)为靶点，采用针对EGFR的单克隆抗 体（mAb)如h-R3作为配体，通过自组装的方法形成单抗修饰的PAMAM载体作为基因递送载 体，利用单抗与肿瘤细胞EGFR介导的内吞作用，提高PAMAM载体对细胞的靶向性，最大限度 地降低非靶细胞的摄入，可在提高有效性的同时降低毒副作用；同时可以竞争性抑制内源 性配体与EGFR的结合，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，阻断由EGFR介导的下游信号转导通 路，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成以增加放化疗敏感性的 作用。
[0029] 2)通过单克隆抗体（mAb)对PAMAM的修饰，可降低PAMAM载体过强的正电荷强度， 有利于降低细胞毒性和溶血现象的发生；
[0030] 3)采用自组装方法制备mAb/PAMAM G5/DNA组合物，与化学合成相比，分子自组装 方法可以更方便、灵活的对体系进行修饰，并且保持配体的生物活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为Western Blot法检测不同细胞系（HepG2、MCF-7、293T)中EGRF的表达量。
[0032] 图2为mAb修饰对mAb/PAMAM G5/DNA复合物Zeta电位的影响。
[0033] 图3为mAb修饰对mAb/PAMAM G5/DNA复合物粒度的影响。
[0034] 图4为制备的mAb/PAMAM G5/DNA复合物的透射电镜图（放大倍数200000X)。
[0035] 图5为制备的mAb/PAMAM G5/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果。
[0036] 图6为mAb修饰对PAMAM/DNA复合物在IfepG2细胞毒性的影响。
[0037] 图7为mAb修饰对PAMAM/DNA复合物在MCF-7细胞毒性的影响。
[0038] 图8为mAb修饰对PAMAM/DNA复合物在293T细胞毒性的影响。
[0039] 图9为mAb修饰对PAMAM/DNA复合物在表达EGFR的HepG2细胞中的体外转染效 果的影响。
[0040] 图10为mAb修饰对PAMAM/DNA复合物在EGFR不表达的293T细胞中的体外转染 效果的影响。
[0041]图 11 为 mAb/PAMAM G5/DNA 复合物对比 HSA/PAMAM G5/DNA、EGF/PAMAM G5/DNA 的 体外转染效果
[0042]图 I2 为 mAb/PAMAM G5/DNA 复合物对比 HSA/PAMAM G5/DNA、EGF/PAMAM G5/DNA 的 肿瘤分布结果
[0043] 图13为RT-PCR法检测mAb修饰对PAMAM/DNA复合物转染Ρδ3基因后HepG2细胞 的P53转录水平的影响。 t〇〇44]图 14 为 MCF-7/ADR 转染 h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA 后沉默多药耐药基因 MDR-! 的效果。
[0045]图 I5 为 Western Blot 法检测 MCF-VADR 细胞经 h-RVPAMAM G5/GCS siRNA 复合 物和EGF/PAMAM G5/GCS siRNA复合物转染后GCS蛋白的表达
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 聚酰胺-胺树枝状聚合物（PAMAM):末端带有氨基，以乙二胺为核，5. 0代，（购自 Sigma-Aldrich，货号：536709,规格5g，数均分子量为28824.81);采用旋转蒸发仪抽真空， 去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G5,再用PBS缓冲液（pH7· 4)溶解，制备成l〇mg/mL储存液于4? 备用。
[0049] 不同EGFR表达的细胞株HepG2、MCF-7、293T均购自中国医学科学院基础医学研究 所细胞中心，其细胞中EGFR的表达量检测如下：
[0050]采用蛋白质印迹法（Western Blot，WB)检测并验证了 Η印G2、MCF-7、293T三种细 胞中EGFR的表达，结果如图1所示，由结果可知Η印G2、MCF-7中表达EGRF,在293T细胞中 不表达EGRF。
[0051] 下面的实施例以一种EGFR单克隆抗体尼妥珠单抗（Nimotuzumab，h-R3)为例，该 抗体购自百泰生物药业有限公司。
[0052] 实施例1、制备mAb/PAMAM G5/DNA复合物
[0053] 一、PAMAM G5/DNA 复合物
[0054] 首先将上述制成的PAMAM G5 (数均分子量为28824. 81) lOmg/mL储存液溶 解于消毒蒸馏水中，振荡混匀，配制成lmg/mL的工作溶液，4°C储存备用。转染前取 1. 0 μ gpEGFP-Nl质粒DNA (pEGFP-Nl质粒购自Clontech公司）置于EP管中，分别加入 0. 7μ L、l. 4μ L、3. 5μ L、7y L、14u L、21 μ L、28u L 和 42μ L 浓度为 lmg/mL 的 PAMAM G5 工 作溶液，再加入〇pti-MEM培养基（购自invitrogen，产品目录号为ii〇58_021)500uL，混匀 后置室温孵育 3〇 rain形成PA_ G5/DNA复合物。形成的PAMAM G5/DNA复合物中，PAMAM G5 与 DNA 的氮 / 磷比分别为 1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1 和 60:1。
[0055] 二、mAb/PAMAM G5/DNA 复合物及其表征
[0056] 1、mAb/PAMAM G5/DNA 复合物
[0057] 将尼妥珠单抗（Nimotuzumab，h-R3)用 PBS 缓冲液（pH7· 4, NaCl 8. 〇g，KC1 〇· 2g，NaH2P04 ·Η20 1. 56g, ΚΗ2Ρ04 0. 20g，蒸馏水定容至 1000ml)，配制成浓度为 lmg/mL 的单 抗溶液，向100 μ L不同氮/磷比的PAMAM G5/DNA复合物（PAMAM G5与DNA的氮/磷比分 别为1:1、2:1、5:1、10 :1、20:1、30:1、40:1和60:1)加入11^/11^的单抗溶液，混匀后置室温 孵育 30min 形成 mAb/PAMAM G5/DNA 复合物。形成 mAb/PAMAM G5/DNA 复合物中，PAMAM G5 与 DNA 的氮 / 磷比分别为 1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1 和 60:1 ;mAb 与 DNA 的质量 比为1:1。
[0058] 2、mAb/PAMAM G5/DNA 复合物表征
[0059] 1)、mAb/PAMAM G5/DNA 复合物的 Zeta 电位
[0060] 采用激光粒度及Zeta电位测定仪（英国Malvern公司，型号Zetasizer Nano ZS 90)对 1 制备的 mAb/PAMAM G5/DNA 复合物（mAb-dendriplex ;PAMAM 与 DNA 的氮 / 磷比分 别为1:1、2:1、5:1、10:1、20:1和30:1;11^13与0碰的质量比为1:1)的26七3电位进行测定。 以 PAMAM G5/DNA 复合物（dendriplex)为对照。
[0061] 结果如图2所示，采用单抗修饰预先成型的PAMAM G5/DNA复合物，随着复合物中 PAMAM与DNA的氮/磷比的增加，复合物的正电性逐渐增强，当氮/磷比为10:1时达到最大 值，之后不再发生明显变化。
[0062] 2、mAb/PAMAM G5/DNA 复合物的粒径
[0063] 采用激光粒度及Zeta电位测定仪（英国Malvern公司，型号Zetasizer Nano ZS 90)对制备的mAb/PAMAM G5/DNA复合物（PAMAM与DNA的氮/磷比分别为1:1、2:1、5:1、 10:1、20:1和30:1 ;mAb与DNA的质量比为1:1)的粒径大小进行测定。以PAMAM G5/DNA复 合物为对照。
[0064] 结果如图3所示，粒径则随着氮/磷比的增加逐渐减小，当氮/磷比为10:1时达 到210nm，之后不再发生明显变化，mAb/PAMAM G5/DNA与PAMAM/DNA复两者电位和粒径的变 化趋势一致。
[0065] 透射电镜检测mAb/PAMAM G5/DNA复合物（PAMAM与DNA的氮/磷比为20:1，单抗 与DNA的质量比为1:1)，结果如图4所示，观测其粒度与激光粒度仪测定结果相似。
[0066] 3、mAb/PAMAM G5/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
[0067] 将上述制备的mAb/PAMAM G5/DNA复合物采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验证明 PAMAM与DNA的复合情况以及稳定性，所检测的mAb/PAMAM G5/DNA复合物中，PAMAM与DNA 的氮/磷比分别为l:l、2:l、5:l、10:l、20:l、40:l、60:l，mAb与DNA的质量比为1:1。具体 方法如下：
[0068] 称取适量琼脂糖，加入IX TAE溶液，加热溶解，配制1 %琼脂糖凝胶溶液，室温冷 却至约5〇°C，加入1 μ L溴化乙锭溶液（500 μ g/ml)插入DNA染色，灌胶，加样，120V电泳 30min左右，紫外透射仪观察并拍照。新鲜配制所需转染复合物，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定包 封效果。
[0069] 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果如图5所示，1为pEGFP-Nl质粒DNA ;2至8为氮 / 磷比分别为 1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、40:1、60:1 的 mAb/PAMAMG5/DNA 复合物；9 为 DNA Marker，从图中可见，当氮/磷比达到10:1之后，无明显的游离DNA条带，此时形成的mAb/ PAMAM G5/DNA复合物是稳定的，可以有效包裹DNA。
[0070] 实施例2、mAb/PAMAM G5/DNA复合物的细胞毒性评价
[0071] 对上述实施例1制备mAb/PA_ G5/DNA复合物进行细胞毒性实验，mAb/PA_ 65/0隱复合物中，？八_与0碰的氮/磷比分别为1:1、5:1、10:1、20 :1、40:1和60:1;11^ 与DNA的质量比为1: 1。采用MTT法检测其细胞增殖情况，具体方法如下：
[0072] 分别将^^2、10^-7、293!'细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心） 按每孔10000个细胞接种96孔板，24 h后按最佳质量比转染，将细胞随机分为正常对照组、 PA_ G5/DNA组以及mAb/PAMAM G5/DNA转染组（质粒浓度为0. 5ug/mL，每组设6个复孔， 重复3次，处理24h)。光镜下观察细胞的形态变化、生长特点，移行方式以及培养基的改变， 用MTT法测定OD490值绘制生长曲线并计算各组细胞的相对存活率（％ )。
[0073] 细胞的相对存活率（％ )=(实验组0D490值/对照组0D490值）X 100%。
[0074] 图6-8依次为在HepG2、MCF-7、293T中的细胞毒性实验结果图，从图中可见，mAb/ PAMAM G5/DNA复合物（mAb-dendriplex)转染细胞后，存活率高于未修饰的PAMAM G5/DNA 复合物（dendriplex)，表明，mAb/PAMAM G5/DNA复合物的细胞毒性低于未修饰的PAMAM/ DNA复合物，对Η印G2、MCF-7、293T细胞的作用结果一致。
[0075] 同时在结果中还发现，随着氮/磷比的增加，复合物对细胞的毒性也会随之增加， 对于三种不同的细胞均得出这样的结果。为了避免氮/磷比过大引起过高的细胞毒性，在 之后的实验中没有再选择氮/磷比60:1进行实验。
[0076] 因此，结合上述结论，mAb/PAMAM G5/DNA复合物中，PAMAM与DNA的氮/磷比分别 为10:l、20:l、40:l，mAb与DNA的质量比为1:1，为最佳反应组合物。
[0077] 实施例3、mAb/PAMAM G5/DNA复合物在将DNA靶向导入细胞中的应用
[0078] 一、raAb/PA_ G5/DNA复合物提高DNA的转染效率和细胞靶向性
[0079] 1、mAb/PAMAM G5/DNA 复合物将 DNA 导入表达 EGFR 的 HepG2 细胞
[0080] 按照实施例1的方法制备如下复合物：
[0081] mAb/PAMAM G5/DNA复合物：PAMAM与DNA的氮/磷比为10:1，mAb与DNA的质量比 分别为 〇(不加入单抗）、0. 1:1、〇. 5:1、1:1、2:1、5:1 ;
[0082] mAb/PAMAM G5/DNA复合物：PAMAM与DNA的氮/磷比为20:l，mAb与DNA的质量比 分别为 〇(不加入单抗）、0. 1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1 ;
[0083] mAb/PAMAM G5/DNA复合物：PAMAM与DNA的氮/磷比为40:1，mAb与DNA的质量比 分别为 〇(不加入单抗）、0. 1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1 ;
[0084] 将实施例1制备的mAb/PAMAM G5/DNA复合物和上述各种复合物在表达EGFR的 HepG2细胞中进行体外转染实验，具体方法如下：
[0085] 收集对数生长期的HepG2细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心） 接种于24孔细胞培养板，每孔50000个，于37°C和5% C02培养24h至细胞达到70%汇 合度，弃培养基，用PBS洗涤三次。然后加入相应转染复合物:mAb/PAMAM G5/DNA复合物 (mAb-Dendriplex)、PAMAM G5/DNA 复合物（Dendriplex)，于 37°C培养 4h。转染结束后，细 胞用PBS洗三次，并用新鲜含10% FBS的DMEM替换。转染48h后胰酶消化细胞，制成单细 胞悬液，4°C、12000g离心5min后去除上清，加入100yL ρΗ7·4的PBS重悬细胞，并加入 0. 25%的EDTA防止细胞聚集。采用流式细胞仪统计GFP阳性细胞比例。
[0086] 结果如图9所示，与不加入尼妥珠单抗相比，其加入提高了 GFP阳性细胞比例，高 氮/磷比提高了 GFP阳性细胞比例。
[0087] 此结果表明，采用尼妥珠单抗修饰的PAMAM/DNA复合物可以提高GFP在表达EGFR 的HepG2细胞中的表达，尼妥珠单抗修饰的mAb/PAMAM G5/DNA复合物对表达EGFR的细胞 具有特异性和选择性。
[0088] 2、mAb/PAMAM G5/DNA复合物在EGFR不表达的293T细胞中的体外转染实验
[0089] 对上述1制备的mAb/PAMAM G5/DNA复合物在EGFR不表达的293T细胞中进行体 外转染实验，具体方法如下：
[0090] 收集对数生长期的293T细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心） 接种于24孔细胞培养板，每孔50000个，于37°C和5% C02培养24h至细胞达到70%汇 合度，弃培养基，用PBS洗涤三次。然后加入相应转染复合物：mAb/PAMAM G5/DNA复合物 (mAb-Dendriplex)、PAMAM_DNA 复合物（Plain-Dendriplex)，于 37°C培养 4h。转染结束后， 细胞用PBS洗三次，并用新鲜含10% FBS的DMEM替换。转染48h后胰酶消化细胞，制成单 细胞悬液，4°C、12000g离心5min后去除上清，加入100 μ LpH7. 4的PBS重悬细胞，并加入 0. 25%的Η)ΤΑ防止细胞聚集。采用流式细胞仪统计GFP阳性细胞比例。
[0091] 结果如图10所示，与不加入尼妥珠单抗相比，其加入反而降低了 GFP阳性细胞比 例。此结果表明，采用尼妥珠单抗修饰的PAMAM/DNA复合物会降低GFP在EGFR不表达的 293T细胞中的表达，说明尼妥珠单抗修饰的PAMAM/DNA复合物对EGFR不表达的细胞不具有 特异性和选择性。
[0092] 3、三种不同配体修饰的复合物（mAb/PAMAM G5/DNA、EGF/PAMAM G5/DNA、HSA/ PAMAMG5/DNA)在EGFR表达的!fepG2细胞中的体外转染实验
[0093] 为了进一步验证mAb/PAMAM G5/DNA具有更好的转染效率和细胞靶向性，以EGF/ PAMAM G5/DNA、HSA/PAMAM G5/DNA 作为对照进行比较，EGF 和 HSA 修饰的 PAMAM G5 作为 DNA 的递送载体能够有效地将DNA靶向递送到肿瘤细胞，提高其转染效率，并且降低PAMAM G5 的毒性已经被公开。
[0094] 按照实施例1的方法制备如下复合物：
[0095] mAb/PAMAM G5/DNA 复合物（mAb-Dendriplex) :PAMAM 与 DNA 的氮 / 憐比为 20:1, mAb与DNA的质量比分别为0. 5:1、2:1 ;
[0096] 对照组 HSA/PAMAM G5/DNA 复合物（HSA-Dendriplex) :PAMAM 与 DNA 的氮 / 磷比为 20:1,将mAb替换为HSA, HSA与DNA的质量比分别为0· 5:1、2:1 ;
[0097] 对照组 EGF/PAMAM G5/DNA 复合物（EGF-Dendriplex) :PAMAM 与 DNA 的氮 / 磷比为 20:1,将mAb替换为EGF，EGF与DNA的质量比分别为0· 5:1、2:1 ;
[0098] 将上述制备的 mAb/PAMAM G5/DNA、HSA/PAMAM G5/DNA、EGF/PAMAM G5/DNA 复合物 在EGFR过表达的Η印G2细胞中进行体外转染实验，具体方法如下：
[0099] 收集对数生长期的HepG2细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心） 接种于24孔细胞培养板，每孔50000个，于37°C和5% C02培养24h至细胞达到70%汇 合度，弃培养基，用PBS洗涤三次。然后加入相应转染复合物：mAb/PAMAM G5/DNA复合物 (mAb-Dendriplex)、HSA/PAMAM G5/DNA 复合物（HAS-Dendriplex)、EGF/PAMAMG5/DNA 复合 物（EGF-Dendriplex)，于37°C培养4h。转染结束后，细胞用PBS洗三次，并用新鲜含10% FBS的DMEM替换。转染48h后胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，4°C、12000g离心5min后去 除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的PBS重悬细胞，并加入0· 25%的EDTA防止细胞聚集。采用流 式细胞仪统计GFP阳性细胞比例。
[0100] 结果如图 11 所示，与HSA/PAMAM G5/DNA复合物（HAS-Dendriplex)、EGF/PAMAMG5/ DNA 复合物（EGF-Dendriplex)相比，mAb/PAMAM G5/DNA 复合物（mAb-Dendriplex)在 HepG2 细胞中的转染效率最高，说明单抗修饰的PAMAM/DNA复合物对EGFR高表达的细胞具有更高 的特异性和选择性，可以将DNA更好地靶向递送到细胞中。上述结果表明，mAb修饰的PAMAM G5对EGFR表达的细胞具有特异性和选择性，可以将DNA更好地靶向递送到这类细胞中，提 高其转染效率。同时相比于非修饰的PAMAMG5以及HSA和EGF修饰的PAMAM G5具有更高 的细胞靶向性，可以将DNA更有效地靶向递送到EGFR表达的细胞中。
[0101] 4、三种不同配体修饰的复合物（mAb/PAMAM G5/DNA、EGF/PAMAM G5/DNA、HSA/ PAMAMG5/DNA)在HepG2荷瘤小鼠中的肿瘤靶向分布实验
[0102] 为了进一步验证mAb/PAMAM G5/DNA的肿瘤靶向性，进行了三种不同配体修饰的复 合物（mAb/PAMAM G5/DNA、EGF/PAMAM G5/DNA、HSA/PAMAM G5/DNA)在Η印G2 荷瘤小鼠中的肿 瘤靶向分布实验。按照上述实施例1制备方法分别制备三种不同配体修饰的复合物（mAb/ PAMAM/DNA、EGF/PAMAM/DNA、HSA/PAMAM/DNA)，其中 PAMAM 与 DNA 的氮 / 磷比确定为 20:1， 配体（mAb、EGF、HSA)与DNA的质量比为2:1，制备过程中选择Cy5对三种复合物进行标记， 进一步采用小动物活体成像技术检测三种不同配体修饰的复合物（mAb/PAMAM/DNA、EGF/ PAMAM/DNA、HSA/PAMAM/DNA)的离体肿瘤分布。
[0103] 具体方法如下：
[0104] 以雌性BALB/C裸鼠为动物模型，进行HepG2肿瘤细胞接种（皮下接种，1〇7只）， 接种14天后进行给药，分别静脉注射cy5标记的mAb/PAMAM/DNA、EGF/PAMAM/DNA、HSA/ PAMAM/DNA，每只荷瘤小鼠的注射体积为200 μ 1。注射给药24h、48h后，处死荷瘤裸鼠，剥离 出肿瘤组织，通过小动物活体成像仪检测给药不同时间后肿瘤部位的荧光信号。
[0105] 结果如图12所示，注射48h后，肿瘤组织的荧光信号更强，说明随着时间的延长复 合物在肿瘤部位蓄积增加。而且与EGF/PAMAM/DNA、HSA/PAMAM/DNA相比较，mAb/PAMAM/DNA 在肿瘤部位的荧光信号强度更强，说明单抗修饰的PAMAM/DNA复合物具有更好的肿瘤靶向 性。
[0106] 实施例4、mAb/PA_ G5/DNA复合物在作为抗肿瘤基因治疗药物中的应用 [0107] 按实施例1所述的方法制备PAMAM G5/DNA复合物、mAb/PAMAM G5/DNA复合物，不 同的是将pEGFP-ΝΙ质粒DNA替换为等量的pCMV-flag-P53质粒DNA(pCMV-flag-P53质粒 购自碧云天生物技术研究所，p53是一种肿瘤抑制基因，对细胞周期和凋亡起关键性作用， 能够抑制并杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤血管生成，有效防止肿瘤的复发、转移，提高人体自身 的免疫功能），得到PA_ G5/DNA复合物（PAMAM与DNA的氮/磷比为20:1)和mAb/PAMAM G5/DNA复合物（PAMAM与DNA的氮/磷比为20:1，mAb与DNA的质量比为1:1)。
[0108] 按照上述方法制备mAb/PAMAM G5/DNA复合物，不同的是将pEGFP-Nl质粒DNA替 换为等量的PCMV质粒DNA，得到mAb/PAMAM G5/DNA复合物，该复合物中，PAMAM与DNA的氮 /憐比为20:1，mAb与DNA的质量比为1: 1。
[0109]采用RT-PCR法检测上述三种复合物转染p53基因（这个地方的 P53基因删掉吧， 因为其中一个对照不是Ρδ3)后Η印G2细胞的P53转录水平，具体方法如下：
[0110]将上述三种复合物转染P53基因（同上）后的HepG2细胞，依照说明书使用 TransZol Up(ER601-01，北京全式金生物技术有限公司）提取其总rnA。参照逆转录 (Α?ΟΙ-02,北京全式金生物技术有限公司）说明书，以 RNA为模板合成cDNA，RT_PCR检测 目的条带。
[0111] RT-PCR 实验采用采用 50uL PCR 体系，包括 〇. 5yL TransTaq DNA 聚合酶、5yL lOXTransTaq反应溶液、4μ L dNTPs、PCR正义和反义引物各1 μ L、cDNA模板2 μ L、双蒸水 36. 5 μ L〇
[0112] P53 引物：正义：5 ' -CTACAAGCAGTCACAGCACATGAC-3，；反 义：5' -TCATTCAGCTCGGAACATCTCG-3，，片断长度 551bpD
[0113]退火温度为55°C，反应循环数为35,产物使用TAE缓冲液配制的2 %琼脂糖凝胶电 泳检测。
[0114] 以未转染任何物质的细胞为对照。
[0115] 结果如图13所示，相比于对照组（未转染细胞和mAb/PAMAM G5/DNA)，转染了 p53 基因的mAb-PAMAM G5-p53和PA_ G5-p53均有p53条带，使用单抗修饰的PAMAM-p53-mAb 组的条带亮度和信号强度更加明显，说明单抗修饰的PAMAM转染p53基因后能够提高其在 EGFR过表达的HepG2细胞中的转录水平。
[0116] 表明mAb/PAMAM G5/DNA复合物可以用来导入抗肿瘤基因，从而作为抗肿瘤治疗药 物。
[0117] 实施例5、mAb修饰的PAMAM G5用于递送小核酸的应用
[0118] 一、h_R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA转染进入MCF-7/ADR细胞后多药耐药基因 MDR1 沉 默效果
[0119] 按实施例1所述的方法制备PA_ G5/MDR1 siRNA复合物和h-R3/PAMAM G5/ MDRlsiRNA复合物，不同的是将DNA替换为MDR1 siRNA，其中PAMAM与DNA的氮/磷比确定 为20:1，h - R3与MDR1 siRNA的质量比为0. 5:1。利用RT-PCR法检测两种复合物转染进 入耐药细胞MCF-7/ADR后MDR1基因表达量的变化。
[0120] 多药耐药基因（MDR1)小干扰RNA(MDR1 siRNA):购自苏州瑞博生物技术公司，其 由序列表中序列1所示的单链正义链和序列表中序列2所示的单链反义链组成的双链RNA。
[0121] 正义链 CAGAAAGCUUAGUACCAAAdTdT (序列 1)
[0122] 反义链 UUUGGUACUAAGCUUUCUGdTdC (序列 2)
[0123] 引物序列为：MDR1 for ATATCAGCAGCCCACATCAT
[0124] MDR1 re GAAGCACTGGGATGTCCGGT
[0125] 结果如图 14 所示，1:未转染 MCF-7/ADR 中的 MDR1 ;2:转染 PAMAM G5/MDRlsiRNA 复合物 MCF-7/Adr 中的 MDR1 ;3:转染 h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA 复合物 MCF-7/ADR 中的 MDR1;看出，相比于非修饰的 PAMM G5/MDR1 siRNA 复合物，h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA 复 合物转染后耐药细胞MCF-7/ADR中几乎检测不出MDR1基因的表达，说明MDR1基因有可能 被完全沉默。说明mAb修饰的PAMAM G5可以作为MDR1 siRNA的递送载体，能够携载MDR1 siRNA更好地靶向到肿瘤耐药细胞，并且易被细胞内吞而且可以逃逸溶酶体,从而更为有效 地发挥沉默目的基因的功能。 _
[0126] 二、h-R3/PAMAM G5/GCS siRNA转染进入MCF-VADR细胞后多药耐药基因 GCS沉 默效果 _
[0127] 按实施例1所述的方法制备h_R3/PAMAM G5/GCS siRNA复合物，不同的是将DNA 替换成GCS siRNA，其中PAMAM与DNA的氮/磷比为2〇:1，且h-R3与GCS siRNA的质量比 为0. 5。同时制备对照复合物EGF/PAMAM G5/GCS siRNA复合物（PAMAM与DNA的氮/磷比 为20:1，且EGF与GCS siRNA的质量比为2)。将两种复合物转染进入耐药细胞MCF-7/ADR， 利用Western Blot法检测转染后细胞中GCS蛋白表达量的变化，同时设定内参GAPDH。
[0128] 具体方法如下：
[0129] 收集状态较好的MCF-7/ADR细胞（细胞计数，一般1〇7个左右），使之保持细胞数 目相同，进行离心（ll〇〇 rPm离心7min)，得到细胞沉淀，之后按照蛋白提取试剂盒进行蛋白 提取。首先用PBS洗涤细胞沉淀2-3次，根据细胞沉淀的多少加入细胞裂解液，加之前要 在细胞裂解液中加入5 %的蛋白酶抑制剂，冰上静置3〇min，测定蛋白浓度，加入Loading Buffer，沸水浴煮l〇min,-2(TC保存备用。之后进行Western Blotting检测。
[0130] 结果如图 15 所示，A:h-R3/PAMAM G5/GCS siRNA 组；B:EGF/PAMAM G5/GCS siRNA 组；条带1:未经复合物处理的MCF-VADR细胞；条带2:经复合物处理的MCF-7/ADR细胞。 从图中条带的亮度可以看出，经两组复合物转染后MCF-7/ADR细胞中的GCS蛋白表达量均 有所下降，h-R3/PA敵M G5/GCS siRNA组GCS蛋白下调的更为明显。这个结果表明相比于 EGF修饰的PAMAM G5/GCS siRNA复合物，尼妥珠单抗h-R3修饰后复合物的转染效率更高， 进入耐药肿瘤细胞后沉默效果更好。
【权利要求】
1. 一种用于核酸转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、针对 EGFR的单抗和核酸复合制成。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均 分子量为28824. 81。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与 所述核酸的氮/磷比为1:1-60:1。
4. 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述 核酸的氮/磷比为1〇:1、20:1或40:1。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的组合物，其特征在于：所述单抗与所述核酸的质量 比为 0. 1:1-5:1。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述单抗与所述核酸的质量比为1:1。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的组合物，其特征在于： 所述针对EGFR的单抗为尼安珠单抗h-R3 ; 所述核酸为DNA或siRNA。
8. -种制备权利要求1-7中任一所述的用于核酸转基因的组合物的方法，包括如下步 骤： 将末端为氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与DNA混合后，孵育条件下自组装 形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与DNA的组合物；再将所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与DNA 的组合物中加入到所述针对EGFR的单抗中，孵育条件下自组装形成聚酰胺-胺树枝状聚合 物、所述针对EGFR的单抗和DNA的组合物，即得到所述用于核酸转基因的组合物。
9. 权利要求1-7中任一所述的组合物在制备抗肿瘤治疗产品中的应用； 或权利要求1-7中任一所述的组合物在靶向运输核酸或在制备运输核酸产品中的应 用； 或权利要求1-7中任一所述的组合物在制备逆转肿瘤细胞多药耐药产品中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为药物； 所述肿瘤细胞为表达EGFR的肿瘤细胞。
【文档编号】A61K48/00GK104189919SQ201410373077
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】郝艳丽, 张小宁, 李军 申请人:清华大学