用于在转基因生物中产生具有至少四个双键的多不饱和C₂₀和C₂₂脂肪酸的方法

专利名称：：用于在转基因生物中产生具有至少四个双键的多不饱和C₂₀和C₂₂脂肪酸的方法用于在转基因生物中产生具有至少四个双键的多不饱和C20-和Cm-脂肪酸的方法发明简述本发明涉及用于通过将核酸导入植物而在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法，其中所述的核酸编码具有A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或0)3-去饱和酶活性的多肽。这些去饱和酶和延长酶有利地f;f生自大豆疫霉(Phytophthorasoj狄》本发明还涉及核酸序列、核酸构建体、包含本发明核酸序列的栽体和生物、包含核酸序列和/或核酸构建体的载体，并且涉及包含上述的梭^列、核酸构建体和/或栽体的转基因植物。本发明的又一部分涉及通过本发明方法产生的脂肪酸组合物及它们的用途。脂肪酸和三酰甘油酯具有在食品工业、动物营养、化妆品及药理学领域内的多种应用。根据它们是否为游离的饱和或不饱和脂肪酸或具有提高含量的饱和或不饱和脂肪酸的三酰甘油酯，它们适合完全不同的应用.多不饱和脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸对哺乳动物是必需的，因为多不饱和脂肪酸不能由哺乳动物产生。多不饱和oj3-脂肪酸和w6-脂肪酸因而是动物和人类营养内重要的构成要素。多不饱和长链"3-脂肪酸例如二十碳五烯酸(=EPA，C20:5A5，8，11，14，17)或二十二碳六烯酸(-DHA，C22:6"，7，1。，13，16，19^其在健康方面(包括儿童脑发育、眼的功能性、激素和其它信号物质的合成以及预防心血管疾病、癌症和糖尿病)的多种功能而作为人类营养的重要成分(Poulos，ALipids30:1-14，1995;Horrocks，LA和YeoYKPharmacolRes40:211-225,1999)。这是为什么需要产生多不饱和长链脂肪酸的原因。鉴于目前人类食物的组成，将优势存在于鱼油内的多不饱和w3-脂肪酸添加至食物内是非常重要的。因此，例如将多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸(-DHA，〔22:6"，7，1°，13，16，19)或二十碳五締酸(=EPA，C20:5A5，8，11，14，17)添加至婴儿配方奶粉内来改善营养价值。据称不饱和脂肪酸DHA对脑功能的发育和维持有积极影响。在下文中，将多不饱和脂肪酸称作PUFA或LCPUFA(Eoly丛nsaturatedfatty且cids，PUFA,long￡haingolyunsaturated〖attygcids,LCPUFA)。多种脂肪酸和甘油三酯主要从^t生物如被孢霉(Mortierella)和裂殖壶菌(Schizochytrium)中获得或从产油植物如大豆、欧洲油菜、藻类如隐甲藻(Crypthecodinium)或褐指藻(Phaeodactyhim)和其它藻类中获得，其中它们通常以其三酰甘油酯(=甘油三酯=三酰甘油)形式获得。然而它们也可以从动物例如鱼中获得。游离脂肪酸有利地通过水解制备。极长链多不饱和脂肪酸，例如DHA、EPA、花生四烯酸(=ARA,C20:4A5，8，"，14)、二高7國亚麻酸(C20:3A8'n，")或二十二碳五烯酸(DPA，022:5"，1()，13，16，19)不能在油料植物例如欧洲油菜、大豆、向日葵或红花内合成。这些脂肪酸的常见天然来源是鱼如绯鱼、鲑鱼、沙丁鱼、红鱼、鳗鲡、鲤鱼、缚鱼、大比目鱼、鲭鱼、梭妒或鲔鱼，或藻。取决于预期用途，优选具有饱和或不饱和脂防睃的油。例如在人类营养中，优选具有不饱和脂肪酸，尤其是具有多不炮和脂肪酸的脂，据称多不饱和oj3-脂肪酸对血液中的胆固醇水平有积极影响并且因此有可能预防心脏病。心脏病、中风或高血压的风险可以通过添加这些co3-脂肪酸至食物内得以显著降低。此外，co3-脂肪酸对与免疫性疾病如类风湿性关节炎有关的炎性过程、尤其对慢性炎性过程有积极影响.因而，它们被添加至食品，尤其食疗性食品内，或应用于药物内。w6-脂肪酸如花生四烯酸总是因我们的日常饮食^A而对与这些风湿性疾病相关的那些功能紊乱有不利影响。co3和co6-脂肪酸是称作类二十烷酸的组织激素如前列腺素(自二高-7亚麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸衍生)的前体并且是血栓烷和白三烯(自花生四烯酸及二十碳五烯酸衍生)的前体。形成自w6-脂肪酸的类二十烷酸(称作PG2系列)通常促进炎性反应，而来自w3-脂肪酸的类二十烷酸(称作PG3系列)具有很少或没有促炎效应。鉴于多不饱和脂肪酸的有益特征，过去从未停止尝试获得参与合成这些脂肪酸或甘油三酯的基因，以便在多种生物中产生具有改良含量的不饱和脂肪酸的油。因而WO91/13972及其美国等效物描述了A9-去饱和酶。WO93/11245要求专利保护A15-去饱和酶并且WO94/11516要求专利保护A12-去饱和酶。而且其它去饱和酶在例如EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP國A隱0794250、Stukey等，J.Biol.Chem.，265,1990:20144-20149、Wada等，Nature347，19卯200-203或Huang等，Lipids34，1999:649-659中进行描述。然而对多种去饱和酶的生物化学表征迄今仍是不充分的，因为作为膜结合蛋白的这些酶严重妨碍对它们进行分离并表征(McKeon等，MethodsinEnzymol.71，1981:12141-12147，Wang等，PlantPhysiol.Biochem.，26，1988:777-792)。原则上，膜结合的去饱和酶通过导入合适的生物内表征，随后通过分析原材料和产物对合适生物酶的活性进行分析。A6-去饱和酶描述于WO93/06712、US5,614,393、US5,614,393、WO96/21022、WO00/21557和WO99/27111并且用于转基因生物内生产的应用描述于WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765。在本上下文中，多种去饱和酶的表达及多不饱和脂肪酸的形成也描迷于WO99/64616或WO98/46776内并要求专利保护.就去饱和酶的表达效率及其对形成多不饱和脂肪酸的影响而言，必须指出表达如所述的单个去饱和酶迄今仅产生低含量的不饱和脂肪^/脂类，如>亚麻酸及十八碳四烯酸。此外，通常得到co3-脂肪酸与w6-脂肪酸的混合物。过去已对获取延长酶基因进行过大量尝试。Millar与Kunst，1997(PlantJournal12:121画131)和Millar等1999，(PlantCell11:825-838)描述来自植物的用于合成单不饱和长链脂肪酸(C22:1)及用于合成极长链脂肪酸(C『C32)(以便在植物中产生蜡)的延长酶的特征。关于花生四烯酸和EPA合成的描述可在例如WO0159128、WO001272t)、WO02077213和WO0208401内找到。多不饱和C24-脂肪酸的合成例如描迷于Tvrdik等，2000，JCB149:707-717或WO0244320。特别适合用于产生PUFA的微生物是微藻，如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、Porphiridi腿物种、破嚢壶菌属(Thraustochytrium)物种、裂殖壶菌属(Schizochytrium)种或隐甲藻属(Crypthecodmium)物种、纤毛虫例如棘尾虫属(Stylonychia)或豆形虫属(Colpidium)、真菌如被孢霉、虫霉(Entomophthora)和毛霉(Mucor)和/或藓如剑叶藓属(Physcomitrella)、角齿藓属(Ceratodon)及地钱属(Marchantia)(R.Vazhappilly和F.Chen(1998)BotanicaMarina41:553-558;K.Totani和K.Oba(1987)Lipids22:1060-1062;M，Akimoto等，(1998)Appl.BiochemistryandBiotechnology73:269-278)。抹系选择已经引起开发大量的所讨论孩i生物突变林，这些突变林产生一系列所需要的化合物，包括PUFA。然而突变和选择可改善特殊分子如多不饱和脂肪酸产生的林系是费时和困难的过程。这是为什么只要可能就优选如上所述的重组方法的原因。然而借助以上提及的微生物，仅可以产生有限量的所需多不饱和脂肪酸如DPA、EPA或ARA，并且取决于所用的微生物，这些多不饱和脂肪酸通常作为例如EPA、DPA及ARA的脂肪酸混合物得到。将讨论多种用于合成花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的合成途径(图1)。因此，EPA或DHA通过聚酮化合物途径在海洋细菌如弧菌(Vibriosp.)或希瓦氏菌(Shewanellasp.)内产生(Yu，R.等，Lipids35:1061-1064,2000;Takeyama，H.等，Microbiology143:2725-2731,1997)。替代性策略是改变去饱和酶和延长酶的活性(Zank，T.K.等，PlantJournal31:255-268，2002;Sakuradani，E.等，Gene238:445-453，1999)。通itA6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶和A4-去饱和酶对上述途径的修改是哺乳动物内的Sprecher途径(Sprecher2000，Biochim.Bi叩hys.Acta1486:219-231)。在其中，实施又一个延长步骤替代A4去饱和作用以产生C24，随后通过又一个A6-去饱作用及最终的j8-氧化作用产生<:22链长度。称作Sprecher的途径(见图l)并不适于在植物和微生物中的生产，因调节机制未知。如从图l可以看出，较长链的多不饱和脂肪酸如生四烯酸、EPA或特别是DHA(C22:6n-3)的产生除需要去饱和酶之外，还需要使例如在A-9、A-6或A-5位置内具有双鍵的不饱和脂肪酸延长至少2个碳原子的延长酶。根据其功能，区分两种不同类型的延长酶。广泛分布于动物界内的I型延长酶仅有非常低的底物专一性，也就是说它们延长一系列不同的不饱和脂肪酸。n型延长酶的区别在于具有高得多的底物专一性。它们仅转化在特定位置内具有双键的少数脂肪酸。WO2005/012316描述了一些上述去饱和酶和延长酶。具体而言，WO2005/012316首次公开了专一性地延长在A-5位置内具有双键的脂肪酸的n型延长酶。根据去饱和模式，这类多不饱和脂肪酸分成两大类，即w6"脂肪酸或co3-脂肪酸，这些脂肪酸在代谢和功能性活性方面有所差异(图1)。用于代谢途径的原材料是亚油酸(18:2"，12)，而"3途径经亚麻酸(18:3^9，12'15)进行。亚麻酸通过w3-去饱和酶的活性形成(Tocher等，1998,Prog.LipidRes.37，73-117;Domergue等2002,Eur.J.Biochem.269，4105-4113).哺乳动物以及还有人类不具备相应的去饱和酶活性(A12-去饱和酶和w3-去饱和酶)并且必须通过食物摄入这些脂肪酸(必需脂肪酸).从这些前体开始，依次通过去饱和酶反应和延长酶反应合成生理重要的多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA，20:4As，s，"，")(w6-脂肪酸)及两种co3-脂肪酸即二十碳五烯酸(EPA，20:5A5，8，""4，")和二十二碳六烯酸(DHA，22:6A4'7，1。，13，17，19)。"3-月旨肪酸的应用在治疗心血管疾病(Shimikawa2001，WorldRev.Nutr.Diet.88,100-108)、炎症(Calder2002，Proc.Nutr.Soc.61，345画358)和关节炎(Cleland和James2000,J.Rheumatol.27，2305-2307)中显示出如上所述的治疗活性，高等植物包含多不饱和脂肪酸如亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3).ARA、EPA和DHA在全部高等植物的籽油中根本找不到或仅微量存在(E.Ucciani:NouveauDictionnairedesHuilesV6g6tales[NewDictionaryofVegetableoils!.Technique&Documentation-Lavoisier,1995.ISBN:2-7430-0009-0)。然而LCPUFA在高等植物、优选地在油料作物例如欧洲油菜、亚麻、向日葵和大豆中产生是有利的，因为有可能以如此方式经济地获得用于食品工业、动物营养和药用目的大量高品质的LCPUFA。为此，通过重组方法将编码LCPUFA生物合成中酶的基因导入油料作物并且因而在其中表达这些基因是有利的。WO2005/012316描述了此种方法。然而，WO2005/012316中所述途径的缺点是所需脂肪酸的产率仍然太低，以致不能进行工业利用。此夕卜，不仅产生了所需要的脂肪酸如ARA、EPA或DHA，而且不需要的次级反应也产生了进一步降低产率并污染已形成产物的脂肪酸。因而，用于产生多不饱和脂肪酸的有利方法应当尽可能本身综合如下特点用于产生多不饱和脂肪酸的去饱和酶和延长酶的高度专一性，所用去饱和酶和延长酶的高合成率，如果可能，^f5L合成一种多不饱和脂肪酸如ARA、EPA或DHA，多不饱和脂肪酸如ARA、EPA或DHA或其混合物的高产量，不想要的次级产物(如果存在)的量可能最少，不产生非天然脂肪酸，即天然不存在的脂肪酸，有利地仅以甘油三酯方式合成多不饱和脂肪酸。为了实现用这类多不饱和脂肪酸强化食物和/或飼料，因而存在对用于产生尤其在真核细胞系统内产生这类多不饱和脂肪酸的简单、廉价方法的迫切需要。因而，本发明的目的是开发尽可能具有上述有利特点的简单、价廉方法。本目标通过本发明用于在转基因植物内产生具有至少四个双键的多不饱和C20-或C22-脂肪酸的方法来实现，其中所述脂肪酸的含量以重量计占转基因植物甘油三酯总含量的至少15%，所述的方法包括如下方法步骤a)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶和A5-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，或b)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A12-去饱和酶和3-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，或c)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶和A4-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，或d)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和m3-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，和e)得到来自该植物的油和脂。在本发明方法中产生的C加-和<:22-多不饱和脂肪酸有利地包舍至少四个、五个或六个双键。这些脂肪酸特别有利地包含五个或六个双键。饱和脂肪酸通过本方法中所用核酸有利地微小程度转化，或根本不转化。将微小程度应当理解为与多不饱和脂肪酸相比，饱和脂肪酸以少于5%的活性、有利地以少于3%、特别有利地以少于2%、极特别优选地以少于l、0.5、0.25或0.125%的活性进行反应。这些已经产生的脂肪酸可以在本方法中作为单独产物产生或存在于脂肪酸混合物内。用于本发明方法中的核酸序列是编码具有A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5國去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或o3-去炮和酶活性的多肽的分离核酸。有利地用于本发明方法中的核酸序列是编码具有A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或3-去饱和酶活性的多肽的核^f列，其选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25。本方法中产生的具有至少4个双键的多不饱和C20-或C22-脂肪酸特別有利地是花生四烯酸(-ARA)、二十碳五烯酸(=EPA)或二十二碳六烯酸(=DHA)。在本方法的有利实施方案中，具有至少4个双键的多不饱和C2o-或Q2-脂肪^A花生四烯酸。在另一个有利的实施方案，所产生的具有至少4个双键的多不饱和C2。-或C22-脂肪酸是二十碳五蜂酸或二十二碳六烯酸或其混合物。还可以通过本发明方法产生ARA、EPA和DHA的混合物。有利地，基于甘油三酯总含量，在本发明方法中于转基因植物内产生含量以重量计至少15、16、17、18、19或20%、优逸地是25、30、35或40%、特别优选地是45、50、55或60%的花生四烯酸或二十碳五烯酸。在本方法另一个有利的实施方案中，基于甘油三酯总含量，在转基因植物内产生具有含量以重量计至少4、5或6%、有利地具有7、8、9或10%的二十二碳六烯酸。特别有利的是在本发明方法中，基于甘油三酯的总脂肪酸含量，在甘油三酯中应当存在以重量计低于0.5、0.4、0.3、0.2或0.1%、有利地低于0.09、0.08、0.07、0.06或0.05%、特别有利地低于0.04、0.03、0.02或0.01%的选自C22:4A7，10，13，16-、C22:5A4，"W"6-或C22:5A"o'叫6"-脂肪酸的多不饱和脂肪酸。本方法中所产生的多不饱和脂肪酸有利地结合亍三酰甘油内，但是还可以作为游离脂肪酸存在于生物内或还结合于其它脂肪酸酯的形式内。在本上下文中，它们可以作为"纯产物，，存在或还有利地以多种脂肪酸的混合物或不同甘油酯的混合物的形式存在。本发明方法有利地产生具有如此的多不饱和C2。-和/或(:22-脂肪酸分子的脂肪酸酯，其中所述的多不饱和C,和/或C22-脂脉酸分子在脂肪酸酯内具有至少4个双键、有利地在脂肪酸酯内具有至少5个或6个双键。这产生co3-二十碳四烯酸(-ETA，C20:4A5，8，11，14)、花生四埽酸(ARA，C20:4As，8，11，14)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5A5，8，n，14'17)、6-二十二碳五烯酸(C22:5A4，7，1。，13，16)、6-二十二碳四烯酸(C22:4"，m'13，16)、3-二十二碳五烯酸(-DPA，C22:5A7，10，13，16，19)、二十二碳六烯酸(=DHA，C22:6A4，7'10，13，16，19)或优选地产生ARA、EPA和/或DHA的混合物.在本方法特别优选的实施方案中，产生ffl6-脂肪酸，有利地是花生四烯酸.在本方法又一个特別优选的实施方案中，产生3-脂肪酸，如EPA和/或DHA。如上所述，本发明方法特別有利地产生处于甘油三酯内的选自6-二十二碳四烯酸C22:4A7，1。，13，16、co6-二十二碳五烯酸022:5"7'1()，13，16或(03-二十二碳五烯酸C22:5A^，"，"^的多不饱和脂肪酸，其含量以重量计低于甘油三酯的总脂肪酸含量的0.5%。具有多不饱和C2(r和/或C22-脂肪酸分子的脂肪酸酯可以以油或脂的形式分离，例如以化合物如鞘脂类、磷酸甘油酯、脂、糖脂例如糖鞘脂、磷脂例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或双磷脂酰甘油、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或者其它脂肪酸酯如乙酖辅酶A酯的形式，其中所述的脂肪酸酯包含来自用于制备该脂肪酸酯的生物的具有至少四个、五个或六个双键，优选是五个或六个双键的多不饱和脂肪酸；这些脂肪酸酯优选地以其二酰甘油酯、三酰甘油酯和/或以磷脂酰胆碱的形式，特别优选地以三酰甘油酯形式分离。除了这些酯以外，多不饱和脂肪酸也可以作为游离脂肪酸或在其它化合物内结合的脂肪酸存在于生物内，有利*在于植物内。通常上述多种化合物(脂肪酸酯和游离脂肪酸)以如下的大致分布存在于生物内，即以多种化合物的重量总计为100%，甘油三酯占80至90%、甘油二酯占2至5%、甘油一酯占5至10%、游离脂肪酸占1至5°/。、磷脂占2至8%。本发明方法产生LCPUFA，例如以转基因生物内、有利地在转基因植物内的总脂肪酸为基础，所产生的含量以重量计为至少15%、有利地是至少16或17%，优选地是至少18，19或20%，特別优选地是至少21、22、23、24或25%、最优选地是至少26、27、28、29或30°/。的花生四烯酸和二十碳五烯酸.在本上下文中，将存在于宿主生物内的d8-和/或C2Q-脂肪酸转化达至少10%、优选地是至少200/。、特别优选地是至少30%、最优选地是至少40。/。以产生相应产物如ARA、EPA和/或DHA是有利的。这些脂肪酸有利地以结合形式产生，借助本发明方法中所用的核酸，这些不饱和脂肪酸可以有利地定位于已产生甘油三酯的snl、sn2和/或sn3位置内。由于通过本发明方法中的起始化合物亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)开展了多个反应步骤，故本方法的终产物例如花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳五烯酸(DHA)不能作为绝对纯的产物获得；微小痕量的前体总是存在于终产物内。例如若亚油酸和亚麻酸两者均存在于起始生物和起始植物内，则终产物如ARA、EPA或DHA通常作为混合物存在。基于所讨论终产物的量，前体亚油酸和/或亚麻酸应当有利地以重量计不超过20。/。、优选地不超过15%、特别优选地不超过10%，最优选地不超过5%。仅ARA、ARA和EPA、EPA和DHA或者仅DHA(结合的或作为游离酸)有利地因本发明方法而在转基因植物内作为终产物产生.若同时产生化合物ARA、EPA和DHA,则它们有利地以至少1:1:2(EPA:ARA:DHA)、有利地是至少1:1:3、优选地是1:1:4、特别优选是1:1:5的比率产生。若在本方法中产生ARA和EPA，它们有利地以至少5:1到至少1:5的比率产生。若在本方法中产生EPA和DHA，它们有利地以至少5:1到至少1:5的比率产生.由本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含6至15%的棕榈酸、1至6%的硬脂酸、7-85%的油酸、0.5至8%的11-十八碳烯酸、0.1至1%的花生酸、7至25%的饱和脂肪酸、8至85%的单不饱和脂肪酸和60至85%的多不饱和脂肪酸，在所有情况下均基于100°/。并且以生物的总脂肪酸含量为基础，基于总脂肪酸含量，存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合.物内的有利的多不饱和脂肪酸优选地是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1%的花生四烯酸。此外，通过本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含选自芥酸(13-二十二碳烯酸)、苹婆酸(9，10-亚甲基十八碳-9-烯酸)、锦葵酸(8，9-亚甲基十七碳-8-烯酸)、大风子油酸(环戊烯十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-环氧十八碳-9,ll-二蜂酸)、斑鳩菊酸(9，10-环氧十^^-12-烯酸)、塔日酸(6-十^^炔酸)、6-十九碳炔睃、白檀子油酸(反ll誦十A^烯陽9-炔酸)、6，9-十/V^烯炔酸、pyrulicacid(反10-十七烯画8誦炔酸)、crepenyninicacid(9冲八烯-12画炔酸)、13，14-dihydrooropheicacid、十八碳-13-烯-9，ll-二炔酸、伞形花子油酸(顺-6-十八烯酸)、9顺，12反-十八二烯酸、金盞花素酸(8反10反12顺-十八三烯酸)、梓树酸(9反11反13顺-十八三烯酸)、桐油酸(9顺11反13反-十八三烯酸)、兰花酸(8顺10反12顺-十八三烯酸)、石榴酸(9顺11反13顺-十八三烯酸)、parinaricacid(9顺11反13反15顺-十八四烯酸)、皮诺敛酸(全-顺-5，9，12-十八三締酸)、laballenicacid(5，6-十八碳-二烯酸)、荒麻油酸(12-羟油酸)和/或coriolicacid(13-鞋-9顺，ll反-十八二烯酸)的脂肪酸。通常上述脂肪酸有利地仅痕量地存在于本发明方法所产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物内，这就是说，基于总脂肪酸，它们的存在小于30。/。、优选地小于25%、24%、23%、22%或21%、特别优选地低于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%，极其特別优选地小于4%、3%、2%或1%。由本发明方法产生的月旨肪酸酯或脂肪酸混合物，有利地包含(基于总脂肪酸)小于0.1%的丁酸、胆固醇、鲦鱼酸(=二十二碳五烯酸，C22:5A"""")和尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6"，8，12，15，21)或者不包含前述物质.因本发明核酸序列或本方法中所用的核酸序列，当通过GC分析进行比较时，与非转基因植物如拟南芥(arabidopsis)或亚麻、欧洲油菜、大豆或亚麻荠(Camelina)相比可以实现多不饱和脂肪酸产量增加至少50%、有利地是至少80%、特别有利地是至少100%、极其有利地是至少150%。化学纯的多不饱和脂肪酸或脂肪酸组合物还可以通过上述的方法合成。为此目的，脂肪酸或脂肪酸組合物用已知方式如通过提取、蒸馏、结晶、色谱或这些方法的组合从植物中分离。这些化学纯的多不饱和脂肪酸或脂肪酸组合物对于食品工业领域、化妆品领域并且特别对于制药工业领域内的应用是有利的。原则上，适合于本发明方法中生产的生物是全部植物。油料作物植物或有用植物有利地用于本方法中。合适的植物原则上是能够合成脂肪酸的所有植物，如所有双子叶植物或单子叶植物、藻类或藓类.有利的植物选自植物Adelotheciaceae科、漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、风梨科(Bromdiaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Ca加abaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、Crypthecodiniaceae科、葫,科(Cucurbitaceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、柩牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、胡^匕科(Juglandaceae)、摔科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、棵藻科(Euglenaceae)、绿枝藻纲(Prasinophyceae)或蔬菜植物或装饰植物如万寿菊(Tagete)。可以提到的实例是选自如下的植物Adelotheciaceae如剑叶藓属，例如小立碗藓(Physcomitrellapaten)、漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如阿月混子属(Pistaciavera)[阿月混子(pistachio)、芒果(Mangiferindica)[芒果(Mango)l或腰果(Anacardiumoccidentale)[腰果(Cashew)]、菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta属、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如金盏花(Calendulaofficinalis普通金盏花l)、红花(Carthamustinctorius[红花(safflower))、矢车菊(Centaureacyanus[矢车菊(cornflower)])、菊苣(Cichoriumintybus菊苣(chicory)])、洋蓟(Cynarascolymus朝鲜蓟(artichoke)])、向曰葵(Helianthusannus向日葵(sunflower)])、莴苣(Lactucasativa)、Lactucacrispa、宇(Lactucaesculenta)、LactucascariolaL.ssp.Sativa、LactucascariolaL.var.integrata、LactucascariolaL.var.integrifolia、莴苣romana亚种(Lactucasativasubsp.Romana)、Locustacommunis、莴苣翔草(Valerianalocusta[saladvegetables])、香叶万寿菊(Tageteslucida)、万寿菊(Tageteserecta)或细叶万寿菊(Tagetestenuifolia)[非洲或法国万寿菊(Marigold)]、伞形科，如胡萝卜属(Daucus)例如胡萝卜(Daucuscarota[胡萝卜(carrot)])、桦木科如榛属(Corylus)例如欧洲衛Corylusavellana)或土耳其榛(Coryluscolurna榛(hazelnut))、紫草科如玻璃苣属(Borago)例如玻璃苣(Boragoofficinalis[玻璃苣(borage)])、十字花科如芸苔属(Brassica)、亚麻齐属(Camelina)、Melanosinapis属、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青属某些种(Brassicarapassp.欧洲油菜(oilseedrape))、野欧白芥(Sinapisarvensis)、芥菜(Brassicajuncea)、芥菜原变种(Brassicajunceavar.juncea)、坡叶芥莱(Brassicajunceavar.crispifolia)、大叶齐莱(Brassicajunceavar.foliosa)、黑芥菜(Brassicanigra)、Brassicasinapioides、亚麻齐(Camelinasativa)、Melanosinapiscommunis芥菜(mustard)、甘蓝(Brassicaoleracea[饲用甜菜(fodderbeet))或拟南芥(Arabid叩sisthaliana)、风梨科如凤梨属(Anana)、Bromelia属(菠萝(pineapple))例如凤梨(Ananacomosus)、Ananasananas或Bromeliacomosa菠萝(pineapple)、番木瓜科如番木瓜属(Carica)例如番木瓜(Caricapapaya[番木瓜I)、大麻科如大麻属(Cannabis)例如大麻(Cannabissativa[大麻(hemp)l)、旋花科如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)例如甘薯(Ipomoeabatatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoeapandurata)、Convolvulusbatatas、Convolvulustiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoeatiliacea、三裂叶薯(Ipomoeatriloba)或Convolvuluspanduratus[甜薯(sweetpotato)、番薯(batate)、藜^d^甜菜属(Beta)例如甜菜(Betavulgaris)、甜萝卜(Betavulgarisvar.Altissima)、甜菜原变种(Betavulgarisvar.vulgaris)、沿海甜菜(Betamaritima)、Betavulgarisvar.perennis、Betavulgarisvar.conditiva或Betavulgarisvar.esculenta[糖用甜菜(sugarbeet)、Crypthecodiniaceae科如隐甲藻属例如寇氏隐曱藻(Cryptecodiniumcohnii)、葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如夢瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南瓜(Cucurbitamixta)、西葫芦(Cucurbitapepo)或南瓜(Cucurbitamoschata[西葫声(pumpkin)/南瓜(squash)])、桥弯藻科(Cymbellaceae)如双眉藻属(Amphora)、桥弯藻属(Cymbella)、Okedenia属、褐指藻属(Phaeodactylum)、Reimeria属例如三角褐指藻、牛毛藓科(Ditrichaceae)如牛毛藓属(Ditrichaceae)、高地藓属(Astomiopsis)、角齿藓属、Chrysoblastella属、牛毛藓属(Ditrichum)、对叶藓属(Distichium)、Eccremidium属、Lophidion属、Philibertiella属、丛毛蘚属(Pleuridium)、石缝藓属(Saelania)、毛齿藓属(Trichodon)、Skottsbergia属例如Ceratodonantarcticus、Ceratodoncolumbiae、Ceratodonheterophyllus、Ceratodonpurpurascens、角齿藓(Ceratodonpurpureus)、Ceratodonpurpureusssp.convolutus、Ceratodonpurpureusssp.stenocarpus、角齿藓圆叶变种(Ceratodonpurpureusvar.rotundifolius)、Ceratodonratodon、疾蒴角齿藓(Ceratodonstenocarpus)、Chrysoblastellachilensis、Ditrichumambiguum、短齿牛毛藓(Ditrichumbrevisetum)、铍波牛毛藓(Ditrichumcrispatissimum)、巻叶牛毛藓(Ditrichumdifficile)、Ditrichumfalcifolium、扭叶牛毛藓(Ditrichumflexicaule)、Ditrichumgiganteum、牛毛藓(Ditrichumheteromallum)、Ditrichumlineare、Ditrichumlineare、Ditrichummontanum、Ditrichummontamim、黄牛毛藓(Ditrichumpallidum)、Ditrichumpunctulatum、细叶牛毛藓(Ditrichumpusillum)、细叶牛毛藓扭叶变种(Ditrichumpusillumvar.tortile)、Ditrichumrhynchostegium、Ditrichumschimperi、Ditrichumtortile、对叶藓(Distichiumcapillaceum)、'卜对叶藓(Distichiumhagenii)、斜蒴对叶藓(Distichiuminclinatum)、Distichiummacounii、Eccremidiumfloridanum、Eccremidiumwhiteleggei、Lophidionstrictus、尖叶丛毛藓(Pleuridiumacuminatum)、PIeuridJumalternifolium、Pleuridiumholdridgei、Pleuridiummexicanum、Pleuridiumravenelii、丛毛藓(Pleuridiumsubulatum)、石缝藓(Saelaniaglaucescens)、Trichodonborealis、毛齿藓(Trichodoncylindricus)或Trichodoncylindricusvar.oblongus、胡夷页子科如属胡颓子属(Elaeagnus)例如油^b^(01eaeuropaea橄榄(olive))、杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如阔叶山月桂(Kalmialatifolia)、窄叶山月桂(Kalmiaangustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、Kalmiapolifolia、Kalmiaoccidentalis、Cistuschamaerhodendros或Kalmialucida[山月桂(mountainIaurel)、大戟科如木薯属(Manihot)、Janipha属、麻风树属(Jatropha)、蓖麻属(Rkinus)例如木薯(Manihotutilissima)、Janiphamanihot、Jatrophamanihot、Manihotaipil、Manihotdulcis、Manihotmanihot、Manihotmelanobasis、木薯(Manihotesculenta木薯(cassava))或蓖麻(Ricinuscommunis荒麻(CastorOilPlant)])、豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion属、Feuillea属、音加属(Inga)、Pithecolobium属、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、Medicajo属、大豆属(Glycine)、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)例如豌豆(Pisumsativum)、飼料豌豆(Pisumarvense)、Pisumhumile[婉豆(pea)I、Albiziaberteriana、合欢(AIbiziajulibrissin)、阔荚合欢(Albizialebbeck)、Acaciaberteriana、Acacialittoralis、Albiziaberteriana、AIbizziaberteriana、Cathormionberteriana、FeuiHeaberteriana、Ingafragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobiumberterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acaciajulibrissin、Acacianemu、Albizianemu、Feuilleeajulibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosaspeciosa、Sericanrdajulibrissin、Acacialebbeck、Acaciamacrophylla、阔荚合欢(Albizialebbeck)、Feuilleealebbeck、Mimosalebbeck、Mimosaspeciosa[阔叶合欢(siristree)、紫苜稳(Medicagosativa)、野苜蓿(Medicagofalcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)[紫花苜蓿(alfalfa)、大豆(Glycinemax)、Dolichossoja、宽叶蔓豆(Glycinegracilis)、Glycinehispida、Phaseolusmax、Sojahispida或Sojamax[大豆(soybean)]、葫藓科(Funariaceae)如Aphanorrhegma属、Entosthodon属、葫声藓属(Funaria)、剑叶藓属(Physcomitrella)、立碗藓属(Physcomitrium)例如Aphanorrhegmaserratum、Entosthodonattenuatus、Entosthodonbolanderi、Entosthodonbonplandii、Entosthodoncalifornicus、Entosthodondrummondii、Entosthodonjamesonii、Entosthodonleibergii、Entosthodonneoscoticus、Entosthodonrubrisetus、Entosthodonspathulifolius、Entosthodontucsoni、Funariaamericana、Funariabolanderi、齿叶葫,藓(Funariacalcarea)、Funariacalifornica、Funariacalvescens、Funariaconvoluta、Funariaflavicans、Funariagroutiana、葫芦藓(Funariahygrometrica)、Funariahygrometricavar.arctica、葫芦藓暖地变种(Funariahygrometricavar.Calvescens)、Funariahygrometricavar.convoluta、Funariahygrometricavar.muralis、Funariahygrometricavar.utahensis、小口葫声藓(Funariamicrostoma)*Funariamicrostomavar,obtusifolia、刺边葫芦藓(Funariamuhlenbergii)、Funariaorcuttii、Funariaplano画convexa、Funariapolaris、Funariaravenelii、Funariarubriseta、Funariaserrata、Funariasonorae、Funariasublimbatus、Funariatucsoni、Physcomitrellacalifornica、小立碗藓、Physcomitrellareaderi、Physcomitriumaustrale、加利福尼亚立碗藓(Physcomitriumcalifornicum)、Physcomitriumcollenchymatum、Physcomitriumcoloradense、Physcomitriumcupuliferum、Physcomitriumdrumniondii、红蒴立碗藓(Physcomitriumeurystomum)、Physcomitriumflexifolium、Physcomitriumhookeri、Physcomitriumhookerivar.serratum、隐蒴立碗藓(Physcomitriumimmersum)、Physcomitriumkellermanii、Physcomitriummegalocarpum、梨蒴立碗藓(Physcomitriumpyriforme)、Physcomitriumpyriformevar.serratum、Physcomitriumrufipes、Physcomitriumsandbergii、Physcomitriumsubsphaericum、华盛顿立碗藓(Physcomitriumwashingtoniense)、继牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum属例如椰子(Cocosnucifera)、茶蒸子天兰葵(Pelargoniumgrossularioides)或Oleumcocois椰子coconut])、禾本科如甘蔗属(Sacchar鹏)例如甘蔗(Saccharumofficinarum)、胡桃科如胡书&属(Juglans)、Wallia属例如核桃(Juglansregia)、台湾胡杉&(Juglansailanthifolia)、山核桃(Juglanssieboldiana)、灰核杉匕(Juglanscinerea)、Walliacinerea、Juglansbixbyi、加州黑核杉匕(Juglanscalifornica)、印度黑核杉&(Juglanshindsii)、Juglansintermedia、Juglansjamaicensis、大核桃(Juglansmajor)、小果黑核(Juglansmicrocarpa)、黑核书匕(Juglansnigra)或胡杉匕Wallianigra胡书匕(walnut)、樟科如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)例如月桂(Laurusnobilis)月桂(bay)]、絝梨(Perseaamericana)、食物聘梨(Perseagratissima)或Perseapersea转梨(avocado)]、豆科如落花生属(Arachis)例如花生(Arachishypogaea)I花生(peanut)、亚麻科如Adenolinum属例如亚麻(Linumusitatissimum)、Linumhumile、奥地利亚麻(Linumaustriacum)、Linumbienne、窄叶亚麻(Linumangustifolium)、筠亚麻(Linumcatharticum)、金黄亚麻(Linumflavum)、大花亚麻(Linumgrandiflorum)、Adenolinumgrandiflorum、刘易斯亚麻(Linumlewisii)、那旁亚麻(Linumnarbonense)、宿根亚麻(Linumperenne)、Linumperennevar.lewisii、Linumpratense或Linumtrigynum亚麻籽(linseed)、千屈菜科(Lythrarieae)如石榴属(Punica)例如石榴(Punicagranatum)[石榴(pomegranate)]、4帛葵科(Malvaceae)如棉属(Gossypium)例如陆地棉(Gossypiumhirsutum)、树棉(Gossypiumarboreum)、海島棉(Gossypiumbarbadense)、草沖帛(Gossypiumherbaceum)或瑟伯氏4帛(Gossypiumthurberi)[棉花(cotton)、地钱科(Marchantiaceae)如地钱属(Marchantia)食J:ft口Marchantiaberteroana、Marchantiafoliacea、Marchantiamacropora、芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如香蕉(Musanana)、小果野蕉(Musaacuminata),粉芭蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉属的某些种(Musaspp.)[香蕉(banana)、柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia属、月见草属(Oenothera)例如Oenotherabiennis或Camissoniabrevipes[月见草(eveningprimrose)]、棕榈科(Palmae)如油棕属(Elaeis)例如油棕(Elaeisguineensis)油棕榈树(oilplam)、罂粟科(Papaveraceae)如罌粟属(Papaver)例如鬼婆粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、Papaverdubium罌粟(poppy)I、胡麻科(PedaHaceae)如胡麻属(Sesamum)例如胡麻(Sesamumindicum)[^J^(sesame)、胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe属、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia属例如Piperaduncum、Piperamalago、狭叶胡椒(Piperangustifolium)、奥勒图树胡椒(Piperauritum)、萎叶(Piperbetel)、荜澄茄(Pipercubeba)、长胡椒(Piperlongum)、胡椒(Pipernigrum)、假荜拔(Piperretrofractum)、Artantheadunca、Artanthedongata、Peperomiaelongata、Piperelongatum、Steffensiaelongata辣椒(Cayennepepper)、禾本科(Poaceae)如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高梁属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea(maize))、小麦属(Triticum)例如大麦(Hordeumvulgare)、芒颖大麦草(Hordeumjubatum)、海滨大麦(Hordeummurinum)、野芒大麦草(Hordeumsecalinum)、二棱大麦(Hordeumdistichon)、Hordeumaegiceras、六棱大麦(Hordeumhexastichon)、Hordeumhexastichum、Hordeumirregulare、大麦(Hordeumsativum)、野芒大麦草(Hordeumsecalinum)大麦(barley)、黑麦(Secalecereale)黑麦(rye)、燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、野燕麦原变种(Avenafatuavar.sativa)、杂种燕麦(Avenahybrida)[燕麦(oat)、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、石茅高梁(Sorghumhalepense)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、蜀黍(Sorghumvulgare)、Andropogondmm咖iidii、Holcusbicolor、Holcussorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghumarundinaceum、卡佛尔高梁(Sorghumcaffrorum)、垂穗高梁草(Sorghumcernuum)、Sorghumdochna、Sorghumdrummondii、硬高梁草(Sorghumdurra)、Sorghumguineense、Sorghumlanceolatum、多脉高梁草(Sorghumnervosum)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、Sorghumsubglabrescens、Sorghumverticilliflorum、蜀黍(Sorghumvulgare)、石茅高梁(Holcushalepensis)、Sorghummiliaceum、Panicummilitaceum[稷(millet)、稻(Oryzasativa)、阔叶野生稻(Oryzalatifolia)[稻(rice)、玉蜀黍(Zeamays)[玉米(maize)]、普通小麦(Triticumaestivum)、多更粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticumhybernum、玛卡小麦(Triticummacha)、普通小麦(Triticumsativum或Triticumvulgare)[小麦(wheat)、紫球藻科(Porphyridiaceae)如Chroothece属、Flintiella属、Petrovanella属、紫球藻属(Poiphyridium)、Rhodella属、Rhodosorus属、Vanhoeffenia属例如紫球藻(Porphyridiumcrue幽m)、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果属(Macadamia)例如全缘叶澳洲坚果(Macadamiaintergrifolia)澳大利亚坚果(macadamia)、绿4支藻纲如肾藻属(Nephroselmis)、Prasinococcus属、Scherffelia属、Tetraselmis属、Mantonidla属、Ostreococcus属例如绿肾藻(Nephroselmisolivacea)、Prasinococcuscapsulatus、Scherffeliadubia、Tetraselmischui、四肩突四鞭藻(Tetraselmissuecica)、Mantoniellasquamata、Ostreococcustauri属和种、萏草科(Rubiaceae)如咖啡属(Coffea)例如咖啡属某些种(Coffeaspp)、小果粒咖啡(Coffeaarabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffealiberica)[咖啡(coffee)、玄参科(Scrophulariaceae)如毛蕊花属(Verbascum)例如毛瓣毛蕊花(Verbascumblattaria)、东方毛蕊花(Verbascumchaixii)、Verbascumdensiflorum、Verbascumlagurus、Verbascumlongifolium、剪秋罗毛蔬花(Verbascumlychnitis)、Verbascumnigrum、奥林匹克毛蔬花(Verbascumolympicum)、Verbascumphlomoides、紫毛蔬花(Verbascumphoenicum)、Verbascumpulverulentum或毛蔬花(Verbascumthapsus)[毛荡花(verbascum)、痴科(Solanaceae):ft口辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、痴属(Solanum)、番莊属(Lycopersicon)例如辣椒(Capsicumannuum)、辣椒glabriusculum变种(Capsicumannuumvar.glabriusculum)、小米辣(Capsicumfrutescens)[胡椒(pepper)、辣椒(Capsicumannuum)[红辣椒(paprika)、烟草(Nicotianatabacum)、花烟草(Nicotianaalata)、Nicotianaattenuata、光烟草(Nicotianaglauca)、Nicotianalangsdorffii、Nicotianaobtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、波叶烟草(Nicotianarepanda)、黄花烟草(Nicotianarustica)、林生烟草(Nicotianasylvestris)[烟草(tobacco)、马铃薯(SoIanumtuberosum[马铃薯(potato)I)、痴(Solanummelongena)[蒜(eggplant)l、番痴(Lycopersiconesculentum)、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersiconpyriforme、红茶(SoIanumintegrifolium)或番茶(Solanumlycopersicum)[西红神(tomato)]、梧桐科(Sterculiaceae)如可可树属(Theobroma)例如可可树(Theobromacacao)[可可(cacao)或山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如茶(Camelliasinensis)[tea(茶)。在本发明方法中应用转基因植物如双子叶植物或单子叶植物。在本发明方法中特别有利地进行利用的转基因植物是包舍大量脂化合物的油料作物植物，如花生、欧洲油菜、油菜(canola)、向日葵、红花(Carthamustinctoria)、翼粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花、石榴、月见草、毛蕊花、蓟(thistle)、野玫瑰(wHdroses)、榛、扁桃(almond)、澳洲坚果、鲟梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻、大豆、阿月混子、玻璃苣、树(油棕、椰子或核桃)或耕作作物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦(triticale)、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊、茄科植物例如马铃薯、烟草、茄子和番茄、蚕豆属(Vicia)物种、豌豆、紫花苜蓿或灌木(咖啡、可可、茶)、柳属(Salix)物种。根据本发明的优选植物是油料作物植物如花生、欧洲油菜、油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、W、蓖麻、絲、金盏花、石榴、月见草、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、玻璃苣、树(油棕、可可)。尤其优选含有较高C18:2和/或C18:3脂肪酸的植物，如向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫芦/南瓜、罂粟、月见草、核桃、亚麻子、大麻或蓟.极特别优选的植物是例如红花、向日葵、罂粟、月见草、核桃、亚麻子或大麻。原则上，在用于产生多不饱和脂肪酸的本方法中可以4吏用脂肪酸或脂代谢的全部基因，有利地是与A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶组合为了本发明目的，将复数形式理解为包含单数或反之亦然。选自6L&辅酶A脱氢酶、酰基-ACP[酰基栽体蛋白去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-辅酶A:溶血磷脂耽基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基-辅酶A羧化酶、酰基-辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延长酶的脂肪酸或脂代谢的基因有利地与A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或(D3-去饱和酶组合地加以使用，有可能施用单个基因或组合的多个基因.除了为本发明方法中所用A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和ro3-去饱和酶在生物中直接产生起始脂肪酸之外，脂肪酸还能自外部添加。因为经济原因优选在生物内产生。优选的底物是亚油酸(C18:2"")和/或y-亚麻酸(C18:3A6，9，12)。为了在以上用于产生具有有利提高含量的多不饱和脂肪酸的油和/或甘油三酯的方法内增加产量，增加用于合成脂肪酸的起始产物的量是有利的；这可以例如通过将编码具有A12-去饱和酶活性的多肽的核酸导入生物得以实现。本发明方法中所用的A12-去饱和酶有利地将油酸(C18:l^)转化成亚油酸(C18:2A"2)或将<:18:2"，9转化成C18:3A6，9，12(=GLA)。这提供增加的用于合成多不饱和脂肪酸的原材料亚油酸(C18:2"")和Y-亚麻酸(C18:3A6，9，12)。这特别在产油生物如在来自具有较高油酸的十字花科如芸苔属，例如欧洲油菜；胡颓子科如胡颓子属，例如油橄榄，或豆科如大豆属，例如大豆的那些生物内是有利的。因为这些生物仅有较低的亚油酸(Mikoklajczak等，JournaloftheAmericanoilsChemicalSociety,38，1961，678-681)，利用以上提及的用来产生原材料亚油酸的A12-去饱和酶是有利的。本发明方法中所用的核酸有利地衍生自植物，如藻，例如绿枝藻纲如异毛藻属(Heteromastix)、Mammella属、Mantoniella属、微单胞藻属(Micromonas)、肾藻属(Nephroselmis)、Ostreococcus属、绿枝藻属(Prasinocladus)、Prasinococcus属、Pseudoscourfielda属、Pycnococcus属、塔胞藻属(Pyramimonas)、Scherffelia属、Tetraselmis属，例如Heteromastixlongifillis、Mamiellagilva、Mantoniellasquamata、Micromonaspusilla、绿肾藻(Nephroselmisolivacea)、Nephroselmispyriformis、Nephroselmisrotunda、Ostreococcustauri、Ostreococcussp.、Prasinodadusascus、绿枝藻(Prasinodaduslubricus)、Pycnococcusprovasolii、Pyramimonasamylifera、Pyramimonasdisomata、Pyrami咖nasobovata、Pyramimonasorientalis、Pyramimonasparkeae、Pyramimonasspinifera、Pyramimonassp.、Tetraselmisapiculata、Tetraselmiscarteriaformis、Tetraselmischui、Tetraselmisconvolutae、Tetraselmisdesikacharyi、Tetraselmisgracilis、Tetraselmishazeni、Tetraselmisimpellueida、Tetraselmisinconspkua、Tetraselmislevis、Tetraselmismaculata、Tetraselmismarina、Tetraselmisstriata、Tetraselmissubcordiformis、Tetraselmissuecica、Tetraselmistetrabrachia、Tetraselmistetrathele、Tetraselmisverrucosa、Tetraselmisverrucosafo.Rubens或Tetraselmissp.。所用的核酸有利地衍生自Ostreococcus属的藻。其它有利的生物是珪藻，如脊涟藻(Thalassiosira)或褐指藻或破嚢壶菌或真菌如破嚢壶菌或疫霉(Phyt叩hthora)。多肽。这些序列单独地或与编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或to3-去饱和酶的核酸序列组合地克隆至表ii^建体内，并用于导入植物及在其中表达.由于它们的构建，这些表达构建体使本发明方法中所产生多不饱和脂肪酸的有利优化合成变得可能.在优选的实施方案中，本方法还包括获得包含本方法中所用核酸序列的细胞或完整生物的步骤，其中细胞和/或生物用編码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或3-去饱和酶的本发明核酸序列、如下所述的基因构建体或载体，单独地或与编码脂肪酸代谢或脂代谢蛋白质的额外的核酸组合转化.在更优选的实施方案中，此方法还包括从细胞或植物得到油、脂或游离脂肪酸的步骤.的温室生长或田间生长培养形式.所产生的细胞和植物因而有利地是产油生物(如油料作物，例如花生、欧洲油菜、油菜、亚麻籽、；^、花生、大豆、红花、大麻、向日葵或玻璃苣)的细胞，在植物细胞、植物组织或植物器官的情况下，将"生长"理解为意指例如在营^养基内或其表面培养、或完整植物在基质上或在其中的培养，例如在水培养、盆栽培养料内或在可耕地上栽培。为本发明的目的，"转基因的"或"重组的"就此而言意指例如核酸序列、包含本发明核酸序列的表达盒(=基因构建体)或载体或用本发明的核列、表达盒或栽体转化的生物，前述这些均通过重组方法产生，在其中a)本发明的核^f列，或b)可有效地连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或c)(a)和(b)没有处于它们天然的遗传环境内或已经通过重组方法进行修饰，修饰可能采取例如取代、增加、删除、倒置或插入一个或多.个核香残基的形式。将天然遗传环境理解为意指原始生物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库内。在基因组文库的例子中，优选保留、至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。该环境位于核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp、优选地是至少500bp、特别优选地是至少1000bp、最优选地是至少5000bp序列长度。当天然存在的表达盒(例如本发明核酸序列的天然启动子与相应A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或o)3-去饱和酶天然存在的组合)受到非天然的Ait("人工")方法例如通过诱变性处理修饰时，该表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述于例如美国5.565.350或WO001/15815,因此为本发明目的，将转基植物理解为如上意指本方法中所用的核酸没有处在植物基因组内它们的天然位点里，这些核酸有可能得以同源表达或异源表达。然而如所提及，转基因也意指即便本发明的核酸处于植物基因組内它们的天然位置里，此序列就天然序列而言已经受到l务饰，和/或天然序列的调节序列已经受到<务饰。将转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组非天然位点内的表达，即同源或优选地异源的核^达发生。原则上，用于本发明方法中所用核酸、表达盒或栽体的宿主生物有利地是能够合成脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸和/或适用于表达重组基因的全部生物。可能提到实例是植物如拟南芥、菊科植物例如金盏花或作物植物如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉、亚麻(flax)、欧洲油菜、椰子、油棕、红花或可可豆。优选的植物是天然能够合成大量油的植物，如大豆、欧洲油菜、椰子、油棕、红花、亚麻、W、荒麻、金盏花、花生、可可豆或向日葵。用于本发明目的的植物包括所有表型形式的植物细胞和某些植物组织、器官和部分，如花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、可繁殖组织和细胞培养物，其它衍生自实际转基因植物和/或可用于产生转基因植物，包含在本发明方法中合成的多不饱和脂肪酸的转基因植物能够有利地直接进行销售而没有任何必要对已合成的油、脂或脂肪睃进行分离。本发明方法的植物如下所列完整植物和所有植物部分、植物器官或植物部分如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、可繁殖组织和细胞培养物，它们衍生自实际转基因植物和/或可用于产生转基因植物.在本上下文中，种子包含种子的所有部分，如种皮、表皮细胞、种子细胞、胚乳或胚胎组织。本发明方法中所产生的化合物还可以从生物、优选从植物中以它们的油、脂肪、脂和/或游离脂肪酸形式分离。通过此方法产生的多不饱和脂肪酸可通过收获生物从生物在其中生长的培养物中或从田野收获生物而得到。这可通过压榨和提取植物部分，优选植物种子得以实现。在本上下文中，油、脂肪、脂和/或游离脂肪酸通过已知的冷打或冷压工艺得到获得，无需加热。为了更轻松地将植物部分(特別是植物种子)分散，可以先前将其l^碎、蒸或烤.然后，将已经以该方式进行预处理的种子压榨或者用溶剂(如温己烷)提取.随后去除溶剂。以该方式，可以分离本发明方法所产生的化合物的96%以上。此后，将所得到的产物进一步加工，即精炼。在该过程中，首先去除一些物质，如植物黏液和悬浮物质.通过添加酸(例如磷酸)会在酶学或者或化学-物理学上影响脱泥。此后用碱例如氢氧化钠溶液处理去除游离脂肪酸。得到的产物用水彻底洗涤以去除残留于产物内的碱，然后干燥。为除去残留于产物内的色素，使产物接受漂白处理，例如使用漂白土(filler，searth)或活性碳。最后使产物除臭，例如利用蒸汽。本发明的一个实施方案是油、脂、脂肪酸和/或脂肪酸组合物在祠料、食品、化妆品或药品中的用途，其中所述的油、脂、脂肪酸和/或脂肪^M合物已通过本发明的方法产生或通过将这些油、脂和/或脂肪酸与动物的、微生物的或植物的油、脂或脂肪酸混合而产生。本发明方法所产生的油、脂、脂肪酸或脂肪酸混合物可以按照技术人员熟悉的用于与其它动物源的油、脂类、脂肪酸或脂肪酸混合物例如鱼油混合的方式进行使用。将术语"油"、"脂"或"脂肪"理解为意指包含不饱和、饱和，优选地是酯化的、有利地结合于甘油三酯内的脂肪酸的脂肪酸混合物。油、脂或脂肪优选地具有较高游离多不饱和的脂肪酸或有利地是酯化的多不饱和脂肪酸，特别是亚油酸、Y-亚麻酸、二高T"亚麻酸、花生四烯酸、a-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸，特别有利地是花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。酯化的不饱和脂肪酸的量优选地等于大约30%，更有选含量50%，甚至更优选60%、70%、80。/。或更高含量。为了分析，例如可以在将脂肪酸经转酯作用转化成甲基酯后通过气相色谱测定脂肪酸含量。油、脂或脂肪可以包含多种其它的饱和或不饱和脂肪酸，例如金盏花素酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸等.油或脂内的多种脂肪酸的含量可以变化，尤其取决于起始生物.如上所述，本方法中产生的有利地具有至少4个双键的多不饱和脂肪^A例如鞘氨脂、磷酸甘油酯、月旨、糖脂、磷脂、单酰甘油、二酰甘油、三酰基甘油或其它脂肪酸酯，优选三酰甘油酯。从已于本发明方法中制备的有利地具有至少5个或6个双键的多不饱和脂肪酸开始，已存在的多不饱和脂肪酸可以例如经碱如液体KOH或NaOH处理或者酸水解(有利地在醇例如甲醇或乙醇存在下)处理，或经酶切割释放，并且经例如相分离及随后经例如H2S04酸化作用进行分离。脂肪酸还可以无需上述加工步骤而直接释放。在导入生物、有利地导入植物细胞或植物后，本方法中所用的核酸可以存在于独立的质粒内或有利地整合至宿主细胞基因组内.在整合至基因组内的情况下，整合可以是随机的，或通过重组作用实现以至导入的拷贝取代原有基因，因而对细胞产生所需化合物加以调节，或通过反式利用基因，以至基因与这样的功能性表达单元有效地连接，所述功能性表达单元包含确保基因表达的至少一种序列和确保已进行功能性转录的基因发生多聚腺苷酸化的至少一种序列。核酸有利地经用于多重平行表达的多重表达盒或构建体导入生物，有利地导入用于基因发生种子特异性多重平行表达的植物。藓类和藻类是唯一已知可产生大量多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的植物系统。藓在膜脂内包含PUFA，而藻类、与藻类有关的生物及少数真菌也在三酰甘油级分内聚集大量PUFA。这是为什么从PUFA聚集于三酰甘油级分内的株系中分离的核酸分子是对本发明方法并且因而对修饰宿主内的脂和PUFA生产系统特别有利的原因，其中所述的宿主特别是植物，如油料作物植物，例如欧洲油菜、油菜、亚麻、大麻、大豆、向日葵和玻璃苣。所述核酸分子因此可以有利地用于本发明方法，有利地适合于用于本发明方法中并编码具有A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶活性的多肽的核酸和/或所用其它核酸的底物有利地是<:16-、C『或C加-月旨肪酸，其中所述的其它核酸例如编码选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP[酰基载体蛋白l去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、脂肪酸跣基转移酶、酰基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延长酶的脂肪酸代谢或脂代谢中的多肽.在本方法中作为底物转化的脂肪酸优选地以它们的酰基辅酶A酯和/或其磷脂形式进行转化。为产生本发明的长链PUFA，多不饱和的ds-脂肪酸首先必须通过去饱和酶的酶活性进行去饱和并且依次通过延长酶延长至少两个碳原子。在一次延长循环后，延长酶酶活性产生C2Q-脂肪酸并且在两轮延长循环后产生<:22-脂肪酸。本发明方法中所用去饱和酶^J^长酶的活性优选地产生在脂肪酸分子内具有至少4个双键的C20-和/或C22-脂肪酸，优选地产生具有至少4个双键的C2o-脂肪酸，特别优选地产生在分子内具有至少5个或6个双键、极特別优选地具有6个双鍵的C2。-和/或C22-脂肪酸。尤其优选的本发明方法的产物是花生四烯酸、二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。在脂肪酸内具有至少4个双键的C20-和/或C22-脂肪酸可以以游离脂肪酸形式或以酯形式，如磷脂类、糖脂类、鞘氨脂类、磷酸甘油酯、单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油，通过本发明的酶活性进行延长。有利使用的植物中脂肪酸、油、脂或脂肪的优选生物合成部位通常例如是种子或种子的细胞层，以致使本方法中所用核酸的种子特异性表达成为可能。不过，显而易见的;U旨肪酸、油或脂的生物合成不必限制在种子组织内，同时也可以以组织特异性方式在全部的其它植物部分例如表皮细胞内或块茎内发生。由于利用编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A12-去饱和酶和Q)3-去饱和酶的本发明核酸，因此与未重组地^^有该核酸的野生型植物相比，本方法中产生的多不饱和脂肪酸可以增加至少5%，优选地至少10%，特別优选地至少20%，极特别优选地至少50%。原则上，由本发明方法产生的多不饱和脂肪酸可以在本方法所用的植物内以两种不同途径增加。有利地，通过本方法产生的游离多不饱和脂肪^及酯化的多不饱和脂肪酸的含量可以得到扩充，有利地，转基因植物内酯化的多不饱和脂肪酸库可以通过本发明方法扩充。本方法中所得到的脂肪酸也适合作为原材料用于化学合成其它有价值的产物。它们例如可单独或彼此组合地用于产生药物、食品原料、动物饲料或化妆品。本发明还涉及编码具有A6-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选白a)具有SEQIDNO:l所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:2所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:l所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:2在氨基酸水平具有至少70。/。同一性并具有A6-去饱和酶活性的多肽。本发明还涉及编码具有A6-延长酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示序列的核M列，b)编码具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示核紗列的衍生物，其编码与SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8在氨基酸水平具有至少70%同一性并具有A6-延长酶活性的多肽。本发明还涉及编码具有A5-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选白a)具有SEQIDNO:9所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:10所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:9所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:10在氨基酸水平具有至少40。/。同一性并具有A5-去饱和酶活性的多肽。本发明还涉及编码具有co3-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:23所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:24所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNOJ3所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:24在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有3-去饱和酶活性的多肽。本发明还涉及编码具有A12-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:25所示序列的核酸序列，或b)编码具有SEQIDNO:26所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:25所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:26在氨基酸水平具有至少40。/。同一性并具有A12-去饱和酶活性的多肽。本发明还涉及包含本发明核酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的基因构建体，其中核酸有效地与一种或多种调节信号连接。此外，基因构建体内还可以存在选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP[酕基栽体蛋白去饱和酶、酰基-ACP石克酯酶、脂肪酸g转移酶、酰基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三跣甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪fcl长酶的脂肪酸或脂代谢中的其它生物合成基因。有利地，还存在选自A4-去饱和酶、A8-去饱和酶、A9-延长酶或A5-延长酶的脂肪酸代谢或脂代谢中的生物合成基因。物。核酸序列优选地衍生自藻类如Ostreococcus、真菌如疫霉或者衍生自珪藻，如海链藻.编码具有A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶活性的蛋白质的本发明方法中所用核酸序列单独地、优选地是与使核酸在植物中表达成为可能的表达盒(=核酸构建体)组合地进行有利导入。核酸构建体可以包含多于一种的产生酶活性如A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶酶活性的核酸序列，为导入本方法中所用的核酸，核酸有利地以已知方式进行扩增和连接。优选地遵循了按照PfuDNA聚合酶或Pfu/Taq聚合酶混合物方案的方法。考虑待扩增序列来选择引物。应当以如此方式有利地选棒引物以便扩增物包>^从起始密码子至终止密码子的完整编码序列。扩增物可在扩增后方便地得到分析。例如可以实施凝胶电泳分离，然后是定量分析和定性分析。此后扩增物可按照标准方案(如Qiegen)进行纯化。随后純化的扩增物的等分试样可用于随后的克隆步骤.合适的克隆栽体通常是技术人员已知的。这类载体尤其包括能够在微生物系统中复制的那些栽体，即确保在酵母或真菌中有效克隆和有可能稳定转化植物的那些主要载体.必须特别提及的那些栽体是适用于T-DNA介导转化的多种双元载体系统及共整合栽体系统。通常，此类载体系统的特征是它们至少包含农杆菌(Agrobacterium)介导转化所需的vir基因及T-DNA界定序列(T-DNA边界)。这些载体系统还有利地包含其它顺式调节区域，如启动子和终止子序列和/或选择标记，其中通过所述的选择标记可以鉴定适宜转化的生物。在共整合栽体系统实例中，在同一载体内安置vir基因和T-DNA序列，而双元系统至少以两个栽体为基础，其中一个载体携带vir基因而无T-DNA，而第二个栽体携带T-DNA而无vir基因。因此携带T-DNA而无vir基因的载体相对较小，容易在大肠杆菌(E.coli)及农杆菌内操作和复制。这类双元栽体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明，优选使用Binl9、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。双元栽体及其用途的综述可在Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446~451内找到。为制备栽体，栽体首先用限制性核酸内切酶线性化并且随后按照合适方式进行酶学修饰.此后纯化栽体，并且将其等分试样用于克隆步骤。在克隆步骤中，使用连接酶将经酶切割并根据需要经纯化的扩增物与以类似方式制备的载体片段进行克隆。在本上下文中，特定的核酸构建体、或栽体或质粒构建体可能具有一个或多于一个的编码性基因片段.这些构建体内的编码性基因片段优选地与调节性序列有效连接.调节性序列尤其包括植物序列，如上述的启动子及终止子序列。构建体可以在选择性条件下有利地稳定在微生物内、特别是在大肠杆菌和根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)内增殖，并且有可能将异源DNA转移至植物或微生物内.本方法中所用的核酸、本发明的核酸和核酸构建体可以有利地使用克隆栽体导入生物如微生物或有利地导入植物内，并且因而用于植物的转化，如在PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida),第6/7章，笫71-119页(1993);F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;在TransgenicPlants内，第1巻，EngineeringandUtilization,编者Kung和R.Wu，AcademicPress,1993，15-38;B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,在TransgenicPlants内,第1巻,EngineeringandUtilization,编者Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-143;Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225中发表并引用的那些植物，因此本方法中所用的核酸、本发明核酸和核酸构建体和/或栽体可用于重组地修饰类型广泛的生物、有利地是植物，以便所述植物变成为更好和/或更高效的PUFA生产者。存在一系列可以i多饰A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A12-去饱和酶和co3-去饱和酶蛋白质和本方法中所用其它蛋白质如A5-延长酶或A4-去饱和酶蛋白质的机制，因此在植物中、优选地是油料作物植物中多不饱和脂肪酸的产量、产生和/或产生效率可以因这种改良的蛋白质而有利的受到直接影响。可以增加A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和ro3-去饱和酶蛋白质或基因的量或活性，因此产生量更多的基因产物，并最终产生更大量的本发明方法中所产生的具有至少4个双键的多不饱和脂肪酸。也有可能是在导入相应基因前缺乏化合物的生物合成活性及能力的植物内的从头(denovo)合成。这类似地应用其它去饱和酶或延长酶或脂肪酸和脂类代谢中的其它酶的组合。利用多种趋异性序列即在DNA序列水平上不同的序列在本文内也是有利的，或者用于基因表达的启动子的利用在本文中也是有利的，其中所述的启动子有可能引起随时间过程而不同的基因表达，例如作为种子或贮油组织的成熟程度函数。由于A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或a3-去饱和酶基因单独地或与细胞中其它基因组合地导入植物，故不仅有可能增加朝向终产物的生物合成流，而且还有可能增加或从头合成产生相应的三酰甘油组合物。类似地，可增加其它基因的数量或活性，其中所述的其它基因参与输入一种或多种脂肪酸、油、极性和/或中性脂的生物合成所需要的营养素，因此也可以增加细胞内或贮存区室内这些前体、辅助因子或中间体的浓度，由此细胞产生PUFA的能力可如以下所述进一步增强。通过优化参与生物合成这些化合物的一种或多种A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或Q)3-去饱和酶基因活性或增加其数量，或通过破坏涉及降解这些化合物的一种或多种基因，有可能强化植物中的脂肪酸和脂类分子的产量、生产和/或生产效率。本发明方法中所用的分离的核酸分子编码了蛋白质或其部分，其中所述蛋白质或单个蛋白质或其部分包含如此的氨基酸序列，其与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQID脆24或SEQIDNO:26中所示^J^酸序列具有足够同源性，以致于这些蛋白质或其部分保留A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或Q)3-去饱和酶的活性。由该核酸分子编码的蛋白质或其部分优选地保留它们参与代谢在植物中为合成细胞膜或脂肪体所需要的化合物、或参与分子跨越这些膜转运的基本酶活性及能力。这些核酸分子编码的蛋白质有利地与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26中所示M酸序列具有至少大约40%、优选地是至少大约50%或60%和更优选地是至少大约70%、80%或90%和最优选地是至少大约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98°/。、99%或更高的同一性.为了本发明目的，将同源性或同源的分别理解为意指同一性或同一的.同源性在覆盖4^PJL&,列或核^列区域进行计算。技术人员可获得基于用来比较多种序列的多种算法的一系列程序。这里Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法产生特别可靠的结果。包含于GCG软件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison，Wisconsin,USA53711(1991)内的PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989:151—153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.MoLBiol.48;443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))用于序列比对.如上表示为百分数的序列同源性数值使用GAP程序和如下设皇在全长序列区域范围内测定缺口权重50，长度权重3，平均配对10.000和平均错配0.000。除非另外说明，否则这些设置总是作为标准设置用于序列比对。将本发明方法中所用A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或to3-去饱和酶的基本酶活性理解为意指与由序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25及其衍生物所编码的蛋白质/酶相比，这些酶保留至少10%，优选地是20%，特别优选地是30%并且极特别地是40%酶活性并且因而可参与代谢在植物或植物细胞中为合成脂肪酸、脂肪酸酯如二酰甘油酯和/或三酰甘油酯所需要的化合物，或参与分子跨膜转运，即在脂肪酸分子中至少四、五或六处位置上具有双键的C2Q-或C22-碳链。有利地用于本方法中的核酸可衍生自细菌、真菌、硅藻、动物如新杆属(Caenorhabditis)或大^^合鱼属(Oncorhynchus)，或者植物如藻或者藓，如希瓦氏菌属(Shewanella)、剑叶藓属、破囊壶菌、镰孢霉属(Fusarium)、疫霉属、角齿藓属、Mantoniella属、Ostreococcus属、等鞭金藻属(Isochrysis)、网孢盘菌属(Aleurita)、Muscarioides属、被孢霉属、玻璃苣属、褐指藻属、隐甲藻属，特别是来自硬头鳟(Oncorhynchusmykiss)、假矮海链藻(Thalassiosirapseudonona)、Mantoniellasquamata、Ostreococcussp.、Ostreococcustauri、细小棵藻(Euglenagracilis)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)、大豆疫霉、禾本^H^孢(Fusariumgraminaeum)、寇氏隐甲藻、角齿藓、绿光等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、Aleuritafarinosa、破嚢壶菌某种(Thraustochytrhimsp.)、Muscarioidesviallii、高山被孢霉(MortierelIaalpina)、玻璃苣、三角褐指藻、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)，或特别有利地来自硬头鳟、假矮海链藻或寇氏隐甲藻。备选地，可以在本发明方法中使用如此的核苷酸序列，其编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶并且在严4^件下有利地与如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示核苷酸序列杂交。中表达成为可能的表达盒。为此目的，编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶的核酸序列有效地与一种或多种有利地用于增强基因表达的调节信号连接。这些调节序列将可能使基因和蛋白质特异性地表达。取决于宿主生物，这可以意味着例如基因^诱导后才表达和/或过量表达，或立即表达和/或过量表达。例如这些除这些新的调节序列以外或作为这些序列的替代，这些序列的天然调节元件仍可以存在于实际的结构基因前面并且根据需要可能已经以消除其天然调节并且增强基因表达的方式被遗传性修饰.然而这种表达盒(表ii^J建体=基因构建体)也可以在构建方面更简单，也就是说在核酸序列或其衍生物的前面不插入额外的调节信号并且不去除天然启动子及其调节作用。相反，变。这些修饰的启动子自身还可以以部分序列的形式(具有本发明方法中所用核^列部分的启动子)位于天然基因之前以便增强活性。此外，基因构建体还可以有利地包含与启动子有效连接的一种或多种所谓的增强子序列，这使得核酸序列的增强表达成为可能。其它的有利序列如其它调节元件或终止子序列也可插入DNA序列的3'端。A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶基因可以以一个或多个拷贝存在于表达盒(基因构建体)内。优选地，在每个表达盒中仅存在基因的一个拷贝。该基因构建体或该类基因构建体可以一起在宿主生物内表达。在本上下文中，基因构建体可插入一种或多种栽体并且以游离形式存在于细胞内，或插Aj^因组内。当这些待表达的基因一起存在于一个基因构建体内时，有利于在宿主基因组内插入其它基因。在本上下文中，调节序列或辅助因子如上所述可优选地对所导入基因的基因表达具有积极影响，即增强基因表达。因此调节元件的增强作用(有利地在转录水平上)可以通过使用强转录信号如启动子和/或增强子而发生。此外，增强的翻译也是可能的，例如通过改善mRNA的稳定性。本发明的又一个实施方案是一种或多种这样的基因构建体，其包含一种或多种由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25或其衍生物所定义的序列并且编码如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26中所示的多肽，以上提及的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或ffl3-去饱和酶蛋白质有利地引起脂肪酸分子去饱和或延长，该底物有利地在脂肪酸分子内具有l、2、3、4、5或6个双键并且有利地具有18、20或22个碳原子。这同样适用于与一种或多种调节信号(有利地用于增强基因表达)有效连接的基因构建体同系物、衍生物或类似物。可以用来制备在新方法内所用核酸序列并l^导入植物的有利调节序歹寸存在于例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、Ipp國lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、入-PR或X-PL的启动子内并且有利地用于革兰氏阴性菌中。其它有利的调节子序列例如存在于革兰氏阴性菌启动子amy和SP02内，存在于酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH内或存在于植物启动子CaMV/35SFranck等，Cell21(1980)285~294、PRPl[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)1、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或者遍在蛋白启动子或菜豆蛋白启动子内。在本上下文中，诱导型启动子也是有利的，如描述于EP-A-0388186(苯磺酰胺诱导性)、PlantJ.2，1992:397-404(Gatz等，四环素诱导性)、EP-A-0335528(脱落酸诱导性)或WO93/21334(乙醇或环己醇诱导性)的启动子。其它合适的植物启动子是马铃薯胞质FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBOJ.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸酰胺基转移酶启动子(Genbank登录号U87999)或EP-A-0249676内所述的结节特异性启动子。特別有利的启动子是使在参与脂肪酸生物合成的组织内的表达成为可能的启动子.极特别有利的是种子特异性启动子如所述的USP启动子，以及其它启动子如LeB4、DC3、菜豆蛋白启动子或油菜籽蛋白启动子。更特别有利的启动子是能够用于单子叶或双子叶植物并且在US5，608，152(欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO98/45461(拟南芥的油质蛋白启动子)、US5，504，200(菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白启动子)、WO91/13980(芸苔的Bce4启动子)内、由Bae腿lein等，PlantJ.，2，2，1992:233—239(来自豆科植物的LeB4启动子)内描述的种子特异性启动子、适于双子叶植物的那些启动子。适于单子叶植物的启动子是例如大麦lpt-2或lpt-l启动子(WO95/15389和WO95/23230)、大麦醇溶蛋白启动子和WO99/16890内所述的其它合适启动子.原则上，有可能对新方法^:用全部天然启动子连同它们的调节序，如以上提及的那些天然启动子。还可能并且有利的是额外地或者单独地使用人造启动子，尤其当它们介导种子特异性表达时，如W099/168卯内所述的那些启动子。为了实现特別高的PUFA含量，在植物转基因前，PUFA生物合成基因应当有利地以种子特异性方式表达于油料作物内。为此目的，可使用种子特异性启动子或在胚和/或在胚乳内有活性的那些启动子.原則上，种子特异性启动子既可以分离自双子叶植物，也可以分离自单子叶植物。优选的启动子如下所列USP(未知种子蛋白质)和豌豆球蛋白蚕豆I[Baumlein等，Mol.GenGenet.,1991,225(3)，油菜籽蛋白(欧洲油菜)[US5,608,152、酰基载体蛋白(欧洲油菜)[US5，315，001和WO92/18634、油质蛋白(拟南芥)[WO98/45461和WO93/20216、菜豆蛋白(菜豆(Phaseolusvulgaris))US5,504,200〗、BceWO91/13980]、豆科B4(LegB4启动子)[Baumlein等，PlantJ.，2，2，1992]、Lpt2和lptl(大麦)WO95/15389和WO95/23230卜来自稻、玉米和小麦的种子特异性的启动子WO99/168卯、Amy32b、Amy6-6和aleurainUS5,677,474、Bce4(欧洲油菜)US5，530，149、大豆球蛋白(大豆)[EP571741、磷酸締醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870、ADR12-2(大豆)[WO98/08962、异柠檬酸裂合酶(欧洲油菜)[US5,689，0401或a淀粉酶(大麦)[EP781849。植物的基因表达也可以经化学诱导型启动子促进(见于综述Gate1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol,Biol.，48:89-108).在需要基因表达应当以时间特异性方式发生时，化学诱导型启动子是特别合适的。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇诱导型启动子。为确保经多个世代后生物合成基因仍稳定整合于转基因植物内，编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或w3-去饱和酶并且本方法中所用的每种核酸应当在独立的启动子，优选地是不同于任何其它启动子的启动子控制下进行表达，因为重复序列基序可能导致T-DNA不稳定或重组事件。在本上下文中，表达盒有利地以如此方式进行构建，即启动子之后是用于插入待表达核酸的适宜切割位点，该切割位点有利地位于多接头内，并且根据需要，终止子序列位于此多接头后面。该序列重复数次，优选地是三、四或五次，由此多达5个基因可组合于一个构建体内并导入转基因植物以俊束达。这种序列有利地重复至多三次，或重复所需要的次数。为表达核酸序列，将核酸序列通过(例如多接头内的)合适切割位点在启动子之后插入。有利地，每种核酸序列具有自己的启动子并且根据需要具有自己的终止子序列.此类有利的构建#^>开于例如DE10102337或DE10102338内。不过，仍有可能在启动子之后并根据需要在终止子序列之前插入多个核酸序列.这里，所插入核酸在表达盒内的插入位点或其序列不是特别重要，也就是说核酸序列可插入表达盒的最头位置或最末位置内而其表达不因而受到显著影响。有利地，不同启动子例如USP、LegB4或DC3启动子和不同终止子序列可用于表达盒内。然而也有可能在表达盒中仅使用一种类型的启动子。但这可能f1起不受欢迎的重组事件。如以上所述，导入基因的转录应当通过位于导入于生物合威基因3，末端的(终止密码子之后的)合适终止子序列有利地进行终止。可在本上下文内使用的终止子序列实例是OCSl终止子序列。如同启动子的实例，应该对每一基因使用不同终止子序列。如以上所述，基因构建体还可以包含待导入生物的其它基因。有可能并且有利的是将调节基因如编码诱导物、阻抑物或酶的基因导入宿主植物并且在其中表达，其中所迷的诱导物、阻抑物或酶因其酶活性而参与对生物合成途径的一种或多种基因的调节。这类调节基因可是异源或同源的。此外，脂肪酸代谢或脂代谢中的其它生物合成基因可有利地存在于核酸构建体或基因构建体内；然而这些基因还可以位于一种或多种其它核酸构建体中。优选使用的脂肪酸代谢或脂代谢中的生物合成基因选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP[跣基栽体蛋白I去饱和酶、g-ACP疏酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酖基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基-辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延长酶或其组合。特别有利的核酸序列是选自酰基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、A4-去饱和酶、A8-去饱和酶、A5-延长酶和/或A9-延长酶的脂肪酸代谢或脂代谢中的生物合成基因。在本上下文中，以上提及的核酸或基因可与其它延长酶和去饱和酶组合地克隆至表达盒内，如上述那些表达盒内，并在农杆菌协助下用于转化植物。如以上所述，调节序列或辅助因子可优选地对已经导入的基因的表达产生积极影响，并且因而增强已经导入的基因的表达。因此，调节元件的增强作用可在转录水平通过使用强转录信号例如启动子和/或增强子而有利地发生。然而例如通过改善mRNA稳定性也可以增强翻译。原则上，这类表达盒可直接用于导入植物或导入其它载体内。这些有利的栽体，优选地是表达栽体，包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶并且用于本方法中的核酸，或包含这样的核酸构建体，其包含单独地或者与脂肪酸代谢或脂代谢中其它生物合成基因如酖基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、A4-去饱和酶、A8-去饱和酶、A5-延长酶和/或A9-延长酶组合地进行使用的核酸。如在本上下文中所用，术语"载体"指这样的核酸分子，其能够运输与其结合的另一核酸.一个类型的载体是"质粒"，即向其中可以连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一个类型的载体是病毒载体，额外的DNA片段有可能连接至病毒基因组内。某些栽体能够在已导入这些栽体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它栽体在导入宿主细胞时有利地整合于宿主细胞基因组内并且因而随宿主基因组一起复制。而且某些载体能够控制与这些栽体有效连接的基因的表达。这些栽体在本上下文中称为"表达栽体".通常适用于DNA重組技术的表达载体采用质粒形式。由于在本描述中质粒是最常用的栽体形式，故"质粒"和"栽体"可互换地使用。然而本发明还将包含具有类似功能的其它形式的表达载体，如病毒载体。此外，术语"栽体，，还将包舍技术人员熟悉的其它栽体，如噬菌体、病毒如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线性或环形DNA。在本方法中有利地使用的重组表达载体包含处于适合在宿主细胞中表达所用核酸的形式下的如下所述核酸序列或上逸基因构建体，这意指重组表达载体包含基于用来表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节序列，其中所述的调节序列有效地与待表达的核酸序列连接。在重组表达栽体中，"有效连接，，意指目的核苷^f列以如此方式与调节序列连接以致有可能表达该核苷酸序列，并且它们相互连接以致两种序列(例如在体外(in-vitro)转录/翻译系统内，在宿主细胞中(或若载体导入宿主细胞))均赋予序列预期功能。术语"调节序列"将包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化作用信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel:GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress，SanDiego，CA(1990)或参见GruberandCrosby,in:MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida，编者GHck和Thompson,第7章，89-108，包括引用的参考文献。调节序列包列。技术人员知道设计表达载体可能取决于多种因素，如待转化宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。可设计所用的重组表达载体以在原核细胞或真核细胞内表达A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或3-去饱和酶.如此设计是有利的，因为出于简化的目的，常在微生物中开展栽体构建的中间步骤。例如A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶基因可以表达于细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达栽体)、酵母和其它真菌细胞(见Romanos，M.A.等(1992)"Foreigngeneexpressioninyeast:areview"，Yeast8:423-488:vandenHondel，C.A.M.J丄等，(1991)"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi",in:MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet和L丄.Lasure编辑，第396-428页AcademicPress:SanDiego:和vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，在AppliedMolecularGeneticsofFungi内，Peberdy，J.F.等编辑，第1-28页CambridgeUniversityPress:Cambridge)内、按照如WO98/01572中所述的转化方法使用栽体于藻类内(Falciatore等，1999，MarineBiotechnology.l，3:239-251)，并且优选地在多细胞植物的细胞内(见Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)"HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants，，PlantCellRep.:583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton,Florida,第6/7章，笫71-119页(1993);F.F.White,B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,第一巻，EngineeringandUtilization,Ed.:Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-43;Potrykus,Annu.Rev,PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225(及其中引用的参考文献))表达。合适的宿主细胞还在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)内讨论。作为备选，重组表达载体可例如使用T7-启动子调节序列和T7-聚合酶体外转录和翻译，在大多数情况下，原核生物内蛋白质的表达涉及利用包含控制融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的栽体。典型的融合表达栽体尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A分别与重组靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达栽体的实例尤其是pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301画315)和pETlld(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)60-89),pTrc栽体内把基因的表达基于宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子上的转录。pETlid栽体内乾基因的表达基于通过受到共表达的病毒RNA聚合酶(T7-gnl)介导的T7-gnl0-lac融合启动子的转录。这种病毒RNA聚合酶由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)从定居的入-原噬菌体内提供，其中所述的入-原噬菌体携带受lacUV5启动子转录控制的T7gnl基因.适合于原核生物的其它载体是技术人员已知的，这些栽体是例如;杆菌的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN画III113-Bl、Xgtll或pBdCI、链霉菌(Str印tomyces)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361、芽孢杆菌(BacilIus)的pUB110、pC194或pBD214、棒状菌(Corynebacterium)的pSA77或pAJ667。在又一个实施方案中，表达栽体是酵母表达栽体。用于酿酒酵母(S.cerevisiae)内表达的载体实例包括pYeDesaturasecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。适用于其它真菌如丝状真菌的栽体和栽体构建方法包括在AppliedMolecularGeneticsoffungi,J.F.Peberdy等编辑，第1-28页,CambridgeUniversityPress:Cambridge中的vandenHondel，C.A.M.J丄和Punt，P.J.(1991)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，或在MoreGeneManipulationsinFungi[J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页AcademicPress:SanDiego中详细描述的那些。更合适的酵母载体例如是pAG國l、YEp6、YEpl3和pEMBLYe23,作为备选，A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或w3-去饱和酶可使用杆状病毒栽体表达于昆虫细胞内。可获得用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞用于)内表达蛋白质的杆状病毒表达栽体包含pAc系列(Smith等(1983)Mo1.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。以上提及的载体仅对可能的适合载体的小部分进行综述。其它的质粒是技术人员已知的并且例如描述于Cloningvector(Pouwels，P.H.等编辑，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)。对于原核细胞及真核细胞更合适的表达系统，见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis,T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989的第16和第17章。最后，A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或to3-去饱和酶基因可以表达于植物细胞或完整植物内(例如种子植物，例如耕作作物)。植物表达载体的实例包括详细描述于Becker,D.、Kemper,E.、Schell，J.和Masterson，R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder，"PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan，M.W.(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,"Nud.AcidsRes.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants于TransgenicPlants:第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu编辑，第15-38页内的那些植物表达载体.植物表达盒优选地包含这样的调节序列，如多聚腺苷酸化作用信号，其能够控制植物细胞中基因表达并且被有效地连接以致每种序列均可以充分实现其功能，例如转录终止功能。优选的多聚腺苷酸化作用信号是衍生自根瘤农杆菌T-DNA如Ti质粒pTiACH5(1984年Gielen等，EMBOJ.3835etseq.)中的称作章鱼氨酸合酶的基因3的那些多聚腺苷酸化作用信号或其功能性等效物，不过，在植物中具有功能性活性的全部其它终止子序列也是合适的。由于植物基因表达并非总是受限于转录水平，因此植物表达盒优选地包含有效连接的其它序列，如翻译增强子，例如过度驱动序列，其增强可增加蛋白质/RNA比率的烟草花叶病毒5，-非翻译前导序列(Gallie等，15:8693-8711)。如以上所述，植物基因表达盒必须与合适的启动子有效地连接，其中所述启动子引起基因以正确的时间或以细胞或组织特异性方式表达。可利用的启动子是组成型启动子(Benfey等，EMBOJ.8(1989)2195-2202)例如衍生自植物病毒如35SCaMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(也见US5352605和WO84/02913)的那些启动子或植物启动子如描述于US4,962,028内的Rubisco亚单位的启动子。用于植物基因表达盒内有效连接的用途的其它优选序列是靶向序列，其中所述靶向序列是将基因产物引导至其对应的细胞区室(见综述Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15,4(1996)285-423及其引用的参考文献)例如至液泡、细胞核、所有类型质体如淀粉质体、叶绿体、色质体、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室内所需的。如以上所述，植物基因表达还可以通过化学诱导型启动子(见综述Gatzl997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48:89-108)促进。当基因表达需以时间特异性发生时，化学诱导型启动子是特别适合的。这类启动子的实例是7JC杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇诱导型启动子。应答生物性胁迫或非生物胁迫条件的启动子如病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、热诱导的番茄hsp80启动子(US5,187,267)、寒冷诱导的马铃薯a淀粉酶启动子(WO96/12814)或外伤诱导的pinll启动子(EP-A-O375091)也是适合的.特别优选引起基因在其中发生脂肪酸、脂类和油生物合成的组织和器官内、在种子细胞如胚乳细胞和发育胚的细胞内表达的那些启动子。合适的启动子是欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子(US5，608，152)、蚕豆的USP启动子(Baeumlein等，MolGengenet，1991，225(3):459-67)、拟南芥的油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US5，504，200)、芸苢的Bce4启动子(WO91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4;Baeumlein等，1992，PlantJournal,2(2):233-9)及引起单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等内的种子专一性表达的启动子。重要的合适启动子是大麦的lpt2或lptl基因启动子(WO95/15389和WO95/23230)或描述于WO99/16890内的来自大麦的醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁的kasirin基因或黑麦的棵麦醇溶蛋白基因的启动子。特别地，可能需要引起本方法中所用A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶的多重平行表达。这种表达盒可通过同时转化多个独立的表达构建体，或优选地通过多个表达盒组合于一个载体构建体内加以导入。此外，多种载体在每个实例中可以用多个表达盒进行转化，并且随后转移至宿主细胞。可能特别适合的其它启动子是引M体特异性表达的那些启动子，因为质体构成在其中脂生物合成的前体及某些终产物进行合成的区室。合适的启动子如病毒RNA聚合酶启动子描述于WO95/16783和WO97/06250，并且来自拟南芥的clpP启动子描述于WO99/46394内。栽体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核细胞和真核细胞。如在本上下文中所用的术语"转化"和"转染"、接合和转导将包含用于外源核酸(如DNA)导入宿主细胞内的本领域众所周知的多种方法，包括磷酸钩或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔法或粒子轰击法。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual"第二版.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)和其它的实验室教科书如MethodsinMolecularBiology,1995，第44巻,Agrobacteriumprotocols,编者Gartland和Davey，HumanaPress,Totowa，NewJersey内找到。原则上适合于摄取本发明核酸、本发明基因产物或本发明栽体的宿主细胞是全部原核生物或真核生物。有利地用作中间宿主的宿主生物是微生物，如真菌或酵母。优选植物，如具有较高脂化合物的油料作物植物，如欧洲油菜、月见草、大麻、蓟、花生、油菜、亚麻、大豆、红花、向日葵、玻璃苣，或植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊，茄科植物如马铃薯、烟草、茄和番茄、豌豆属物种、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种、树(油棕、椰子)和飼料作物a根据本发明尤其优选的植物是油料作物植物，如大豆、花生、欧洲油菜、油菜、亚麻、M、月见草、向日葵、红花、树(油棕、椰子)。本发明还涉及在下文中列举并编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、ro3-去饱和酶和/或A12-去饱和酶的核酸序列。编码具有A6-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:l所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:2所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:l所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:2在氨基酸水平具有至少70%同一性并具有A6-去饱和酶活性的多肽.编码具有A6-延长酶活性的多肽的分离核M列，其选自a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示核^列的衍生物，其编码与SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8在^J^酸水平具有至少70%同一性并具有A6-延长酶活性的多肽。编码具有A5-去饱和酶活性的多肽的分离核^列，其选自a)具有SEQIDNO:9所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:10所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:9所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:10在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有A5-去饱和酶活性的多肽。编码具有o)3-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:n所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:24所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:23所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:24在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有3-去饱和酶活性的多肽。编码具有A12-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:25所示序列的核酸序列，或b)编码具有SEQIDNO:26所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:25所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:26在氨基酸水平具有至少40。/。同一性并具有A12-去饱和酶活性的多肽。以上提及的本发明核酸衍生自能够合成PUFA的生物，如真菌、植物如藻或珪藻。分离的上述核酸序列有利地衍生自海链藻属硅藻，或来自绿枝藻纲如Ostreococcus属，来自棵藻纲(Euglenophyceae)如Euglenia属或腐霉科(Pythiaceae)如疫霉属。尤其优选的核酸序列衍生自大豆疫霉。在有利的实施方案中，这些核酸序列使EPA和/或ARA的合成成为可能。下表描述这些有利的核酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>如上所述，本发明还涉及编码具有A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、Q)3-去饱和酶和A12-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其中由这些核酸序列编码的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、G)3-去饱和酶和/或A12-去饱和酶将具有1、2、3或4个双键的ds-或C2o-脂肪酸如C18:1A9、C18:2A"2或C18:3A9，12，15转化成具有3或4个双键的多不饱和C2『脂肪酸如C20:3，11，14或C20:4AS，11，14，17。脂肪酸在磷脂或CoA-脂肪酸酯内、有利地是在CoA-脂肪酸酯内被有利地去饱和。在有利的实施方案中，术语"核酸(分子)"如在本上下文中所用还包含位于编码基因区3，末端和5，末端的非翻译序列位于编码区5，末端上游序列的至少500个，优选地是200个，特别优选地是100个核苷酸以及位于编码基因区3，末端下游序列的至少100个，优选地是50个，特别优选地是20个核苷酸。"分离的"核酸分子是与存在该核酸天然来源内的其它核酸分子分开的。"分离的"核酸优选地没有天然分布于生物(衍生该核酸的生物)的基因组DNA内该核酸两侧的序列(例如位于该核酸5，末端和3，末端的序列)。在多种实施方案中，编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、co3-去饱和酶和A12-去饱和酶的分离核酸分子可以包含例如少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的如此核苷酸序列，其天然分布在细胞(衍生该核酸的细胞)基因组DNA内的该核酸分子两侧。本方法中所用的核酸分子例如具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25核苷酸序列的核酸分子或其部分可以使用分子生物学标准技术和本文中提供的序列信息进行分离.同源序列或同源的、保守的序列区域例如还可以借助比较性算法在DNA水平或氨基酸水平进行鉴定。它们可以用作杂交探针和标准杂交4支术(例如在1989年纽约冷泉港ColdSpringHarborLaboratory出版#土《MolecularCloning:ALaboratoryManual》第二版所描述的那些探针和标准杂交技术)以分离可以用于本方法中的其它核酸序列。此外，包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的完整序列或其部分的核酸分子可通过聚合H^式反应进行分离，其中使用以该序列或其部分为基础的寡核苷酸引物(例如包含完整序列或其部分的核酸分子可以使用基于相同序列所产生的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应进行分离)。例如mRNA可从细胞(如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸胍提取方法)分离，并且通过逆转录酶(例如自Gibco/BRL、Bethesda、MD可获得的MLVMoloney逆转录酶，或自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL可获得的AMV逆转录酶)获得cDNA。用于聚合酶链式反应扩增的合成性寡核苷酸引物可以借助在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26内详述的^J^絲列，基于SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示序列之一生成。本发明的核酸可使用cDNA或备选地是基因组DNA作为模板及合适的寡核苷酸引物，通过标准PCR扩增技术进行扩增。扩增的核酸因而可克隆至合适的载体并且通过DNA序列分析加以表征。与去饱和酶核苷酸序列对应的寡核苷酸可通过标准合成方法，例如使用自动DNA合成仪产生。具有序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或CD3-去饱和酶核酸序列的同系物意指例如这样的等位变体，其与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示核苷酸序列或其同系物、；时生物或类似物或者其部分具有至少大约40或50%、优选地至少大约60或70%、更优选地至少大约70或80%、90%或95%并且甚至更优选地至少大约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性或同源性。具有与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示核苷酸序列或与其部分杂交的核苷酸序列的分离核酸分子可例如在严4Wf下杂交。根据本发明，其部分理解为意指至少25个4^对^bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp,优选地是至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp，特别优选地是350bp、400bp、450bp、500bp或更多>5^^用于杂交。使用全序列也是可能并且是有利的。等位变体特别包含这样的功能性变体，其可以通过自/向SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25内详述的序列内缺失、插入或置换核苷酸而获得，然而，即便因一种或多种基因的插入，预期合成的所得蛋白质的酶活性仍然有利地保留。保留A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或m3-去饱和酶酶活性的蛋白质，即蛋白质的活性基本上没有减少，意指与由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25编码的蛋白质相比，蛋白质具有原始的酶活性的至少10%,优选地是20%，特别优选地是30%，极特别优选地是40%。同源性在M4^氨基酸序列或核紗列区域进行计算。技术人员可获得基于用来比较多种序列的多种算法的一系列程序。这里Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法产生特别可靠的结果。包含于GCG软件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)内的PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989:151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))用于序列比对。如上表示为百分数的序列同源性数值使用GAP程序和如下设置在全长序列区域范围内测定缺口权重50，长度权重3，平均配对10.000和平均错配0.000。除非另外说明，否则这些设置总是作为标准设置用于序列比对。SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的同系物还意指例如编码性或非编码性DNA序列的细菌性、真菌性和植物同系物、截短的序列、单链DNA或RNA。SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的同系物还意指衍生物，例如启动子变体.详细描述的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸交换、通过插入和/或缺失进行修饰，与此同时启动子的功能性或活性未受到不利影响。还有可能启动子序列的{务饰增强了它们的活性或者它们完全由更活跃的启动子(包括来自异源生物的那些启动子)替换.脂类合成可分成两个部分合成脂肪酸及其与sn-甘油-3-磷酸结合，和添加或修饰极性头基团。膜内常见的脂包含磷脂、糖脂、鞘氨脂和磷酸甘油酯。脂肪酸的合成始于乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化成丙二酸单酰辅酶A或乙酰转酰基酶将乙酰辅酶A转化成乙St^-ACP。缩合反应后，这两种产物分子一起形成乙酰乙酰基-ACP，乙酰乙酰基-ACP经一系列缩合、还原和脱7JC化反应进行转化，因而得到具有所需链长度的饱和脂肪酸分子。从这些分子中产生不饱和脂肪酸的过程由专一性去饱和酶催化，或通过分子氧进行有氧催化或无氧催化(就微生物内脂肪酸合成而言，见F.C.Neidhardt等，(1996)E.coliandSalmonella.ASMPress:Washington,D.C.第612-636页及其中引用的参考文献；Lengeler等(编者)(1999)BiologyofProcaryotes.Thieme:Stuttgart,NewYork和其中的参考文献及Magnuson，K.,等(1993)MicrobioIogicalReviews57:522-542及其中的参考文献)。为实施进一步延长步骤，必须将得到的磷脂结合性脂肪酸返回脂肪酸辅酶A酯库内。这通过酰基辅酶A:溶血磷脂跣基转移酶是可能的。此外，这些酶能够将已延长的脂肪酸从辅酶A酯返回转移至磷脂。根据需要，这种反应顺序可以重复地进行。用于生物合成PUFA的前体实例是油酸、亚油酸和亚麻酸。C化碳月旨肪酸必须延长至C20和C22以便获得二十和二十二链型的脂肪酸。在用于本方法中的去饱和酶和/或延长酶协助下，花生四烯酸、二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸、有利地是二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸可以产生并且随后应用于涉及食品、饲料、化妆品或药品的多种领域。脂肪酸分子内具有至少2个、有利地是至少4、5或6个双键的C2。-和/或C『脂肪酸，优选地;O旨肪酸分子内有利地具有5或6个双键的C,或<:22-脂肪酸可以使用以上提及的酶进行制备。本发明方法中所用去饱和酶和延长酶的底物是(:16-、C『或C2o-脂肪酸，例如亚油酸、Y-亚麻酸、a-亚麻酸、二高7-亚麻酸、二十碳四烯酸或十八碳四烯酸。优选的底物是亚油酸、？亚麻酸和/或a-亚麻酸、二高Y-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。所合成的在脂肪酸内具有至少4、5或6个双键的<:2。-或<:22-脂肪酸在本发明的方法中以游离脂肪酸形式或以其酯形式得到，如其甘油酯形式，有利地是其甘油三酯形式。将术语"甘油酯"理解为意指以1、2或3个氯基游离基酯化的甘油(甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯)。还将"甘油酯，，理解为意指多种甘油酯的混合物。甘油酯或甘油酯混合物可以包含其它附加物例如游离脂肪酸、抗氧化剂、蛋白质、糖类、维生素和/或其它物质。为了本发明的目的，还将"甘油酯"理解为意指甘油衍生物。除上述的脂肪酸甘油酯以外，甘油衍生物还包括甘油磷脂和甘油糖脂。在本上下文中提到的优选实例是甘油磷脂，如卵磷脂(磷脂酰胆碱)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和烷基跣基甘油磷脂。此外，脂肪酸必须随后易位至多个修饰部位以及掺入到三酰甘油酯中的贮藏脂内。脂合成中又一个重要的步骤;O旨肪酸转移至极性头部基团，例如通过甘油脂肪酸酰基转移酶(见Frentzen，1998，Lipid,100(4-5):161-166)。关于植物脂肪酸生物合成和关于脂质化合物的去饱和、脂代谢及膜运输、关于j8氧化、脂肪酸修饰和辅助因子、三酰甘油酯贮藏及三酰甘油酯组装的出版物见以下论文Kinney，1997，GeneticEngineering,编者JKSetlow，19:149-166;Ohlrogge和Browse,1995，PlantCell7:957曙970;Shanklin和Cahoon，1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641;Voelker，1996，GeneticEngineering,编者JKSetlow，18:111-13;Gerhardt，1992，Prog.LipidR.31:397-417;Gtihnemann-Schafer和Kindl，1995，Biochim.BiophysActa1256:181-186;Kunau等，1995，Prog.LipidRes.34:267-342;Stymne等，1993，在Biochemistry和MolecularBiologyofMembraneandStorageLipidsofPlants内，编者Murata和Somerville，Rockville,AmericanSocietyofPlantPhysiologists,150-158;Murphy和Ross1998，PlantJournal.13(1):1-16，包括其中参考文献。本方法中所产生的PUFA包含高等动物不再能够合成并且因而必须摄入，或者高等动物不再通过自身能够足量地合成并且因而必须摄入额外量的一组分子，尽管所述分子可由其它生物例如细菌轻易地合成，然而例如，猫不再能够合成花生四烯酸.为本发明目的，将磷脂理解为意指磷脂酰胆喊、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇，有利地是磷脂酰胆碱。术语"生产，，或"生产力，，是本领域已知的并且包括植物细胞或植物内的生产力，也即相对于此细胞或植物内全部脂肪酸的含量，本方法中所产生的所需要脂肪酸的含量。术语"生物合成"或"生物合成途径"是本领域已知的并且包含化合物、优选地是有机化合物通过细胞从中间体例如在多步骤并受强力调节的过程内合成。术语"分解代谢，，或"分解代谢途径"是本领域已知的并且包含化合物、优选地是有机化合物通过细胞在例如多步骤并受强力调节的过程中降解产生分解代谢物(更一般的术语是较小或复杂程度较低的分子)。术语代谢是本领域已知的并且包含生物内发生的生物化学反应的总体。某种化合物的代谢(例如脂肪酸的代谢)因此包含该化合物在该化合物相关的细胞内的生物合成途径、修饰途径和分解代谢途径的总体。在又一个实施方案中，SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中所描述的本发明核酸分子的衍生物编码如此的蛋白质，其与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的完整M酸序列具有至少40%，有利地是约50或60%,有利地是至少约60或70%和更优选地是至少约70或80%、80至90%、卯至95%以及最为优选地是至少约96%、97%、98%、99%或更高同源性(为本发明目的同源性等于同一性)。同源性在完全的^J^酸序列或核酸序列区域范围内计算.包含于GCG软件包[GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711(1991)1内的PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25,351-360,1987，Higgins等，CABIOS，51989:151-153)或G叩和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))用于序列比对。如上表示为百分数的序列同源性数值使用BestFit程序和如下设置在全长序列区域范围内测定缺口权重50，长度权重3，平均配对10.000和平均错配0.000。除非另外说明，否则这些设置总是作为标准设置用于序列比对.此外，本发明包含如此核酸分子，其因遗传密码子简并性而不同于如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中所示的核苷酸序列(及其部分)之一并且因而编码如与由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中所示核苷酸序列所编码相同的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、3-去饱和酶或A12-去饱和酶活性.除SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、3-去饱和酶或A12-去饱和酶以外，技术人员认识到，群体内可以存在引起A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、①3-去饱和酶和/或A12-去饱和酶的^J^酸序列内改变的DNA序列多态性.A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、co3-去饱和酶和/或A12-去饱和酶基因内的这些遗传多态性可能因为天然变异而存在于群体内的个体间。这些天然变异体通常引起A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、co3-去饱和酶和/或A12-去饱和酶基因的核苷酸序列内的1至5%变异.本发明将包含每一及全部的这些核苷酸变异以及在A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、a)3-去饱和酶和/或A12-去饱和酶内产生的氨基酸多态性，其中所述氨基酸多态性是天然变异的结果并且不修饰这些酶的功能性活性。由于其与本文公开的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和/或co3-去饱和酶核酸具有同源性，有利于本发明方法的核酸分子可以遵循标准杂交技术在严格杂交条件下，使用这些酶的核酸序列或其部分作为揮:针加以分离.例如本上下文中有可能使用如此的分离核酸分子，其具有至少15个核苷酸长度并且与包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的核苷酸序列的核酸分子在严格条件下杂交。也可以使用具有至少25、50、100、250或更多个核苷酸的核酸.如本上下文中所用，术i吾"在严*件下杂交"意图描述这样的杂交条件和洗涤条件，在所述的务ff下彼此具有至少60%同源性的核苷酸序列通常可以保持相互杂交，优选了杂交条件以致彼此具有至少约65%,优选地至少约70%并且特别优选地至少75%或更高同源性的序列间通常保持相互杂交。这些严格条件对技术人员是已知的并且例如描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。优选的非限制性严格杂交条件的实例是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)内于大约45°C杂交，1^在0.2xSSC、0.1%SDS内于50°C至65°C下进行一个或多个洗涤步骤。技术人员知道浓度而不同。在"标准杂交条件"下，例如,取决于核酸类型，在具有O.lxSSC至5xSSC(pH7.2)浓度的含水緩沖液内杂交温度是42°C至58°C间。若有溶剂例如50%甲醛存在于上述緩沖液内，则标准条件下的杂交温度是大约42°C。例如，用于DNA:DNA杂交体的杂交^Hf优选地是O.lxSSC和20°C至45°C，优选30°C至45°C。例如，用于DNA:RNA杂交体的杂交条件优选地是O.lxSSC和30。C至55。C，优选45。C至55。C。以上提及的杂交条件以例举方式对具有约100bp(^5^JJft)长度并且G+C含量是50%的核酸在不存在甲醛条件下进行测定。技术人员基于以上提到的教材或如Sambrook等，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989;Hames和Higgins(编辑)1985，"NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach",IRLPress在OxfordUniversityPress,Oxford;Brown(编辑)1991，"EssentialMolecularBiology:APracticalApproach",IRLPress在OxfordUniversityPress,Oxford知道如何确定所需要的杂交条件。为测定两种^J^睃亭列(如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26序列之一)或两种核酸(例如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25)的同源性(-同一性)百分数，将序列书写为使一个序列处于另一个序列下用于最佳比较(例如将缺口引入一种蛋白质或一种核酸的序列以便产生与另一种蛋白质或另一种核酸的最佳比对)。然后比较相应^J^酸位置或相应核苷酸位置内的氨基酸残基或核苷酸。如果在一个序列内的某位置由另一个序列中相应位置内的相同M酸残基或相同核苷酸占据，则分子在此位置内是同源的(如在本发明中所用即絲酸或核酸"同源性"对应于絲酸或核酸"同一性").两个序列间的同源性百分数M列共有的完全相同位置数的函数(即同源性％=完全相同位置勤总位置数xl00)。因此将术语"同源性"和"同一性，，认为是同义的。所用程序和算法如上所述。可以如此产生编码与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的蛋白质序列同源的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5國去饱和酶、A5誦延长酶、A4-去饱和酶、A12隱去饱和酶和/或co3國去饱和酶的分离核酸分子，即通过将一个或多个核苷酸的置换、添加或缺失导入于/至SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQID魔17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的核苷酸序列内，以致将一个或多个氨基酸的置换、添加或缺失导入于/至编码的蛋白质内。在SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO;ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的一个序列内的突变可通过标准技术如位点定向诱变及PCR介导性诱变进行导入。优选在一个或多个预测的非关键氨基酸残基内产生保守性氨基酸置换。在"保守性氨基酸置换"中，氨基酸残基由具有类似侧链的另一种氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域内进行定义.这些家族包含具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、^分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸.因此，预测的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶或①3-去饱和酶内非关键氨基酸残基优选地由来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换.在另一个实施方案中，突变可备选地随机导入于编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶或Q)3-去饱和酶的完整序列或其部分范围内，例如通过饱和i秀变，并且得到的突变体可对如本文中所述的A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、M2-去饱和酶或co3-去饱和酶活性进行筛选，以鉴定保留A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶或co3-去饱和酶活性的突变体。对SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中一种序列诱变后，编码的蛋白质可以重组地进行表达，并且该蛋白质的活性可经例如本文中所描述的试验测定。本发明还涉及转基因非人生物，优选地是转基因植物，其包含本发明的核酸SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25或^^有本发明的这些核^列的基因构建体或载体。本发明通过如下实施例进行更详细的说明，所述实施例不得解释为限制性的。实施例实施例1:通用的克隆方法克隆方法例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、核酸转移至硝酸纤维素膜及尼龙膜、DNA片段的连接、大肠杆菌细胞的转化、细菌培养和重组DNA的序列分析按照Sambrook等(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)所描述开展。实施例2:重组DNA的序列分析重组DNA分子以ABI激光荧光DNA测序仪通过Sanger方法(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)测序。测序并發汪通过聚合im式反应得到的片段以避免待表达的构建体内的聚合酶差错。实施例3:来自大豆疫霉的PUFA专一性去饱和酶和延长酶的克隆为搜索具有A6-、A5-、A12-、co3-去饱和酶活性和A6-延长酶活性的新基因，检索大豆疫霉基因组数据库(http:/genome.jgi画psf.org/sojae/sojael.home.html)。该数据库含有覆盖大约90%的大豆疫霉基因组DNA的原始序列。对活性的全部搜索找出了推测的候选基因，通过制备并表征这些候选基因的cDNA，找到它们正确的编码性可读框并衍生出氨基酸序列。结果如下基因酶功能蛋白质序列SEQIDD6-Des(Ps)A6-去饱和酶456AsSEQIDNO:lD6-Elo(Ps)A6-延长酶304AsSEQIDNO:3D6曙Elo(Ps)2A6-延长酶278AsSEC)IDNO:5D6誦Elo(Ps)3A6-延长酶278AsSEQIDNO:7D5-Des(Ps)A5-去饱和酶498AsSEGIDNO:9D12画Des(Ps)A12-去饱和酶398AsSEQIDNO:2503-Des(Ps)3-去饱和酶363AsSEQIDNO:23为制备cDNA，大豆疫霉的总RNA借助Qiagen的RNAeasy试剂盒(Valencia,CA，美国)分离。Poly-A十RNA(mRNA)借助Oligo-dT纤维素从总RNA内分离(Sambrook等，1989)。ZAPGold,Stratagene)。才艮据制造商说明书将cDNA去包装以产生质粒DNA。随后，对质粒文库筛选相应的推测的候选基因(细菌性克隆的杂交，Sambrook等1989),并且对阳性克隆测序，相应的cDNA克隆随后用于PCR以克隆表达质粒。实施例4:克隆在酵母内异源表达大豆疫霉基因的表达载体为了在酵母内异源表达，按照制造商说明书，将相应序列用相应的特异性引物经PCR扩增并克隆至酵母表达载体YES2.1-TOPO(Invitrogen)。本文中，仅扩增了编码PUFA蛋白质的基因的可读框。此外，在5，附加Kozak序列(Cell1986，44:283-292):基因絲引物SEQIDD5國Des(Ps)1497bpFwd:gccatggcccccatcgagaccgacRvs:ttagcccatgtggacggacaSEQIDNO:27SEQIDNO:28D6-Des(Ps)1371bpFwd:accatggtggatggccccaagaccaRvs:ttacatggccgggaactcgagcaggSEQIDNO:29SEQIDNO:30D12-Des(Ps)1197bpFwd:gccatggcgatcctgaacccggRvs:tagagcttgttcttgtagaSEQIDNO:31SEQIDNO:3203-Des(Ps)1092bpFwd:gccatggcgtccaagcaggagcaRvs:tcagttggccttagtcttggtcgccSEQIDNO:33SEQIDNO:34D6國Elo(Ps)915bpFwd:aagatggagacgaccttcgcgcgcRvs:ttactgcgtcttcttggcgaccgcagcgSEQIDNO:35SEQIDNO:36D6-Elo(Ps)一2837bpFwd:gccatggcgtcggagctgctgcaRvs:ttagaggttcttcttggccggSEQIDNO:37SEQIDNO:38D6-Elo(Ps)一3837bpFwd:accatgtcggccgacctgctgcRvs:ttagagcttcttcttggcSEQIDNO:39SEQIDNO:40PCR混合物的组成(50pl):5.00pl模板cDNA5.00pi10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00/d2mMdNTP1.25pl每种引物(IOpmo1/>U的5，-ATG引物和10pmo1/jil的3，-终止引物)0.50Advantage聚合酶4吏用来自CIontech的Advantage聚合酶。PCR反应条件复性温度55°C下1分钟变性温度94°C下1分钟延伸温度72。C下2分钟循环数35将PCR产物按照制造商说明书与质粒pYES2.1-TOPO(Invitrogen)温育。随后，将温育反应物按照制造商说明书转化至大肠杆菌DH5a细胞(Invitrogen)。阳性克隆通过PCR鉴定(见以上反应)，并且分离质粒DNA(QiagenDneasy)。形成的质粒通过测序加以验证并通过电穿孔(1500V)转化至酿酒酵母菌林INVScl(Invitrogen)。作为对照，平行转化pYES2.1(空白栽体)。转化酵母的选择在含2%葡萄糖的无尿嘧啶的完全基本培养(CMdum)琼脂平板上实施。选择后，每一情况下选择三个转化体用于进一步功能性表达。为表达来自大豆疫霉的基因，在所有情况下，将5ml含2。/。(w/v)棉子糖的无尿嘧啶的CMdum液体培养基的预培养物首先用所选转化体接种并且在30。C每分钟200转温育2日。随后，5ml含2%棉子糖和300jiM多种脂肪酸的CMdum液体培养基(无尿嘧咬)用预培养物接种至OD咖0.05。通过添加2%(w/v)半乳糖诱导表达。培养物在20。C继续温育96小时。实施例5:用于植物内种子特异性表达的表达载体的克隆为转化植物，产生基于pSUN-USP的其它转化载体。为此目的，使用以下引物对(见下表)将Notl切割位点插入编码序列的5'和3'末端。PCR混合物的组成(50^d):5.00pl模板cDNA5.00pl10x緩冲液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.002mM的dNTP1.25每种引物(10pmol/Ml)0.50/dAdvantage聚合酶使用来自Clontech的Advantage聚合酶。PCR反应条件复性温度55。C下l分钟变性温度94。C下l分钟延伸温度72。C下2分钟循环次数35<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>SEQIDNO:48D6-EIo(Ps)915bpFwdzgcggccgcaagatggagacgaccttcgcgcgcRvs:gcggccgcttactgcgtcttcttggcgaccgcagcgSEQIDNO:49SE<3IDNO:50D6-Elo(Ps)—2837bpFwd:gcggccgcgccatggcgtcggagctgctgcaRvs:gcggccgcttagaggttcttcttggccggSEQIDNO:51SE(JIDNO:52D6-Elo(Ps)—3837bpFwdzgcggccgcaccatgtcggccgacctgctgcRvs:gcggccgcttagagcttcttcttggcSEQIDNO:53SEQIDNO:54PCR产物在37。C与限制性酶Notl温育4小时。植物表达栽体pSUN300-USP以同样方式进行温育。此后，PCR产物和大小7624bp的栽体通过琼脂糖凝胶电泳分离并且切下相应的DNA片段。DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒按照制造商说明书进行纯化。随后，连接栽体和PCR产物。为此目的使用来自Roche的快速连接试剂盒。通过测序l^iE得到的质粒。pSUN300;Lt粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P，Svab，Z，Maliga，P.，(1994)ThesmallversatilepPZPfamilyofAgrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.PlantMolBiol25:989-994)。pSUN國USP源于pSUN300，其通过将EcoRI片段形式的USP启动子插入pSUN300产生。多腺苷酸化信号是来自根瘤农杆菌Ti质粒的Ostreococcus基因的多腺苷酸化信号(ocs-终止子，Genbank登录号V00088)(DeGreve，H、Dhaese，P.、Seurinck,J.、Lemmers,M、VanMontagu,M.和Schell，J.NucleotidesequenceandtranscriptmapoftheAgrobacteriumtumefaciensTiplasmid-encodedoctopinesynthasegeneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1至684位核苷酸(Genbank登录号X56240)，其中USP基因非编码区域的部分包含于USP启动子内。大小684碱基对的USP启动子片段借助合成的引物和商业可获得的T7标准引物(Stratagene)(引物序列5，-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3，)[SEQIDNO:55按照标准方法通过PCR反应进行扩增.PCR片段用EcoRI/SalI再次切割并且插入带OCS终止子的pSUN300载体。这产生名为pSUN-USP的质粒，该质粒通过根瘤农軒菌转化植物。实施例6:大豆疫霉基因在酵母内的表达已用如实施例4内所述质粒pYES2.1或质粒pYES-d4Des(Ps)、pYES-d5Des(Ps)、pYES-d6Des(Ps)、pYES-dl2Des(Ps)、pYES-o3Des(Ps)、pYES-d6Elo(Ps)、pYES画d6Elo誦2(Ps)和pYES-d6EIo画3(Ps)转化的酵母分析如下来自主要培养物的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20。C)收获并用100mMNaHC03，pH8.0洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。从酵母细胞沉淀开始，通过酸甲醇分解作用制备脂肪酸甲基酯(FAME)。为此目的，将细胞沉淀在80。C与2ml1N曱醇硫酸及2。/。(v/v)二曱氧丙烷温育1小时。FAME用石油醚(PE)提取两次。为除去未衍生化的脂肪酸，有W目在所有情况下用2ml100mMNaHC03，pH8.0和2ml蒸馏水洗涤。1^,PE相用Na2S04干燥，在氩气下蒸发并溶于100^1PE。样品在配备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard6850气相色镨内的DB嗎23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25fim，Agilent)上分离。用于GLC分析的条件如下炉腔温度设置为以每分钟5°C的速率从50°C升至250°C并且最后在250。C持续10分钟(保持)。信号通it^目对于对应脂肪酸标准物(Sigma)比较停留时间进行鉴定。方法学描述于例如Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8):761-766;Sayanova等，2001，JournalofExperimentalBotany.52(360):1581陽1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2):293誦298和Michaelson等，1998，FEBSLetters.439(3):215-218。实施例7:大豆疫霉基因的功能性表征单个基因的活性和底物专一性可以在表达和摄取多种脂肪^进行确定。添加的底物大量存在于全部转基因酵母内，i^明这些脂肪酸摄取进入酵母。转基因酵母揭示了新脂肪酸(基因的产物)的合成。这表明来自大豆疫霉的基因可以功能性表达.去饱和酶和延长酶的底物专一性可以借助多种酵母通过摄取而于酵母内表达后进行测定。对测定各自活性的描述可以在对于03-去饱和酶的WO93/11245内、在对于A12-去饱和酶的WO94/11516内，在对于A6-去饱和酶的WO93/06712、US5，614，393、US5614393、WO96/21022、WO0021557和WO99/27111内，在对于A4-去饱和酶的Qiu等2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566内，在对于A5-去饱和酶的Hong等2002，Lipids37,863-868内、在对于延长酶的Zank，T.K.等PlantJournal31:255-268,2002内找到。各种去饱和酶和延长酶的活性使用式底物/(底物+产物)xlOO从转化率中进行计算。实施例8:转基因植物的产生a)转基因植物欧洲油菜的产生(Moloney等，1992，PlantCellR印orts，8:238-242的改良方法)。将如实施例5内所述产生的具有大豆疫霉基因的双元载体如pSUN质粒转化至根瘤农杆菌C58C1:pGV2260(Deblaere等，1984，Nucl.Acids.Res.13，4777-4788)以产生转基因欧洲油菜植物。为转化欧洲油菜植物(Var.Drakkar,NPZNordeutschePflanzenzucht,Hohenlieth,Germany),使用在Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog1962Physiol.Plant.15,473)上阳性转化农杆菌菌落的过夜培养物的1:50稀释物，其中所述的Murashige-Skoog培养基补加3。/。蔗糖(3MS培养基)，新鲜发芽的无菌的欧洲油菜植物的叶柄或下胚轴(在每一情况下约1cm2)在培养m内与1:50的农杆菌稀释物共同温育5-10分钟。！^在含0.8%Bacto琼脂的3MS培养基上于黑暗里在25。C共温育3天。然后，使这些培养物在16小时光照/8小时黑暗内生长3天，并且随后每周依次在补加500mg/L头孢漆將(头孢蓬坊钠)、50mg/L卡那霉素、20一苄氨基嘌呤(BAP)、现补加1.6g/L葡萄糖糖的MS培养基上生长。生长的芽转移至补加2%蔗糖、250mg/L头孢漆聍和0.8%Bacto琼脂的MS培养基内。若三周后根未发育，则将2-丐l哚丁酸添加至培养基内作为用于生根的生长激素。在补加卡那霉素和头孢漆肝的2MS培养基上得到再生苗；生根后，将这些苗转移至培养料，并且在受控的环境箱或温室内继续生长两周后开花，并且收获成熟种子并如例如Qiu等2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566所述，通过月旨分析法对去饱和酶基因和/或延长酶基因的表达进行分析。b)转基因亚^HL物的产生转基因亚麻植物可通过例如Bell等，1999，InVitroCell.Dev.Biol.Plant.35(6):456-465的方法经粒子轰击法产生。农杆菌介导性转化可以例如通过Mlynarova等(1994)，PlantCellR印ortl3:282-285的方法产生。实施例9:从种子中提取月旨可以通过在适当*(如上文所述)下培养修饰的微生物或修饰的植物并分析培养基和/或细胞组分的目的产物(即脂类或脂肪酸)产生的提高来测定植物、真菌、藻类或纤毛虫中遗传修饰对目的化合物(例如脂肪酸)产生的影响。这些分析技术为技术人员所熟知，并包括光镨学、薄层色谱、多种类型的染色方法、酶和微生物方法和分析型色谱(如高效液相色i普)(参阅如UIlman，《EncyclopediaofIndustrialChemistry》，A2巻，89-90和443-613页，VCH:Weinheim(1985);Fallon，A.，等(1987)《LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology》17巻中的"ApplicationsofHPLCinBiochemistry";Rehm等(1993)《Biotechnology》，第3巻，第III章"Productrecoveryandpurification",469-714页，VCH:Weinheim;Belter,P,A.等(1988)《Bioseparations:ownstreamprocessingforBiotechnology》,JohnWileyandSons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)((RecoveryprocessesforbiologicalMaterials》,JohnWileyandSons;Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.(1988)《Ullmann'sEncyclopediaoflndustrialChemistry》VCH:Weinheim，B3巻；11章，1-27页的"BiochemicalSeparations";以及Dechow，F丄(1989)《Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology》，NoyesPublications),除了上述过程以外，如Cahoon等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(22):12935-12940以及Browse等(1986)AnalyticBiochemistry152:141-145所iiA植物材料中提Wi物脂类。脂类或脂肪酸的定性和定量分析描述于Christie,WilliamW.，AdvancesinLipidMethodology,Ayr/Scotland:OilyPress(OilyPressLipidLibrary;2);Christie,WilliamW.，GasChromatographyandLipids.APracticalGuide-Ayr,Scotland:OilyPress,1989，Repr.1992，IX，307pp.(OilyPressLipidLibrary;1);"ProgressinLipidResearch,Oxford:PergamonPress,1(1952)-16(1977)，题目为ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN。除了测量发酵的终产物以外，还可能分析代谢途径内用于产生所需化合物的其它成分如中间体和副产物，以便确定化合物的整体生产效率。分析方法包含测量培养基内养分(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)的数量，测量生物量的组成和生长，分析生物合成途径内常规代谢物的产生以及测量发酵期间产生的气体。用于这些测量的标准方法描述于AppliedMicrobialPhysiology;APracticalApproach,编者P.M.Rhodes和P.F.Stanbury，IRLPress，第103-129页，第131-163页和第165-192页(ISBN:0199635773)及其中所引用的参考文献内。一个实例是脂肪酸的分析(缩写FAME,脂肪酸甲基酯；GC-MS,气液色谱/质镨；TAG,三酰甘油；TLC，薄层色谦).通过使用标准分析方法GC、GC-MS或TLC对重组生物进行分析可以明确检测脂肪酸产物的存在，所述分析方法Christie以及其中的参考文献进"f亍了描述(1997，AdvancesonLipidMethodology,第4版Christie,OilyPress,Dundee,119-169;1998，Gaschromatographie曙Massenspektrometrie腸VerfahrenGaschromatography/massspectrometricmethod],Lipide33:343-353)通过超声、在玻璃磨粉机中研磨、液氮和研磨或者通过其它可适用方法将待分析材料^^碎。破碎后，必须将材料离心。将沉淀重悬浮于蒸馏水中，于100。C加热10分钟，水上冷却并离心，接着在舍2%二甲氧基丙烷的0,5M硫酸(在甲醇中)中于卯。C提取1小时，这导致产生水解的油和脂化合物，这可以得到转甲基脂。在石油醚中提取这些脂肪酸曱基酯并且最终4吏用毛细管柱(Chrompack，WCOT融合珪，CP画Wax誦52CB，25pm，0.32mm)于170°C和240。C之间的梯度温度20分钟和240°C下5分钟进行GC分析。所得到的脂肪酸曱基酯的同一性必须使用可从商业来源(即Sigma)得到的标准进行定义。最初通过在扦和研钵中粉碎将植物材料机械匀浆以便更适于提取。接着，于100°C加热10分钟，冰上冷却后重新离心沉淀，将细胞沉淀在1M硫酸曱醇溶液和2%二甲氧基丙烷中于90。C氷解1小时，脂类被转甲基.所得到的脂肪酸甲基酯(FAME)在石油醚中提取.所提取的FAME通过使用毛细管柱(Chrompack,WCOT融合硅，CP-Wax-52CB，25pm，0.32mm)于170。C-240。C的梯度温度20分钟和240°C下5分钟进行气相色谱分析。脂肪酸甲基酯的同一性必须通过与相应的FAME(即Sigma)比较证实。可以通过将FAME混合物进行适当的化学衍生，例如通过GC-MS得到4，4-二甲^J^恶唑做生物(Christie，1998)进一步鉴定同一性和双键位置。等效物本文中所迷的本发明具体实施方案的众多等效物可以通过技术人员简单得求助于常规实验而鉴定或找到。这些等效物将处于本专利权利要求书的范围内。权利要求1.用于在转基因植物内产生具有至少4个双键的多不饱和C2『或C22-脂肪酸的方法，所迷脂肪酸的含量以重量计占转基因植物中甘油三酯总含量的至少15%，其中所述方法的特征在于包含如下的步骤a)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶和A5-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，或b)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A12-去饱和酶和①3-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，或c)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶和A4-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，或d)将包含编码A6-去饱和酶、A6-延长酶、A5-去饱和酶、A5-延长酶、A4-去饱和酶、A12-去饱和酶和o3-去饱和酶的核酸序列的核酸构建体导入转基因植物，和e)得到来自该植物的油和脂。2.根椐权利要求l所述的方法，其特征在于核酸构建体包含选自如下的核酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25，3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于具有至少4个双键的多不饱和C2。-或C22-脂肪^1花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。4.才艮据权利要求1至3中任意项所述的方法，其特征在于具有至少4个双键的多不饱和C20-或C22-脂肪酸是花生四烯酸。5.根据权利要求1至4中任意项所述的方法，其特征在于具有至少4个双键的多不饱和C2。-或C22-脂肪酸是二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。6.根据权利要求1至3中任意项所述的方法，其特征在于花生四烯酸或二十碳五烯酸在转基因植物内的含量以重量计占甘油三酯总含量的至少15%。7.根据权利要求1至3中任意项所逸的方法，其特征在于二十二碳六烯酸在转基因植物内的含量以重量计占甘油三酯总含量的至少4%。8.根据权利要求1至7中任意項所述的方法，其特征在于选自C22:4A7，10，13，16-、C22:5A4，7，"，"，"-或C22:5A7"，"，""-脂肪酸的多不饱和脂肪酸在甘油三酯内的含量以重量计占甘油三酯的总脂肪酸舍量的少于0.5%.9.根据权利要求1至8中任意项所逸的方法，其特征在于转基因植物是油料作物植物或有用植物。10.根据权利要求1至9中任意项所述的方法，其特征在于转基因植物选自花生、欧洲油菜、油菜、向日葵、红花(Carthamustinctoria)、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花(Calendula)、石榴(Punica)、月见草、毛蕊花、蓟、榛、扁桃、澳洲坚果、鳄梨、月桂、西葫，、亚麻、大豆、阿月混子、玻璃苣、油棕、椰子、核桃、玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉、木薯或胡椒。11.根据权利要求1至10中任意项所迷的方法，其特征在于具有至少4个双键的多不饱和<:20-或<:22-脂肪酸以斿离脂肪酸形式分离自油或脂。12.用于制备脂肪酸组合物的方法，其通过混合由根据权利要求l至ll中任意项所述的方法产生的油、脂或游离脂肪酸与动物的、微生物的或植物的油、脂或脂肪酸制备。13.由根据权利要求l至ll中任意项所述方法产生的油、脂或脂肪酸及根据权利要求12所制备的脂肪酸组合物在饲料、食品、化妆品或药物中的用途。14.编码具有A6-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:l所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:2所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:l所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:2在氨基酸氷平具有至少70%同一性并具有A6-去饱和酶活性的多肽。15.编码具有A6-延长酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示序列的核餅列，b)编码具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示序列的蛋白质的核^f列，或c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8在^J^酸水平具有至少70%同一性并具有A6-延长酶活性的多肽。16.编码具有A5-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:9所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:10所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:9所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:10在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有A5-去饱和酶活性的多肽。17.编码具有co3-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:23所示序列的核酸序列，b)编码具有SEQIDNO:24所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:23所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:24在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有G)3-去饱和酶活性的多肽。18.编码具有A12-去饱和酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自a)具有SEQIDNO:25所示序列的核酸序列，或b)编码具有SEQIDNO:26所示序列的蛋白质的核酸序列，或c)SEQIDNO:25所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQIDNO:26在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有A12-去饱和酶活性的多肽。19.根据权利要求14至18中任意项所述的分离核酸序列，其中该序列衍生自微生物或植物。20.蛋白质，其由才艮据权利要求14至19中任意项所述的分离核^列编码。21.包含根据权利要求14至19中任意项所迷的分离核酸的基因构建体，其特征在于核酸与一种或多种调节信号有效地连接。22.根据权利要求21所述的基因构建体，其特征在于核酸构建体包含选自下列的额外的脂肪酸或脂代谢生物合成基因酰基辅酶A脱氢酶、酰基-ACP[酰基栽体蛋白去饱和酶、iL^-ACP琉酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-辅酶A:溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延长酶o23.如权利要求21或22所述的基因构建体，其特征在于核酸构建体包含选自下列的额外的脂肪酸或脂代谢生物合成基因A4-去饱和酶、A5-去饱和酶、A6-去饱和酶、A8-去饱和酶、A12-去饱和酶或A9-延长酶。24.载体，其包含根据权利要求14至19中任意项所述的核酸或根据权利要求21或22所迷的基因构建体.25.转基因非人生物，包舍根据权利要求14至19中任意项所述的至少一种核酸、根据权利要求21或22所述的基因构建体或根据权利要求24所述的栽体，26.根据权利要求25所述的转基因非人生物，其中生物是植物。全文摘要本发明涉及用于通过将核酸导入植物而在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法，其中所述的核酸编码具有Δ6-去饱和酶、Δ6-延长酶、Δ5-去饱和酶、Δ5-延长酶、Δ4-去饱和酶、Δ12-去饱和酶和/或ω3-去饱和酶活性的多肽。这些去饱和酶和延长酶有利地衍生自大豆疫霉(Phytophthorasojae)。本发明还涉及核酸序列、核酸构建体、包含本发明核酸序列的载体和生物、包含核酸序列和/或核酸构建体的载体，并且涉及包含上述核酸序列、核酸构建体和/或载体的转基因植物。本发明的又一部分涉及由本发明方法产生的脂肪酸组合物及它们的用途。文档编号C12N15/82GK101146911SQ200680009188公开日2008年3月19日申请日期2006年3月21日优先权日2005年3月22日发明者J·鲍尔,P·奇尔普斯申请人:巴斯福植物科学有限公司