培育种子中α-亚麻酸含量提高的安全转基因植物的方法

培育种子中α-亚麻酸含量提高的安全转基因植物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种培育种子中α-亚麻酸含量提高的安全转基因植物的方法。该方法包括如下步骤：1)向受体植物中导入含有两个独立T-DNA结构域(分别含有表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒和表达选择标记基因的表达盒)的重组表达载体，得到同时表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因和选择标记基因的转基因植物；2)将步骤1)所得转基因植物自交，从后代中获得只表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因且不表达选择标记基因的转基因植物，进而获得与所述受体植物相比，种子中α-亚麻酸含量提高的转基因植物。本发明在不引入外源表达结构的前提下改良种子品质，适用于培育可稳定遗传的种子中高α-亚麻酸含量的安全性转基因作物。对于培育转基因水稻新品种具有重要的实际意义。
【专利说明】
培育种子中a-亚麻酸含量提高的安全转基因植物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种培育种子中a -亚麻酸含量提高的安全转基 因植物的方法。
【背景技术】
[0002] 不饱和脂肪酸是人体必需的脂肪酸。不饱和脂肪酸根据双键个数的不同，分为单 不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸两种。根据双键的位置及功能又将多不饱和脂肪酸分为 ?_3系列和w-6系列。a -亚麻酸、EPA、DHA属《_3系列，亚油酸、y-亚麻酸和花生四稀酸 属《_6系列。这些长链多不饱和脂肪酸是机体组织生物膜及一些重要器官（如：大脑皮层、 神经组织和视网膜等）的组成成分，起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用，同 时也是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等具有强烈生理活性的自身调节物的前体。《_3 脂肪酸脱氢酶（FAD3)是合成co-3系列不饱和脂肪酸的限速酶，能催化亚油酸生成a-亚 麻酸（图 1) (Virginia M. Ursin, 2003. J. Nutr. 133:4271 - 4274)，a -亚麻酸可以进一步转 化为EPA和DHA。亚油酸也可以进一步转化为y-亚麻酸，花生四烯酸。人类能够利用吸收的 糖和蛋白质来合成饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，体内拥有《_12、co-15、co-18脂肪酸脱 氢酶，可通过转化外源性摄入的亚油酸和a _亚麻酸来合成多不饱和脂肪酸，但是，由于人 体不存在《-3、co-6脂肪酸脱氢酶，所以，亚油酸和a-亚麻酸这两种脂肪酸必须从体外摄 取。人类在千万年的进化过程中，这两类不饱和脂肪酸比例始终维持在1:1左右（Eaton et al.，1998. World Review of Nutrition and Dietetics. 83:12 - 23)。而当今社会人工种植 和养殖的农畜产品中，《-3不饱和脂肪酸含量极低，导致人类体内co-6和《-3的比例已由 正常的 1:1 跃升为 15:1 ~20:1 (Simopoulos, 2001. lipids. 36suppl: s83 - 89)。科学研究证 明，这种比例严重失调的脂肪酸饮食摄入会直接或间接地诱发多种疾病，如：冠心病、心律 不齐、动脉硬化、血栓、高血压、过敏、炎症、老年痴呆、抑郁症、视力下降、记忆力衰退、骨质 疏松、免疫力下降、自闭症、糖尿病、癌症等（Stark et al.，2008. Nutr. Rev. 66:326 - 332)。 因此，及时有效补充《-3不饱和脂肪酸，将人体内co-6和c〇-3的比例调节到合适状态，是 科学营养、回归平衡饮食结构的迫切需要。
[0003] a-亚麻酸是EPA、DHA等《-3系列多不饱和脂肪酸的合成前体，a-亚麻酸 的摄入量直接决定着《_6和《-3系列不饱和脂肪酸的比例。为此，联合国卫生组织和 世界粮油组织建议，在每日膳食中亚油酸与a-亚麻酸的适当比例为5:1，a-亚麻酸的 成人日摄入量为2.22克（3;[1]1(^〇111〇8,2001.11口1(18.368即口1:883 - 89)。（1-亚麻酸的 现行膳食来源是一些深海鱼类和一些特定的种子植物，如：油菜、大豆、胡桃、亚麻、紫苏 等。但由于深海鱼类的昂贵价格及日益严重的海水重金属污染、种子植物有限的产量，使 得a-亚麻酸的摄入量远远不能满足人们的膳食需要。运用转基因方法在植物种子中合 成和积累高含量的a-亚麻酸可以解决这一问题。人类主要的食物来源是粮食作物，其大 多属于禾本科植物，例如水稻、小麦、玉米等。水稻是世界上食用人口最多、最重要的粮食 作物。虽然《_3脂肪酸去饱和酶基因在水稻种子胚和胚乳中均有所表达，但表达水平相 对一致而且非常低。因此，水稻种子中a-亚麻酸含量仅占约万分之三，亚油酸与a-亚 麻酸的比例更高达 25:l(Shimada，et al.，2000.Plant Biotechnol.l7:43_48)。利用转 基因方法，提高粮食作物种子中a-亚麻酸含量，是解决膳食中a-亚麻酸缺乏问题，进 而提高人们健康的有效途径。实现基因的高效表达必须在转录和转录后水平同时提高基 因表达。启动子主要在转录水平调控基因表达，终止子和3' -UTR则在转录和转录后水 平同时起调控作用，3' -UTR主要通过影响mRNA的亚细胞定位（Crofts et al.，Plant Physiol. 2004, 136:3414 - 3419 ;Hamada et al.，Plant Cell 2003,15:2265 - 2272)、维 持mRNA 稳定性（Bashirullah et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 2001，98:7025 - 7028 ;Drefus and Regnier, Cell 2002,111:611 - 613)以及保证翻译效率方面（Atwater et al.，Annual Rev Genet.1990, 24:519 - 541 ；Gutierrez et al.,Cell 1999,30:763 - 770 ；Hollams et al. , Neurochemistry Res. 2002, 27(10):957 - 980 ；Knirsch and Clerch, Biochemistry Biophys Res Commun. 2000, 272:164 - 168)来调控基因表达。Shimada 等（2000. Plant Biotechnol. 17:43 - 48)曾报道利用组成型启动子在水稻中过量表达《-3脂肪酸脱氢酶 基因可以提高种子中a-亚麻酸含量。然而利用组成型启动子驱动目的基因在植物生长 发育的整个时期和植物体所有组织高强度表达会带来潜在的不利影响，如：增加转基因植 株代谢负担和不必要的浪费等，同时目标器官种子中的a-亚麻酸含量仍然很低。Yang 等（Biotechnol Lett.2009, 31:1625 - 1631)曾报道 GluB-1 基因 3' -UTR 与 Nos 相比可 增强外源蛋白mDer f2在转基因水稻中的表达。为了使目的基因在植物体内高效表达，同 时又减少对植物的不利影响，针对组织特异性启动子和不同终止子及3' -UTR的研究和 应用越来越受到重视。本发明
【申请人】克隆和鉴定水稻胚乳特异性表达谷蛋白GluC基因 启动子，并获得专利授权（专利号：ZL200710098626. 0)，该启动子的活性是玉米泛素蛋白 启动子ubiqintin-1的活性的4. 9倍，而且它主要表达于水稻种子胚乳中心部位（Qu et al.，2008. J Exp Bot. 59:2417 - 2424)。同时
【申请人】克隆和鉴定水稻GluB-5基因终止子， 并获得专利授权（专利号：ZL201110197664. 8)，该终止子在增强基因的表达水平的同时不 会影响启动子的胚乳特异性表达（Li et al.，2012. Transgenic Res. 21 (3) : 545 - 553)。通 常人们所食用的稻米是指加工后的精米，是水稻种子的胚乳部分。因此，通过水稻胚乳特异 性强启动子过表达《_3脂肪酸脱氢酶基因，提高水稻精米中a_亚麻酸的含量，同时降低 亚油酸与a -亚麻酸含量的比例，从而得到具有医疗和保健功能的水稻具有重要的实际意 义。
[0004] 一般在转基因的转化系统中需要使用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因等作为 选择标记基因筛选转化细胞。本发明
【申请人】利用水稻谷蛋白GluC基因启动子，驱动0SFAD3 基因在水稻胚乳中特异性表达，转基因水稻种子中a-亚麻酸含量提高达27. 9倍（Liu et al.，2012. J Exp Bot. 63:3279 - 3287)，并获得专利授权（专利号：ZL201010199786. 6)。然 而，这些a-亚麻酸高含量的转基因水稻中含有选择标记基因（潮霉素磷酸转移酶基因， hpt)和外源胭脂碱合酶基因（N0S)终止子。选择标记基因存在于转基因植物中会对环境和 人类健康的安全性造成影响。选择标记基因转移到微生物中将增强病原微生物的抗药性， 从而引起抗生素失效；抗除草剂的抗性基因平行转移到野草中，会使其转化成难以控制的 害草，造成生态平衡的破坏（Dael, 1992. Plant Physiol. 100:13-15)。自2009年11月农 业部批准两种转基因水稻的安全证书以来，转基因水稻的商业化逐步进入轨道。但是，人们 仍然担心选择标记基因及其产物在食用时可能有毒性或引起过敏反应。在植物基因工程中 转入受体的许多基因是外源的，从生物安全性生态角度考虑，如果转基因作物的外源基因 向亲缘野生种转移，就会污染到整个种子资源基因库；从食品健康角度考虑，人们担心转入 了外源基因的作物含有对人体不利的成分，因此，培育无选择标记基因、无外源基因及外源 表达元件的安全转基因植物具有重要的意义。

【发明内容】

[0005] 本发明的一个目的是提供一种培育种子中a-亚麻酸含量提高且无选择标记的 转基因植物的方法。
[0006] 本发明所提供的培育种子中a _亚麻酸含量提高且无选择标记的转基因植物的 方法，具体可包括如下步骤：
[0007] (1)构建双T-DNA重组表达载体；
[0008] 所述双T-DNA重组表达载体存在两个独立的T-DNA结构域，在一个T-DNA结构域 中含有表达《 _3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒（记为表达盒1)，在另一个T-DNA结构域中含 有表达选择标记基因的表达盒（记为表达盒2);
[0009] 其中，所述T-DNA结构域为所述双T-DNA重组表达载体上含有T-DNA结构的区域。
[0010] 所述表达盒1由来源于受体植物的内源胚乳特异性启动子、内源《_3脂肪酸脱氢 酶基因和内源终止子连接而成；
[0011] (2)向所述受体植物中导入所述双T-DNA重组表达载体，得到同时表达所述《 -3 脂肪酸脱氢酶基因和所述选择标记基因的转基因植物（T。代）；
[0012] (3)将步骤（2)所得的同时表达所述co-3脂肪酸脱氢酶基因和所述选择标记基因 的转基因植物（T。代）自交，从自交后代中获得只表达所述co-3脂肪酸脱氢酶基因，且不 表达所述选择标记基因的转基因植物0\代）；
[0013] (4)从步骤（3)所得只表达所述《-3脂肪酸脱氢酶基因，且不表达所述选择标记 基因的转基因植物0\代）中获得与所述受体植物相比，种子中a_亚麻酸含量提高的转 基因植物。
[0014] 当然，所述方法还包括从只表达所述《 _3脂肪酸脱氢酶基因，且不表达所述选择 标记基因的1\代转基因植物的自交后代中筛选获得与所述受体植物相比，种子中a _亚麻 酸含量提高的纯合转基因植物的步骤。
[0015] 所述受体植物可为单子叶植物或胚乳型双子叶植物，如禾本科植物，更加具体如 水稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、大麦或黑麦。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述受体植物具体为水稻。
[0017] 在本发明的一个实施例中，在所述表达盒1中，来源于所述受体植物的所述内源 胚乳特异性启动子具体为水稻谷蛋白基因启动子；所述水稻谷蛋白基因启动子的序列为序 列表中序列1(自Genbank Accession Number为EU264107的V端起第1~2331位核 苷酸序列）；来源于所述受体植物的所述内源《_3脂肪酸脱氢酶基因具体为水稻co-3脂 肪酸脱氢酶基因；所述水稻《_3脂肪酸脱氢酶基因的序列为序列表中序列2(自Genbank Accession Number 为 AK071185 (GI: 32981208)的 5'端起第 223 ~1380 位核苷酸序列）； 来源于所述受体植物的所述内源终止子为水稻谷蛋白基因终止子；所述水稻谷蛋白基因终 止子的序列为序列表中序列3(自Genbank Accession Number为NC008395的Y端起第 8088533~8089029位核苷酸序列）。
[0018] 在所述方法中，所述表达盒2由35S启动子、所述选择标记基因和Nos终止子连接 而成；在本发明的一个实施例中，所述选择标记基因具体为潮霉素抗性基因。
[0019] 所述方法中，所述转基因植物可以包括通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组 织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或 其后代。
[0020] 本发明的第二个目的是提供一种双T-DNA重组表达载体。
[0021 ] 本发明所提供的双T-DNA重组表达载体，具体存在两个独立的T-DNA结构域，在一 个T-DNA结构域中含有表达co-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒（记为表达盒1)，在另一个 T-DNA结构域中含有表达选择标记基因的表达盒（记为表达盒2);
[0022] 所述表达盒1由来源于植物A的内源胚乳特异性启动子、来源于所述植物A的内 源co-3脂肪酸脱氢酶基因和来源于所述植物A的内源终止子连接而成。
[0023] 所述植物A可为单子叶植物或胚乳型双子叶植物，如禾本科植物，更加具体如水 稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、大麦或黑麦。
[0024] 在本发明的一个实施例中，所述受体植物具体为水稻。
[0025] 在本发明的一个实施例中，在所述表达盒1中，来源于所述植物A的所述内源胚乳 特异性启动子具体为水稻谷蛋白基因启动子；所述水稻谷蛋白基因启动子的序列为序列表 中序列1 (自Genbank Accession Number为EU264107的Y端起第1~2331位核昔酸序 列）；来源于所述植物A的所述内源co-3脂肪酸脱氢酶基因具体为水稻co-3脂肪酸脱氢酶 基因；所述水稻《_3脂肪酸脱氢酶基因的序列为序列表中序列2(自Genbank Accession Number为AK071185(GI: 32981208)的Y端起第223~1380位核苷酸序列）；来源于所 述植物A的所述内源终止子为水稻谷蛋白基因终止子；所述水稻谷蛋白基因终止子的序列 为序列表中序列3(自Genbank Accession Number为NC008395的5'端起第8088533~ 8089029位核苷酸序列）。
[0026] 在所述方法中，所述表达盒2由35S启动子、所述选择标记基因和Nos终止子连接 而成；在本发明的一个实施例中，所述选择标记基因具体为潮霉素抗性基因。
[0027] 在本发明中，所述双T-DNA重组表达载体具体是按照包括如下步骤的方法制备得 到的：
[0028] (a)构建中间载体pCDM-35S-Hpt-Nos :将pCAMBIA1301载体的酶切位点Sac II和 Sph I之间含T-Border的部分替换为序列表中序列5所示DNA片段后得到的重组质粒；
[0029] (b)将序列表中序列4的第7-2846所示的DNA片段正向插入到所述中间载体 pCDM-35S-Hpt-Nos的酶切位点Sma I处，得到重组载体pCDM-GB-Hpt ;
[0030] (c)将序列表中序列2所示的DNA片段正向插入到所述重组载体pCDM-GB-Hpt的 酶切位点Sma I和Sac I之间，得到所述双T-DNA重组表达载体。
[0031] 所述双T-DNA重组表达载体的构建方法也属于本发明的保护范围。
[0032] 所述双T-DNA重组表达载体在培育种子中a -亚麻酸含量提高且无选择标记的转 基因水稻中的应用也属于本发明的保护范围。
[0033] 本发明利用双T-DNA载体系统，将目的基因和选择标记基因分别插入双T-DNA表 达载体独立的T-DNA结构域，在转化植物的自交分离后代株系中，可以通过分子检测手段 筛选获得无选择标记的转基因水稻植株，同时转基因表达结构中的启动子、目的基因及终 止子均来源于受体植物本身，因而可以避免转基因操作将外来异源性基因表达结构引入转 基因植物对受体植物带来的致病性、毒性、过敏性等安全性影响。本发明通过对代转基 因植株进行PCR分析，筛选得到不含有选择标记基因的代转化植株。对T 2代无选择标 记转基因水稻种子中a -亚麻酸含量的气相色谱分析检测结果表明，在稳定遗传的T2代转 基因水稻中，0sFAD3转基因水稻株系的种子中a -亚麻酸含量最高可达5. 48±0. 37mg/g， a _亚麻酸与亚油酸的比值高达0. 67:1。每天食用400克稻米就可以达到联合国卫生组织 建议的a-亚麻酸成人日摄入量标准。说明本发明方法可利用种子作生物反应器生产人体 必须的《 _3多不饱和脂肪酸，得到a-亚麻酸含量提高和亚油酸含量降低的植物种子。本 发明可在不引入外源表达结构的前提下改良种子品质，适用于a-亚麻酸安全性大规模生 产和培育可稳定遗传的种子中高a-亚麻酸含量的安全性转基因作物。对于培育转基因水 稻新品种具有重要的实际意义。
【附图说明】
[0034] 图1为哺乳动物和植物中w-6和《-3系列脂肪酸代谢途径示意图。
[0035] 图2为从水稻cDNA中PCR扩增《 -3脂肪酸脱氢酶的电泳图谱。
[0036] 图3为双T-DNA植物表达载体pCDM-GB/Hpt的构建示意图。
[0037] 图4为GluC启动子、GluB5基因终止子融合水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因的双 T-DNA载体pCDM-GFB/Hpt的结构示意图。
[0038] 图5为转pCDM-GFB/Hpt载体T。代水稻植株PCR分析的电泳图谱。
[0039] 图6为转pCDM-GFB/Hpt载体的1\代水稻植株利用与0sFAD3基因的嵌合引物和 潮霉素基因引物进行PCR分析的电泳图谱。A为0sFAD3基因的嵌合引物扩增结果；B为潮 霉素基因引物扩增结果。
[0040] 图7为转pCDM-GFB载体的T2代水稻植株的Southern杂交结果。A为以潮霉素基 因为探针的Southern杂交结果；B为以0sFAD3为探针的Southern杂交结果。
[0041] 图8为转pCDM-GFB/Hpt载体的代水稻种子以潮霉素基因为探针的Northern杂 交结果。
[0042] 图9为转pCDM-GFB/Hpt载体的代水稻种子的Western杂交结果。
[0043] 图10为转pCDM-GFB载体的T3代水稻植株种子中脂肪酸的气相色谱分析结果。
[0044] 图11为1\、T2、T3代转基因植株和非转基因植株中a -亚麻酸含量分析结果。DW 表示干重；a -ALA即表示a -亚麻酸。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 水稻宁粳1号：记载于"王宝祥，江玲，陈亮明等.水稻黑条矮缩病抗性资源的 筛选和抗性QTL的定位[J].作物学报，2010, 36(8) =1258-1264. "一文，公众可从中国科学 院植物研究所获得。
[0048] 农杆菌 EHA105 :记载于 "Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS et al (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res 2:208 - 218"一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。
[0049] pCAMBIA1301 载体：记载于 "Lee and Gelvin. T-DNA binary vectors and systems. 2008. Plant Physiol. 146:325 - 332" 一文，公众可从中国科学院植物研究所获 得。
[0050] 实施例1、种子中a -亚麻酸含量提高且无选择标记的转基因植物的构建及鉴定
[0051] -、水稻《_3脂肪酸脱氢酶基因的获得
[0052] 从GenBank中查找水稻《-3脂肪酸脱氢酶核苷酸序列（GenBank号为AK071185)， 设计引物扩增水稻《_3脂肪酸脱氢酶基因（0sFAD3)。为便于载体构建，在每对引物上依次 添加两个酶切位点。
[0053] 水稻《 -3脂肪酸脱氢酶基因扩增引物：正向引物为F2 :5' -AACCCGGGATGGCGGCGTC GGCGACCCA-3'（下划线部分为Smal的识别位点），反向引物为R2 :5' -AAGAGCTCTCACTTGTGC TTAGCATCTT-3'（下划线部分为Sac I的识别位点）。
[0054] 用Trizol试剂盒（购自Invitrogen公司），从开花后12天的水稻Kitaake (Oryza sativa L.cv.Kitaake，Qu and Takaiwa, Plant Biotech J 2004, 2:113 - 125,中国科学院 植物研究所已经保存）叶片中提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书（购自Promega公司）， 以2 y g总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA。以水稻cDNA为模板，以F2和R2为引物， 进行PCR扩增水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因序列。反应体系为25yl:cDNA lyl，正向引物 (10pM) 1 y 1，反向引物（10pM) 1 y l，dNTP 混合物（10mM) 1 y l，ExTaqDNA 聚合酶 lOXbuffer 2. 5 y 1，水 18. 3 y 1，ExTaqDNA 聚合酶（5U/ y 1)0. 2 y 1。反应程序为：94°C预变性 5min，然 后 94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，36 个循环，最后 72°C，10min。
[0055] PCR扩增得到约1. 2kb的目的条带（图2,图中，第1泳道为分子量标准，第2泳 道为水稻的《_3脂肪酸脱氢酶基因）。回收扩增产物，直接连接到PMD18-T载体（购自 TaKaRa公司）上，进行测序，结果表明，扩增得到的水稻co-3脂肪酸脱氢酶基因序列大小 约为1158bp，该扩增序列与自Genbank Accession Number为AK071185的5'端第223~ 1380位核苷酸序列完全一致（序列2)，编码的氨基酸序列为自Genbank Accession Number 为BAG92361的氨基端第1~385位氨基酸残基。将测序检测表明含有水稻co-3脂肪酸脱 氢酶基因片段的重组载体命名为pMD-〇sFAD3。
[0056] 二、表达《 -3脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA植物表达载体构建与遗传转化
[0057] 1、GluC基因启动子、GluB5基因终止子融合水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因的双 T-DNA植物表达载体构建
[0058] (l)pCDM-35S-Hpt-Nos 中间载体的构建
[0059] 将PCAMBIA1301载体用Sac II和Sph I双酶切，平末端化得到片段1 (得到线性 化载体骨架，不含有T-Border的部分）；以pCAMBIA1301载体为模板，用引物P1/P2扩增，回 收扩增得到大小为2065bp的片段2 (含有CaMV35S启动子、潮霉素基因以及CaMV35S polyA 终止子），平末端化回收得到片段2 ;以pCAMBIA1300-MAR(GenBank :EU849664. 1)为模板， 分别用引物P3/P4及P5/P6扩增得到797bp的片段3 (包含增强外源基因表达的MAR序列） 和895bp的片段4 (包含增强外源基因表达的MAR序列）。片段3和片段4用EcoR I酶切 消化后连接，得到片段5。片段2和片段5经测序验证正确后，与线性化的载体即片段1连 接，得到中间载体pCDM-35S-Hpt-Nos。
[0066] 中间载体pCDM-35S-Hpt-Nos的结构描述：将pCAMBIA1301载体的酶切位点Sac II 和Sph I之间含T-Border的部分替换为序列表中序列5所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0067] (2)双T-DNA植物表达载体pCDM-GB/Hpt的构建
[0068] 利用Hind III和EcoR I双酶切序列表中序列4所示DNA片段（自5'端至3'端依 次为Hind III识别序列、GluC启动子、多克隆位点、GluB5终止子和EcoR I识别序列），胶 回收后用Klenow补平Hind III和EcoR I酶切位点的粘性末端，获得含有GluC启动子（序 列1，与自Genbank Accession Number为EU264107的Y端起第1~2331位核昔酸序列 一致）、多克隆位点及GluB5终止子（序列3,与自Genbank Accession Number为NC008395 的Y端起第8088533~8089029位核苷酸序列一致）的一个T-DNA表达盒片段，正向插入 到步骤（1)构建好的中间载体pCDM-35S-Hpt-Nos的Sma I位点处，得到的重组质粒命名为 pCDM-GB/Hpt (图 3)。
[0069] 双T-DNA植物表达载体pCDM-GB/Hpt的结构描述：在中间载体pCDM-35S-Hpt-Nos 的酶切位点Sma I处正向插入序列表中序列4的第7-2846位所示DNA片段的重组质粒。
[0070] 双T-DNA植物表达载体pCDM-GB/Hpt包含两个独立的T-DNA，其中一个T-DNA包含 35S启动子、Hpt潮霉素抗性基因和Nos终止子，另一个T-DNA包含GluC启动子、多克隆位 点和GluB5终止子。
[0071] (3)双T-DNA植物表达载体pCDM-GFB/Hpt的构建
[0072] 用Sma I和Sac I双酶切pMD_0sFAD3质粒，回收含有水稻《 -3脂肪酸脱氢酶基 因的约1158bp的酶切片段，插入到双T-DNA表达载体pCDM-GB/Hpt的相应酶切位点之间。 将经测序表明在pCDM-GB/Hpt双T-DNA表达载体的酶切位点Sma I和Sac I之间插入了序 列表中序列2所示DNA片段的重组载体命名为pCDM-GFB/Hpt，pCDM-GFB/Hpt为含有水稻 ?_3脂肪酸脱氢酶基因0sFAD3的双T-DNA植物表达载体（图4)。pCDM-GFB/Hpt中的一个 T-DNA结构域包含由GluC启动子和GluB5终止子控制的水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因表达 结构，另一个T-DNA结构域包含由35S启动子和Nos终止子控制的Hpt潮霉素抗性基因表 达结构。
[0073] 2、转pCDM-GFB/Hpt植物表达载体水稻的获得
[0074] 用冻融法将pCDM-GFB/Hpt导入农杆菌EHA105中，然后通过农杆菌介导法转化水 稻宁粳1号的胚性愈伤组织。利用潮霉素筛选方法（按照文献Hiei et al. 1994.Plant J. 6:271 - 282所述方法进行），获得493株T。代转基因植株。
[0075] 三、转基因水稻植株的分子检测
[0076] 1、对转GFB/Hpt水稻植株进行PCR检测
[0077] (1) T。代转GFB/Hpt水稻的PCR检测
[0078] 从上述筛选得到的T。代转GFB/Hpt水稻植株中随机选取30株，利用PCR方法进行 PCR分子检测。用于检测转pCDM-GFB/Hpt植物表达载体再生植株的引物为pGluC与0sFAD3 嵌合引物，具体序列如下：
[0079] Abl :5' -TCCAACTCGTCCATCCATCACC-3'(序列表中序列 1 的第 2281-2302 位）；
[0080] Ab2 :5 ' -GCTCGGCAGAAAGTGAGATCCG-3'(序列表中序列 2 的第 579-600 位）。
[0081] 理论上，阳性扩增产物大小约为650bp。
[0082] PCR反应体系为25 y 1 :基因组DNA 1 y 1，正向引物（10pM) 1 y 1，反向引物 (10pM) 1 y 1，dNTP 混合物（10mM) 1 y 1，rTaqDNA 聚合酶 lOXbuffer 2. 5 y 1，水 18. 3 y 1， rTaqDNA 聚合酶（5U/ y 1) 0. 2 y 1。反应程序为：94 °C 预变性 5min，然后 94 °C 30sec， 55°C 30sec，72°C 1. 5min，36个循环，最后72°C，lOmin。PCR扩增得到600bp的目的条带即 为检测阳性。实验设置未转基因的水稻宁粳1号作为阴性对照，同时以pCDM-GFB/Hpt质粒 作为模板的阳性对照。
[0083] 结果表明：得到29株PCR检测阳性的转GFB/Hpt水稻T。代植株（图5)。图中M 为分子量标准，+为质粒模板阳性对照，NT为非转基因阴性对照，第1~30泳道分别为转 pCDM-GFB/Hpt水稻表达载体的再生植株。
[0084] (2) 1\代转基因水稻的PCR检测
[0085] 将步骤（1)鉴定阳性的T。代转GFB/Hpt水稻植株进行自交，对所得到的代遗传 分离群体转基因植株进行PCR检测。
[0086] 检测转入的《 -3脂肪酸脱氢酶基因的引物为pGluC与0sFAD3嵌合引物：正 向引物为Abl，反向引物为Ab2 (具体引物序列同上），PCR扩增得到650bp的目的条带 即为检测阳性；检测潮霉素基因的引物为Hptl :5' -CAAGACCTGCCTGAAACCGA-3'，Hpt2 : 5' -TTCTGCGGGCGAITTGTGTA-3'，PCR扩增得到600bp的目的条带即为检测阳性。
[0087] PCR反应体系与上述用于鉴定T。代转GFB/Hpt水稻的PCR反应体系相同。实验 设置未转基因的水稻宁粳1号作为阴性对照，同时以pCDM-GFB/Hpt质粒作为模板的阳性对 照。
[0088] 结果表明：嵌合引物检测的46株植株中，13株为0sFAD3转基因检测阴性样品，其 余33株均为0sFAD3转基因检测阳性样品（图6中A)。潮霉素基因的引物检测的46棵植 株中，8株为hpt基因检测阴性样品，其余38株均为hpt基因检测阳性样品（图6中B)。图 中M为分子量标准，+为质粒模板阳性对照，NT为非转基因阴性对照，第1~46泳道分别为 转pCDM-GFB/Hpt水稻表达载体的再生植株。
[0089] PCR检测阳性的T。代转GFB/Hpt水稻所结的种子和由该种子长成的植株为T i代， 依此类推，T2、1~3分别表示转基因植株第2代和第3代。
[0090] 2、1~2代无选择标记转GFB水稻植株的筛选
[0091] 培育经步骤1鉴定获得的1\代为具有0sFAD3(+)hpt(_)的转GFB/Hpt植株自交 所得到的T 2代遗传分离群体，采用如上步骤1 (2)的方法进行PCR鉴定，最终获得5个无选 择标记的转0sFAD3基因纯合株系汀2代及自交产生的后代均可采用嵌合引物扩增得到大 小约为650bp的目的条带，但是采用潮霉素基因引物扩增得不到大小约为600bp的目的条 带）。将无选择标记的转0sFAD3基因株系命名为GFB。
[0092] 3、T2代转GFB水稻纯合植株的Southern杂交检测
[0093] 用CTAB法提取具有0sFAD3 (+) hpt (-)的T2代纯合转0sFAD3基因株系水稻植株叶 片的基因组DNA，约40 y g DNA加入50单位EcoR I充分酶切后，经0. 8 %琼脂糖凝胶电泳分 离后，用〇? 4N的NaOH将DNA转移到带正电核的尼龙膜（购自Amersham pharmacia公司） 上。转移后的膜在含有7% (7g/100ml)SDS的0. 5M磷酸钠缓冲液中65°C预杂交5小时，用 〔a -32P〕dCTP随机引物法进行探针标记（购自中国福瑞公司）。用于转水稻《-3脂肪酸 脱氢酶基因植株的杂交探针序列为：Ab3 :5'-CACCCGATCACCGAGAAATTGT-3'（序列表中序列 2 的第 457-478 位）；Ab4 :5' -GAATACAAGATATGGGACACCG-3'（序列表中序列 2 的第 726-747 位）。用于潮霉素基因植株的杂交探针序列为：Hpt3 :5' -GCAAGGAATCGGTCAATACA-3' ；Hpt4 : 5' -TTCTACACAGCCATCGGTC-3'。65°C杂交 20 小时后，在含有 0? 1% SDS 的 2XSSC 中于 65°C 洗膜两次，每次15分钟，再在01% SDS的1XSSC中于65°C洗膜一次，15分钟。压X光片 24~48小时后，放射性自显影，以非转基因水稻宁粳1号为对照。
[0094] Southern杂交结果显示，5个转基因株系中都未能检测出潮霉素基因的杂交条带 (图7中A)，表明这五个纯合株系的标记基因已去除，5个转基因株系中都能检测出《 -3脂 肪酸脱氢酶基因的杂交条带，并且在不同的株系中，杂交条带的数目和出现的位置不完全 相同，这表明水稻的《_3脂肪酸脱氢酶基因已经成功整合到水稻基因组中，并且各个转基 因株系间是相互独立的转化个体（图7中B)。图中，NT为非转基因植株对照，1~5为T 2 代纯合转0sFAD3基因株系。
[0095] 4、1\代转GFB/Hpt水稻种子的Northern杂交检测
[0096] 用Trizol试剂盒提取上述5个无选择标记的转0sFAD3基因水稻植株开花后12 天的1\代水稻种子的总RNA，约20 y g总RNA经1. 2%琼脂糖凝胶电泳分离后，用20X SSC 将RNA转移到带正电核的尼龙膜（购自Amersham pharmacia公司）上。用〔a -32P〕dCTP 随机引物法进行探针标记（购自中国福瑞公司）。用于转水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因植株 的杂交探针序列为：5' -CACCCGATCACCGAGAAATTGT-3'（序列表中序列2的第457-478位）； 5' -GAATACAAGATATGGGACACCG-3'（序列表中序列 2 的第 726-747 位）。65°C杂交 20 小时后， 在含有0. 1%SDS的2XSSC中于65°C洗膜两次，每次15分钟，再在0. 1%SDS的1XSSC中 于65°C洗膜一次，15分钟。压X光片24~48小时后，放射性自显影，以非转基因水稻宁粳 1号为对照。
[0097] Northern杂交结果显示，在转0sFAD3基因水稻种子中，与非转基因对照植株相 比，该基因在转录水平呈现不同程度的提高（图8)。图中，第1泳道为非转基因植株对照， 2~6泳道为代转0sFAD3基因水稻植株。这表明在转基因植株种子胚乳中，GluC基因 启动子和GluB5基因终止子可以在转录水平上有效、特异地驱动和调控水稻-3脂肪酸脱 氢酶基因的表达。
[0098] 5、代转GFB/Hpt水稻种子的Western杂交检测
[0099] 从代转GFB/Hpt水稻的成熟种子中提取总蛋白，种子充分研磨后，加入抽提缓 冲液（配方：〇? 05M Tris-Hcl，10%体积分数的甘油，10mM PMSF，pH7. 0)，在 13000g 离心 10 分钟，收集上清，加入上样缓冲液（配方：12. 5mM Tris，pH6.8,20%体积分数的甘油，2% (28/1001111)303,0.001%(0.0018/1001111)溴酚蓝，2%体积分数的0.3112-]\^)，于沸水中加 热2分钟。经过12% (12g/100ml)SDS-PAGE胶电泳后，用半干法将蛋白转移到PVDF膜上 (购自Millipore公司）。膜依次进行封闭、漂洗、一抗（制备方法见下文）孵育、漂洗、二 抗孵育（山羊抗兔抗体，购自Sangon Biotech公司产品，其产品目录号为AB10058)、漂洗、 ECL超敏发光液反应（购自Amersham Biosciences公司）、压片、显影、定影、扫描，以非转 基因水稻宁粳1号为对照。
[0100] 其中，"一抗"的制备方法如下：
[0101] ⑴用 5' -CACCCGATCACCGAGAAAIT-3'（序列表中序列 2 的第 457-476 位）和 5' -TACAAGATATGGGACACCG-3'（序列表中序列 2 的第 726-744 位）引物对，以 0sFAD3cDNA 为 模板，扩增0sFAD3序列表中序列2的457~744bp片段，扩增产物连接到pMD? 18-T载体 (购自Takara公司，目录号为6011)中。
[0102] ⑵经过测序确认正确后，利用pMD浓18-T载体上的EcoR I和Xho I酶切位点， 将扩增片段连接到PGEX-4T-1原核表达载体（北京中原领先科技有限公司产品，目录号为 28-9545-49)相应酶切位点中，构建好的载体命名为pGEX-〇sFAD3。pGEX-〇sFAD3的结构描 述为：在PGEX-4T-1载体的酶切位点EcoR I和Xho I之间插入了序列表中序列2的第457~ 744bp所示DNA片段的重组质粒。利用pGEX-4T-l原核表达载体的第一个ATG进行蛋白的 诱导表达。
[0103] ⑶将构建好的原核表达载体pGEX-〇sFAD3转化到Eschrichia coli BL21细胞中， 当菌液0D600 = 0. 6时，加入终浓度为0. 5mM的IPTG，37°C诱导蛋白3hr。
[0104] ⑷收集菌体，重悬于PBS中，超声波破碎细胞后，10, OOOrpm离心，弃上清，沉淀重 悬于PBS溶液中，100°C 5min蛋白变性后，点样进行SDS-PAGE电泳。
[0105] (5)电泳完毕后，加至少5倍体积的染色液浸泡凝胶，放在平缓摇动的小摇床上室 温染色4hr以上；换脱色液，平缓摇动4~8hr，其间更换3~4次脱色液；然后直接挖出含 目的蛋白的丙烯酰胺凝胶，并液氮研磨成粉末溶解于生理盐水中，交由中国科学院遗传与 发育生物学研究所免疫兔子，进行多克隆抗体制备（一抗制备）。
[0106] Western杂交结果显示，与非转基因植株对照相比，转基因株系中水稻的《_3脂 肪酸脱氢酶基因的蛋白表达水平有不同程度的增加（图9)。图中，第1泳道为非转基因植 株对照，2~6泳道为代转0sFAD3基因水稻种子。
[0107] 四、T3代转GFB水稻种子a -亚麻酸的气相色谱分析
[0108] 取具有0sFAD3 (+) hpt (-)的5个1~2代纯合转0sFAD3基因株系水稻植株自交 所得的T3代成熟种子，将其研磨成细粉，装入事先装有10 y 1(6 yg) 17:0脂肪酸内标 (Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为H4515)的带塞玻璃试管中，在试管中加入 1.5ml硫酸甲醇溶液（5%硫酸+95%甲醇，％表示体积分数）充氮气后密封。将试管放在 85°C水浴1小时，冷却后加入1. 5ml正戊烷和lml水终止甲基化反应，振荡后2500rpm离心 10分钟，收集上清液，氮气吹干后加入20 y 1重蒸的正己烷，取1 y 1样品进行气相色谱分 析。
[0109] 气相色谱仪器型号为惠普HP6890GC，色谱柱为HPINN0WAX，柱长30m，内径0. 25mm， 涂层厚度0. 25 y m，柱箱温度设置为梯度升温（170~210°C，5°C /min)。以非转基因水稻 Kitaake为对照。
[0110] 按照气相色谱仪的测定条件，首先用脂肪酸甲酯混合标准溶液（Sigma-Aldrich 公司产品）定性，以标准图谱库形式保存，用气相色谱仪测定样品后得到色谱图，利用气相 色谱仪所带的标准图谱库的数据进行自动检索，鉴定出主要色谱峰对应的物质名称，并使 用数据处理系统对色谱峰进行面积归一化处理，从而计算出各物质相对含量。
[0111] 结果显示，在5个过表达水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系中，每克 稻米中a -亚麻酸的含量最低值为5. 21±0. 15mg，最高值为5. 48±0. 37mg，平均值为 5. 35±0. 28mg。与非转基因对照植株相比，a -亚麻酸的含量提高了 12. 3~12. 9倍，平均 值为12. 6倍（表1)。
[0112] 表1 T3代转GFB水稻种子中a -亚麻酸含量
[0114] 注：表1中，NT为非转基因阴性对照，1~5分别为转GFB植物表达载体的再生植 株。16:0为棕榈酸；17:0为十七碳脂肪酸（内标）；18:0为硬脂酸；18:1为油酸；18:2为 亚油酸；18:3为a-亚麻酸。18:2/18:3为亚油酸与a-亚麻酸的比值；以上数据是三次重 复的平均值，土为3个样品的SD。
[0115] 对编号1的T3代过表达水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因转基因株系进行气相色谱分 析，结果显示，与非转基因对照植株相比，a -亚麻酸的峰值呈现近13倍的跃迀（图10)。 图中，NT为非转基因阴性对照，G03为转GFB水稻T3代的再生植株株系。16:0为棕榈酸； 17:0为十七碳脂肪酸（内标）；18:0为硬脂酸；18:1为油酸；18:2为亚油酸；18:3为a -亚 麻酸。
[0116] 五、T3代转GFB水稻植株农艺性状调查
[0117] 在正常的田间管理，不使用药剂的条件下，对宁粳1号的非转基因和纯合无选择 标记的转0sFAD3基因株系进行了基本农艺性状调查。
[0118] 结果表明，转基因水稻植株内整齐一致，转基因植株的主要农艺性状株高、穗长、 每穗粒数、结实率和千粒重与非转基因对照间无显著差异（P>〇. 05)，表明过量表达0SFAD3 没有影响水稻的正常生长发育及主要农艺性状（表2)。
[0119] 表2 T3代转GFB水稻植株农艺性状调查
[0120]
[0121] 注：表2中，NT为非转基因样品，G03为转GFB水稻1~3代的再生植株。
[0122] 六、1\、T2、T3代转基因水稻种子a -亚麻酸的气相色谱分析
[0123] 选取a _亚麻酸含量最高的株系，将10粒种子处理后上样进行a _亚麻酸的气相 色谱分析，具体操作见步骤四。
[0124] 结果显示：在代过表达水稻《-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系中，每 克稻米的a -亚麻酸含量依次为5. 52mg、5. 44mg、5. 48mg(图11)，图中，1为非转基因植株 对照，2为转GFB载体的水稻植株。这表明在GluC启动子驱动和GluB5终止子表达调控下， 过表达的水稻《_3脂肪酸脱氢酶基因可以稳定遗传到T 3代。
【主权项】
1. 一种培育种子中α -亚麻酸含量提高且无选择标记的转基因植物的方法，包括如下 步骤： (1) 构建双T-DNA重组表达载体； 所述双T-DNA重组表达载体含有两个独立的T-DNA结构域，在一个T-DNA结构域中含 有表达ω -3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒，在另一个T-DNA结构域中含有表达选择标记基因 的表达盒； 所述表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒由来源于受体植物的内源胚乳特异性启动 子、内源ω-3脂肪酸脱氢酶基因和内源终止子连接而成； (2) 向所述受体植物中导入所述双T-DNA重组表达载体，得到表达所述ω-3脂肪酸脱 氢酶基因和所述选择标记基因的转基因植物； (3) 将步骤（2)所得的表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因和所述选择标记基因的转基因 植物自交，从自交后代中获得表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因，且不表达所述选择标记基 因的转基因植物； (4) 从步骤（3)所得表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因，且不表达所述选择标记基因的 转基因植物中获得与所述受体植物相比，种子中α-亚麻酸含量提高的转基因植物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体植物为水稻。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：来源于所述受体植物的所述内源胚乳特 异性启动子为水稻谷蛋白基因启动子； 所述水稻谷蛋白基因启动子的序列为序列表中序列1。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：来源于所述受体植物的所述内源 ω-3脂肪酸脱氢酶基因为水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因； 所述水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的序列为序列表中序列2。5. 根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：来源于所述受体植物的所述内 源终止子为水稻谷蛋白基因终止子； 所述水稻谷蛋白基因终止子的序列为序列表中序列3。6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述表达选择标记基因的表达 盒由35S启动子、所述选择标记基因和Nos终止子连接而成； 所述选择标记基因具体为潮霉素抗性基因。7. 双T-DNA重组表达载体，其特征在于：所述双T-DNA重组表达载体存在两个独立的 T-DNA结构域，在一个T-DNA结构域中含有表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒，在另一个 T-DNA结构域中含有表达选择标记基因的表达盒； 所述表达ω -3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒由来源于植物Α的内源胚乳特异性启动子、 来源于所述植物A的内源ω -3脂肪酸脱氢酶基因和来源于所述植物A的内源终止子连接 而成。8. 根据权利要求7所述的双T-DNA重组表达载体，其特征在于：所述植物A为水稻；或 来源于所述植物A的所述内源胚乳特异性启动子为水稻谷蛋白基因启动子；所述水稻 谷蛋白基因启动子的序列为序列表中序列1 ;或 来源于所述植物A的所述内源ω-3脂肪酸脱氢酶基因为水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基 因；所述水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的序列为序列表中序列2 ;或 来源于所述植物A的所述内源终止子为水稻谷蛋白基因终止子；所述水稻谷蛋白基因 终止子的序列为序列表中序列3。9. 根据权利要求7或8所述的双T-DNA重组表达载体，其特征在于：所述表达选择标 记基因的表达盒由35S启动子、所述选择标记基因和Nos终止子连接而成； 所述选择标记基因具体为潮霉素抗性基因。10. 权利要求7-9中任一所述的双T-DNA重组表达载体在培育种子中α -亚麻酸含量 提高且无选择标记的转基因水稻中的应用。
【文档编号】A01H1/02GK106032539SQ201510115631
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月17日
【发明人】曲乐庆, 刘华梁, 殷志洁
【申请人】中国科学院植物研究所