一种抑制肿瘤生长和转移的短链核酸及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种抑制肿瘤生长的短链核酸及其应用。本发明所提供的短链核酸为如下(A)或(B)：(A)双链RNA：所述双链RNA由正义链(序列1)和反义链(序列2)组成；(B)由一条单链RNA(序列1)和一条单链DNA(将序列2中的U替换为T后所示序列)互补配对形成的嵌合双链。本发明所提供的短链核酸在动物水平能在体内有效抑制肿瘤的生长；在细胞水平能够抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭、抑制肿瘤细胞迁移和促进肿瘤细胞凋亡。因此，本发明所提供的短链核酸作为一种新型小核酸类的抗肿瘤药物，既能抑制体内肿瘤的生长，降低肿瘤扩散风险，也有望用于预防肿瘤切除或放疗、化疗后的残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。
【专利说明】
一种抑制肿瘤生长和转移的短链核酸及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制肿瘤生长和转移的短链核酸及其应用。
【背景技术】
[0002] microRNA是一类由内源基因编码的长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分 子。其在不同的物种间具有很高的同源性，可能调控着人类基因的l/SmicroRNAs参与调控 个体发育，细胞的增殖分化、周期等活动主要有三种方式:成熟的microRNA互补结合mRNA， RI SC特异降解革EmRNA抑制mRNA的翻译；成熟mi cr〇RNA在不影响mRNA稳定的前提下，与革巴 mRNA的3' UTR，抑制靶mRNA的表达;microRNA与剪切目标mRNA聚腺苷酸末端配对结合后，靶 mRNA被核酸外切酶水解，在转录后水平对靶mRNA进行负性调控。通过靶向不同的基因， microRNA实现其肿瘤细胞的功能调控。研究表明，越来越多的原癌或抑癌基因在肿瘤细胞 与正常组织间的表达存在显著差异，且与肿瘤的发生、发展存在关联性。运用microRNA的原 癌或抑癌基因的功能，利用相关技术，或可实现肿瘤精准治疗的可能。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的是提供一种短链核酸。
[0004] 本发明所提供的短链核酸，为如下(A)或(B):
[0005] (A)双链RNA:所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列 1所示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列；
[0006] (B)由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链:所述嵌合双链中的 所述单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换 为T后所示序列。
[0007] 在本发明中，所述(A)中，所述正义链的序列具体为序列表中序列1，所述反义链具 体为序列表中序列2。所述(B)中，所述单链RNA的序列具体为序列表中序列1，所述单链DNA 的序列具体为将序列表中序列2中的U替换为T后所示序列。
[0008] 根据需要所述短链核酸可经过如下修饰中的至少一种：
[0009] (1)对所述短链核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰(如磷酸二 酯键中的氧被硫取代）；
[0010] (2)对所述短链核酸的核苷酸序列中的核糖的-OH的修饰(如-OH经过甲氧基 取代、氟取代或者脱氧修饰）；
[0011] (3)对所述短链核酸的核苷酸序列中的碱基的修饰（如LNA等修饰;胆固醇、甲氧 基、硫代、氨基等修饰;3'或5'的特殊修饰，包括生物素、荧光基团及其它特殊标记）。
[0012] 进一步，所述短链核酸为化学合成，可以进行2'氟代甲氧基U^OMe)、 硫代(PS)和脱氧U^deoxy)化学修饰。修饰的短链核酸分子可分别表示如下:所述短链 核酸-2' -F、所述短链核酸-PS、所述短链核酸-2' -〇Me和所述短链核酸-2' -deoxy。或是核苷 酸序列的5' p、5'巯基、5' NH2、5' Choi、5-Me-dC修饰、5' TET、5' BiotinS' NH2、3' Choi、3' BHQ- ldlabcyl，或是C6S-S修饰等修饰。所述短链核酸分子有作用的重要肿瘤调控基因例如转 录因子Jun等，但不仅限于该靶基因。
[0013]进一步，含有所述DNA分子的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0014]本发明的第二个目的是提供一种应用。
[0015] 本发明所提供的应用，具体为:所述短链核酸或所述DNA分子或所述重组载体或重 组菌在如下任一中的应用：
[0016] (al)制备用于抑制肿瘤生长的药物，和/或抑制肿瘤生长；
[0017] (a2)制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物，和/或抑制肿瘤细胞增殖；
[0018] (a3)制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的药物，和/或抑制肿瘤细胞侵袭；
[0019] (a4)制备用于抑制肿瘤细胞迀移的药物，和/或抑制肿瘤细胞迀移；
[0020] (a5)制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物，和/或促进肿瘤细胞凋亡；
[0021] (a6)制备用于预防肿瘤复发的药物，和/或预防肿瘤复发。
[0022]其中，所述预防肿瘤复发具体为预防肿瘤摘除术或放化疗后残余肿瘤细胞导致的 肿瘤复发。
[0023]本发明的第三个目的是提供一种药物。
[0024] 本发明所提供的药物具有如下(al)-(a6)功能中至少一种，其活性成分为所述短 链核酸或所述DNA分子或所述表达盒、重组载体或重组菌；
[0025] (al)抑制肿瘤生长；
[0026] (a2)抑制肿瘤细胞增殖；
[0027] (a3)抑制肿瘤细胞侵袭；
[0028] (a4)抑制肿瘤细胞迀移；
[0029] (a5)促进肿瘤细胞凋亡；
[0030] (a6)预防肿瘤复发。
[0031]根据需要，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体应 当与本发明药物中的双链RNA分子相容。
[0032]进一步，所述药学上可接受的载体可为体内转染试剂，如脂质体，聚乙烯亚胺 (PEI)、阳离子纳米聚合物等。或是传统的药物载体，糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油 等渗缓冲液等。或者是新型药物载体制剂:大分子物质，如免疫球蛋白、白蛋白、纤维原、葡 萄糖等;经过或未经过改造的细胞，如白细胞、红细胞等;合成得到的生物可降解性大分子 脂质体，如静脉乳、磁性球剂、玉脂聚糖球等;合成的非生物降解性大分子，如半渗透微囊、 聚丙烯凝胶等。本发明的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种 类、发病情况、给药方式等因素中和考虑对病人进行有益的剂量施用。具体剂型可包括口服 液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成粉剂、片剂、胶囊 剂等多种其他剂型。较佳的制剂为保持短链核酸的效能、毒副作用低、给药途径适宜。
[0033]在本发明的实施例中，所述药学上可接受的载体具体为脂质体 Lipofectamine2000(Invitrogen)。相应的，所述药物中，所述短链核酸和所述 Lipofectamine2000的配比具体为(5_50)pmol: lyL，如（20_32)pmol: lyL，具体如20pmol: ly L，或者30pmol: 1此，或者50pmol: 1此。更加具体的，所述药物中，所述短链核酸溶液的浓度 为20wiiol/L，所述短链核酸溶液和所述Lipofectamine2000的体积配比具体为（1-1.6): 1， 如 1:1，或者 1.5:1，或者 1.6:1。
[0034]所述药物中还可以包括葡萄糖、生理盐水或者缓冲液等。
[0035]在本发明中，所述肿瘤具体为肝癌;所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞。更加具体的， 所述肝癌细胞为H印G2细胞或SK-HEP-1细胞。
[0036]实验证明，本发明所提供的短链核酸通过抑制肝癌肿瘤细胞内核转录因子Jun的 表达，实现抑制肿瘤生长的作用。在动物水平，将肿瘤细胞接种裸鼠，随后用所述短链核酸 治疗的实验证明所述短链核酸能在体内有效抑制肿瘤的生长。另外，在细胞水平，还证实了 本发明所提供的短链核酸具有抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭、抑制肿瘤细胞迀移 和促进肿瘤细胞凋亡的作用。因此，本发明所提供的短链核酸作为一种新型小核酸类的抗 肿瘤药物，既能抑制体内肿瘤的生长，降低肿瘤扩散风险，也有望用于预防肿瘤切除或放 疗、化疗后的残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发。
【附图说明】
[0037] 图1为CCK-8方法检测实施例1制备的-OH短链核酸抑制肿瘤细胞增殖的折线图；
[0038] 图2为实施例1制备的2' -OH短链核酸抑制肿瘤细胞侵袭的照片图和柱形图；
[0039] 图3为实施例1制备的-OH短链核酸抑制肿瘤细胞迀移的柱形图；
[0040] 图4为实施例1制备的-OH短链核酸促进肿瘤细胞凋亡的柱形图；
[0041 ]图5为实施例1制备的-OH短链核酸治疗肝癌动物实验结果的折线图。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] 下述实施例中所涉及的定量实验，均设置至少3个重复，结果取均值。
[0045] 5周龄的雄性裸鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司(BALB/CNude401)。
[0046] Hep G2细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(TCHu 72)。
[0047] SK-HEP-1细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(TCHu 109)。
[0048]实施例1、短链核酸的制备
[0049] 本发明中所述短链核酸为双链RNA;所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正 义链的序列为序列表中序列1所示序列（5' -ACUGGGCAGGGCUGUGGUGAGU-3')，所述反义链的 序列为序列表中序列2所示序列（5' -ACUCACCACAGCCCUGCCCAGU-3')。选用一条随机序列作 为阴性对照(NC)，NC的正义链的序列为:5' -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(序列3)，反义链的 序列为:5' -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'(序列4)。所述短链核酸和所述阴性对照序列中的 A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷 酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
[0050] 所述短链核酸及所述阴性对照由上海生工（Sangon)生物工程股份有限公司合成。 将本发明合成的由序列1和序列2组成的短链核酸命名为2Z-OH-短链核酸。当然，也可以将 所述双链RNA替换为由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链;所述嵌合双 链中的所述单链RNA的序列为序列表中序列1所示序列(5^
[0051 ] ACUGGGCAGGGCUGUGGUGAGIK^ )，所述单链DNA的序列为将序列表中序列2中的U替 换为T后所示序列 W -ACUCACCACAGCCCUGCCCAGU-30 ;
[0052]实施例2、2' -OH-短链核酸对肿瘤细胞增殖的影响
[0053] 将实施例1制备的-OH短链核酸和阴性对照粉末分别溶解于DEPC水中，配成终浓 度为20wii〇l/L的溶液。取对数期的肝癌细胞(IfepG2细胞和SK-HEP-1细胞），分别调整细胞悬 液浓度至5X10 5细胞/ml，按每孔lOOyL接种于96孔板;置于37°C，含5%C02的孵箱中使细胞 贴壁，培养过夜。转染时，分别将〇. 3yL的Y -OH短链核酸溶液(浓度为20wiiol/L)和0.3yL的 Lipofectamine2000(Invitrogen)稀释于25yL无血清培养液(Opti-MEM)中混勾，室温孵育5 分钟，然后将上述短链核酸溶液与Lipofectamine2000溶液混匀，于室温静置20分钟，将约 50yL的短链核酸-脂质体复合物加到细胞培养板中（细胞生长融合率为65% )，分别培养0、 24、48、72和96小时;小心吸去上清，加入90yL新鲜培养基，再加入10yL CCK-8，继续培养2.5 小时，在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值；同时设置调零孔(培养基，CCK-8)，每 组设置5个复孔。0D450的值越大，说明活细胞数越多，即细胞增殖能力越强；反之，0D450的 值越小，说明活细胞数越少，即细胞增殖能力越弱。
[0054] 结果如图1所示，图1表明转染实施例1制备的210H短链核酸的肿瘤细胞的增殖受 到明显抑制，与阴性对照组(NC)相比较，增殖速率明显降低。
[0055] 实施例3d' -OH-短链核酸抑制肿瘤细胞侵袭能力
[0056] 将实施例1制备的210H短链核酸按实施例2的分组及实验体系进行转染实验，转 染完成后，于37 °C，含5 % C02的孵箱中培养过夜，更换为含5 % (体积分数)FBS的培养基饥饿 培养24h。实验前，用含0.5% (体积分数)FBS的DMEM培养液按1:6稀释50mg/L Matrigel(BD 公司Matrigel TM货号354234)，取60yL包被transwell小室底部膜的上室面，放37°C5%C〇2 培养箱孵育4小时，吸弃上清。转染后的肝癌细胞PC-3及DU145以胰酶消化，血球计数板计 数，按5 X 103细胞/孔的浓度接种于transwel 1小室，下室加入血清浓度为20 %的培养基700 yL，37 °C 5 % C02培养48h。取出小室，PBS洗一次。加入预冷的甲醇-20 °C固定10min。弃净甲醇 后清洗三遍。用棉签轻轻刮去小室上表面的Matrigel胶，用roS洗上表面3次。拿出小室 倒置，风干。将小室放入新的24-we 11中，加入200yL 0.1 %结晶紫(配制方法:称取0.1 g结晶 紫加100ml冰乙酸溶解完全，摇匀即得），使膜浸没，37°C染色30min。用ddH20洗3次。小室风 干后，放入孔中，倒置显微镜下取若干视野，拍照计数，统计穿过膜的细胞数。穿过膜的肿瘤 细胞数越多，说明肿瘤细胞的侵袭能力越强;反之，穿过膜的肿瘤细胞数越少，说明肿瘤细 胞的侵袭能力越弱。
[0057]结果如图2所示，图2表明，与阴性对照组(NC)相比，转染了实施例1制备的2Z-OH短 链核酸的肿瘤细胞的侵袭能力受到明显抑制。
[0058]实施例-OH-短链核酸抑制肿瘤细胞迀移能力。
[0059]将实施例1制备的-OH短链核酸和阴性对照粉末分别溶解于DEPC水中，配成终浓 度为20wii〇l/L的溶液。取对数期肝癌细胞(HepG2细胞和SK-HEP-1细胞），分别调整细胞悬液 浓度至1.5X10 6细胞/ml。按1.5X106细胞/孔的浓度接种6孔板，混匀后于37°C5%⑶2培养 过夜。转染时，分别将8 y L的2' - 0 H短链核酸溶液（浓度为2 0 y m 〇 1 / L )和5 y L的 Lipofectamine2000(Invitrogen)稀释于250此无血清培养液(Opti-MEM)中混勾，室温孵育 5分钟，然后将上述短链核酸溶液与Lipofectamine2000溶液混匀，于室温静置20分钟，将约 500yL的短链核酸-脂质体复合物加到细胞培养板中（细胞生长融合率为85% )。转染后将6 孔板于37°C5%rad^养过夜，用20iiL枪头比着直尺，在6孔板中均匀画直线横穿过孔，每孔 三条。用TOS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入3 % (体积分数)FBS培养基。放入37 °C5 %⑶2 培养箱继续培养，分别于Oh、8、24、48h拍照。利用Image-ProPlus量出各照片划痕的面积及 长度，按划痕宽度值=划痕面积面积/划痕长度值，算出各划痕宽度;进而计算第48小时划 痕愈合率，第48小时划痕愈合率=(Oh划痕宽度-48h划痕宽度)/0h划痕宽度。划痕愈合率越 大，说明肿瘤细胞的迀移能力越强;反之，划痕愈合率越小，说明肿瘤细胞的迀移能力越弱。
[0060]结果如图3所示，图3表明，与阴性对照组(NC)相比，转染了实施例1制备的2Z-OH短 链核酸的肿瘤细胞的迀移能力受到明显抑制。
[0061 ]实施例5、2~0H-短链核酸促进肿瘤细胞凋亡。
[0062] 将实施例1制备的短链核酸按实施例4的分组及实验体系进行转染实验。转 染完成后，于37°C，含5%C02的孵箱中培养至48h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细 胞，微量离心机转速2000rpm，离心时间5min，弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000rpm，离 心时间5min收集细胞）。
[0063] 用400yL 1 XBinding Buffer(Mbchem M3036)重悬细胞，调整细胞浓度至为 1 X 106cells/ml。在细胞悬浮液中加入5yL AnnexinV-FITC，轻轻混勾后于2_8°C避光条件下孵 育15分钟。加入10此PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。1小时内用流式细胞仪 检测。没有荧光或者仅有很低背景荧光的为正常细胞;仅有较强绿色荧光的为早期凋亡细 胞;有红色和绿色双重荧光的为晚期凋亡细胞;仅有较强红色荧光的为坏死细胞。
[0064] 结果如图4所示，图4表明，与阴性对照组(NC)相比，转染了实施例1制备的2Z-OH短 链核酸的肿瘤细胞的凋亡比例明显更高，即实施例1制备的2Z-OH短链核酸能够促进肿瘤细 胞的凋亡。
[0065] 实施例6、-OH短链核酸对肿瘤生长的抑制作用
[0066]取对数生长期的肝癌细胞(HepG2细胞），制成单细胞悬液，调节细胞浓度7X 107个 细胞/ml。在5周龄的雄性裸鼠腹股沟中上部注射0.2ml细胞悬液，共注射10只，注射16天后， 皮下可见5mm3的实体瘤，开始用实施例1制备的2Z-OH短链核酸和阴性对照处理。将裸鼠分 为两组，一组为2Z-OH短链核酸处理组，一组为阴性对照组。方法如下：用不含RNA酶的无菌 水分别溶解-OH短链核酸及阴性对照，配成终浓度为20iimol/L的溶液，以 Lipofectamine2000(Invitrogen)为转染试剂，分别将150此短链核酸溶液(浓度为20M1O1/ 1)和100此的1^口(^6(^&111；[1162000(111￥；[1：1'08611)稀释于150此无血清培养液（(^1:;[-]\^]\〇中混 匀，室温孵育5分钟，然后将上述短链核酸溶液与Lip 〇fectamine2000溶液混匀，于室温静置 20分钟后，距肿瘤5mm左右进针，皮下潜行至肿瘤，多点缓慢注射，每只裸鼠100此，每隔两天 注射一次，共注射5次。再饲养三天后处死所有裸鼠，取出瘤体称重。注射肿瘤细胞（即接种 肿瘤细胞开始）16天后开始隔两天测量瘤体长短径，计算瘤体体积。计算公式为:V(mm 3) = 0.5父长径\短径2。
[0067]结果如图5所示，表明在肝癌的肿瘤模型上，2Z-OH短链核酸治疗的裸鼠肿瘤的体 积及重量均明显小于阴性对照处理组(NC)，说明所述2Z-OH短链核酸能明显抑制肿瘤的生 长。
【主权项】
1. 一种短链核酸，为如下(A)或(B): (A) 双链RNA:所述双链RNA由正义链和反义链组成，所述正义链具有序列表中序列1所 示序列，所述反义链具有序列表中序列2所示序列； (B) 由一条单链RNA和一条单链DNA互补配对形成的嵌合双链:所述嵌合双链中的所述 单链RNA具有序列表中序列1所示序列，所述单链DNA具有将序列表中序列2中的U替换为T后 所示序列。2. 根据权利要求1所述的短链核酸，其特征在于:所述(A)中，所述正义链的序列为序列 表中序列1，所述反义链为序列表中序列2; 所述(B)中，所述单链RNA的序列为序列表中序列1，所述单链DNA的序列为将序列表中 序列2中的U替换为T后所形成的序列。3. 根据权利要求1或2所述的短链核酸，其特征在于:所述短链核酸经过如下修饰中的 至少一种： (1) 对所述短链核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰； (2) 对所述短链核酸的核苷酸序列中的核糖的2' -OH的修饰； (3) 对所述短链核酸的核苷酸序列中的碱基的修饰。4. 编码权利要求1或2所述短链核酸的DNA分子。5. 含有权利要求4所述DNA分子的重组载体或重组菌。6. 权利要求1 _3中任一所述的短链核酸或权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所述 的重组载体或重组菌在如下任一中的应用： (al)制备用于抑制肿瘤生长的药物，和/或抑制肿瘤生长； (a2)制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物，和/或抑制肿瘤细胞增殖； (a3)制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的药物，和/或抑制肿瘤细胞侵袭； (a4)制备用于抑制肿瘤细胞迀移的药物，和/或抑制肿瘤细胞迀移； (a5)制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物，和/或促进肿瘤细胞凋亡； (a6)制备用于预防肿瘤复发的药物，和/或预防肿瘤复发。7. 具有如下(al)-(a6)功能中至少一种的药物，其活性成分为权利要求1-3中任一所述 的短链核酸或权利要求4所述的DNA分子或权利要求5所述的重组载体或重组菌； (al)抑制肿瘤生长； (a2)抑制肿瘤细胞增殖； (a3)抑制肿瘤细胞侵袭； (a4)抑制肿瘤细胞迀移； (a5)促进肿瘤细胞凋亡； (a6)预防肿瘤复发。8. 根据权利要求7所述的药物，其特征在于:所述药物还包括药学上可接受的载体。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药学上可接受的载体为 Lipofectamine2000 ;所述药物中，所述短链核酸和所述Lipofectamine2000的配比为（5-50)pmol:lyLo10. 根据权利要求6所述的应用或权利要求7-9中任一所述的药物，其特征在于:所述肿 瘤为肝癌;所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
【文档编号】A61P35/04GK106032533SQ201610633898
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2016年8月4日
【发明人】姜薇, 崔健
【申请人】北京信生元生物医学科技有限公司