应用microRNA-7抑制前列腺肿瘤生长及其肿瘤进程的制作方法

应用microRNA-7抑制前列腺肿瘤生长及其肿瘤进程的制作方法
【专利摘要】本发明涉及应用microRNA-7抑制前列腺肿瘤生长及其肿瘤进程。本发明通过构建稳定过表达miR-7的前列腺癌细胞亚克隆细胞系，并建立相应的裸小鼠皮下荷瘤动物模型，在体外及体内验证了miR-7抑制前列腺肿瘤细胞生长以及前列腺癌干细胞“干性维持”能力的作用。本发明发现稳定过表达miR-7后，可以靶向抑制PI3K/Akt信号通路的表达，降低Akt的活性，并显著下调其下游周期调控蛋白p21的磷酸化水平，促进了非磷酸化的p21蛋白的入核，从而在肿瘤细胞中实现了细胞周期进程的阻滞，抑制了肿瘤细胞的增殖能力。本发明在体内外均验证了miR-7具有抑制前列腺肿瘤生长以及肿瘤进程的作用。提示了miR-7这类天然核酸分子作为新型的小分子药物在前列腺癌的临床治疗中具有广阔的应用前景。
【专利说明】应用microRNA-7抑制前列腺肿瘤生长及其肿瘤进程

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微小RNA，microRNA-7 (miR-7)。在前列 腺癌细胞中稳定过表达miR-7可以有效地抑制肿瘤细胞的生长。同时，通过抑制前列腺癌 干细胞干性维持的能力，稳定过表达miR-7可以有效地抑制前列腺癌的肿瘤进程。提示了 将miR-7作为天然核酸类小分子药物可应用于针对前列腺癌的靶向基因治疗中。

【背景技术】
[0002] 前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，其中95%发病于60岁以上的老年群体中。 随着我国人口老龄化程度的加深，每年约有7-8万名前列腺癌新增病例，发病率以每年 25%-30%的速度增长，成为发病率增加最快的恶性肿瘤。在北京，上海，广州等沿海发达城 市，前列腺癌已经成为危害老年男性健康的重大疾病。因此，全面深入了解其肿瘤发生的机 制或能为相关的临床治疗提供全新的思路。已有的研究表明，如列腺癌的临床表现与目iu 盛行的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs)理论相一致[1]。传统观念认为，肿瘤是由 体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无 限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。临床上常规疗法（包括化疗、 放疗、激素疗法等）通常不能杀死肿瘤组织的所有肿瘤细胞。不能被杀死的肿瘤细胞和能 被杀死的肿瘤细胞显然具有不同的生物学特性。也就是说，肿瘤组织含有不同类型的肿瘤 细胞，不同的肿瘤细胞具有不同的分子生物特性。肿瘤组织在细胞和分子水平上是不均一 的。其中大多数细胞对常规疗法敏感，而那些小数目的对常规疗法不敏感的细胞，具有高致 瘤性，高迁移性，其生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，被称为"肿瘤干 细胞"，这就是"肿瘤干细胞"理论[2]。肿瘤干细胞理论在急性粒细胞白血病、乳腺癌、脑肿 瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和黑色素瘤的研究工作[3-10]中得到了支持：肿瘤干细胞 的存在、其干性的强弱，与肿瘤抵抗放化疗能力的强弱、上皮间充质转化以及肿瘤预后与复 发等肿瘤进程密切相关。这一理论为本发明重新认识前列腺肿瘤的起源和本质，以及临床 治疗提供了新的方向和视觉角度。
[0003] 对于前列腺癌干细胞，研究其基本生物学特性及相关的调控机制将有助于本发明 进一步认识前列腺癌的发生发展过程。其中，"干性维持"(maintenance of pluripotency) 能力是前列腺癌干细胞维持自身数量、保持自我更新和分化能力的必要条件[11]。已有的 研究表明多种因子及信号通路与前列腺癌干细胞"干性维持"能力的调控相关[12-16]。最 近的研究又进一步指出microRNAOniRNA)在前列腺癌干细胞"干性维持"的调控过程中发 挥了重要的作用[17-24]。
[0004] microRNA(miRNA)是一种内源的非编码小RNA，已有的研究表明，miRNA在包括前 列腺癌在内的多种肿瘤中都具有调控肿瘤发生发展的作用[24-26]。microRNA-7 (miR-7) 是近年来新发现的一种miRNA。在肝癌、结直肠癌、头颈癌、乳腺癌、胃癌、神经瘤等多种肿瘤 中已经证实miR-7能发挥显著的抑癌作用[25, 27-34]。但是miR-7是否在前列腺癌中发挥 抑癌基因的作用，是否通过调控前列腺癌干细胞的"干性维持"参与前列腺癌肿瘤进程的调 控，以及相关的作用机制都尚不明了。
[0005] 基于此，本发明通过构建稳定过表达miR-7的前列腺癌细胞亚克隆细胞系，并建 立相应的裸小鼠荷瘤动物模型，在体外、体内评估miR-7对于前列腺癌细胞的生长抑制作 用，以及对于前列腺癌干细胞"干性维持"能力的调控作用并且阐明其可能的作用机制。本 发明发现在前列腺癌细胞中稳定过表达miR-7有效地抑制了肿瘤细胞在体外、体内的生 长。同时miR-7能有效地抑制前列腺癌干细胞的"干性维持"能力，提示其具有通过调控前 列腺癌干细胞干性抑制肿瘤进程的能力。该发明对于改进已有的前列腺癌临床诊断与治疗 方案具有积极的借鉴意义，同时，将miR-7作为天然核酸类小分子药物可应用于针对前列 腺癌的靶向基因治疗中。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的是应用miR-7抑制前列腺肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤进程（通过削 弱前列腺癌干细胞的干性维持能力）。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供了 microRNA-7在作为PI3K/Akt信号通路的表达 抑制剂方面的作用。
[0008] 本发明还提供了 microRNA-7在作为KLF4的靶向抑制剂中的作用。
[0009] 本发明还提供了 microRNA-7在制备抑制前列腺肿瘤生长的药物中的应用。
[0010] 本发明还提供了 micr〇RNA-7在制备阻滞前列腺肿瘤细胞周期进程的药物中的应 用。
[0011] 本发明通过构建稳定过表达miR-7的前列腺癌细胞亚克隆细胞系，并建立相应的 裸小鼠皮下荷瘤动物模型，在体外及体内验证了 miR-7抑制前列腺肿瘤细胞生长以及前列 腺癌干细胞"干性维持"能力的作用。本发明发现稳定过表达miR-7后，可以靶向抑制PI3K/ Akt信号通路的表达，降低Akt的活性，并显著下调其下游周期调控蛋白p21的磷酸化水平， 促进了非磷酸化的P21蛋白的入核，从而在肿瘤细胞中实现了细胞周期进程的阻滞，抑制 了肿瘤细胞的增殖能力。
[0012] 本发明在前列腺癌细胞系中首次发现并鉴定了一个全新的miR-7的靶基因 KLF4(Kriippel-like factor4)。KLF4属于KLF转录因子家族，该家族的成员参与调控多种 基因的表达，这些基因涉及细胞分化，生长和凋亡等多种生物学过程，并与肿瘤的发生发展 过程密切相关[35, 36]。此外，KLF4已被证实与胚胎干细胞的"干性维持"密切相关。抑 制KLF4表达会减弱胚胎干细胞的"干性维持"能力[37]。在前列腺癌中本发明首次发现 miR-7通过靶向抑制KLF4的表达削弱了前列腺癌干细胞的"干性维持"能力。在稳定过表 达miR-7的前列腺癌细胞亚克隆细胞系中，通过细胞表面标记物⑶44、⑶133分选前列腺癌 干细胞（CD44+/CD133+)，本发明发现所得的前列腺癌干细胞在体外的成球能力以及体内的 再次成瘤能力显著下降，且已知的干性因子（KLF4，0ct4，Sox2, Nanog)的表达被显著抑制 了。
[0013] 本发明构建了鉴定miRNA靶标分子的荧光素酶报告系统：通过常规的分子生物学 方法，本发明以表达Firefly荧光素酶基因的phEW-luc质粒为骨架[40]，通过限制性内切 酶Bglll单酶切，插入人工合成的与需要研究的miRNA完全互补配对的序列（此处以miR-7 为例，但不限于此），构建阳性对照报告载体。该序列除两端包含Bglll酶切识别位点外， 在5'端和3'端还分别引入限制性内切酶Nhel和EcoRV的酶切识别位点（序列四）。通 过Nhel/EcoRV双酶切，可去除阳性对照序列并将质粒骨架线性化。通过常规PCR方法克 隆或人工合成靶标基因 mRNA的3'UTR序列，同时在其5'端和3'端分别引入限制性内切 酶Nhel (或其同尾酶Xbal)和EcoRV(或其他产生平末端的限制性内切酶）的酶切识别位 点。通过双酶切该片段，再与线性化的质粒骨架进行连接，构建含有靶标基因 mRNA3' UTR 序列的报告载体。将报告载体或阳性对照载体与表达Renilla突光素酶基因的内参质粒 pRL-cmv(购于美国promega公司）、需研究的miRNA的次级前体分子pre-miRNA(此处以 pre-miR-7为例，但不限于此）或其成熟分子的模拟物mimic，三者使用脂质体转染的方法 共转染人源的细胞系（此处以人的前列腺癌细胞系PC3为例，但不限于此）。转染后18? 24小时，使用双荧光素酶检测试剂盒（购于美国promega公司）检测并计算相对荧光素酶 的活性，考察预期的靶标基因是否确实受所研究的miRNA调控（此处以miR-7及其靶标基 因 KLF4为例，但不限于此，详见实施例2)。在本发明中，运用该系统，本发明首次在前列腺 癌中验证了一个miR-7的靶标基因 KLF4。
[0014] 本发明评估了 miR-7作为天然的核酸小分子药物应用于前列腺癌的靶向基因治 疗的可行性，为进一步的临床应用奠定基础。具体是通过构建一个在真核细胞中表达miR-7 的表达载体，运用嘌呤霉素抗性及EGFP荧光阳性联合筛选的方法构建稳定过表达miR-7的 前列腺癌亚克隆细胞系。以PC3为例，在其亚克隆细胞系PC3-miR-7中，miR-7的稳定表达 量相对于对照PC3-null增高了近26倍。建立相应的小鼠皮下植瘤模型后发现，PC3-miR-7 来源的肿瘤组织，接种后30天其肿瘤体积为对照组的0. 5倍，瘤重为对照的0. 44倍。其中， 用于真核细胞表达miRNA的表达载体、嘌呤霉素抗性及EGFP荧光阳性联合筛选构建稳定过 表达miRNA亚克隆细胞系的方法、用于鉴定miRNA靶标分子的荧光素酶报告系统、以及小鼠 皮下植瘤动物模型的建立，除了适用于评估miR-7抑制前列腺肿瘤生长的作用，也可应用 于评估其他miRNA调控肿瘤进程的作用，具有广泛的应用价值。
[0015] 本发明通过标记特定的前列腺癌干细胞的细胞表面分子通过流式细胞分选获 得前列腺癌干细胞：对于体外培养的亚克隆细胞系，本发明通过常规的0.05%胰酶（含 0. 02% EDTA)消化，完全培养基中和胰酶后离心收集细胞的方法；对于皮下植瘤获得的肿 瘤组织，本发明通过机械剪切，IV型胶原酶（1毫克/毫升）+胰酶消化（0. 01 % )，完全培养 基中和胰酶后离心收集细胞的方法，最终将?1〇8个细胞用基本培养基重悬于EP管中并定 容到100微升。同时加入APC标记的人的⑶44抗体[38]和PE标记的人的⑶133抗体[39] 各5微克（两种抗体均购于德国美天旎MACS公司），4°C避光孵育40?50分钟，离心去除 上清，用PBS重悬漂洗1?2次后，用含1% FBS的PBS重悬到适当的浓度进行流式细胞分 选。获取⑶44+⑶133+双阳性细胞和⑶44TD133_双阴性细胞。通过检测两群细胞干性相关 因子的表达（详见实施例7)、梯度稀释后体外成球能力分析（详见实施例8)、皮下成瘤能 力分析（详见实施例9)，结合已有的相关报道，验证CD44+CD133+双阳性细胞即前列腺癌干 细胞（S cell)，⑶44XD133^双阴性细胞为分化程度较高的非癌干细胞（NS cell)。结果显 示稳定过表达miR-7后前列腺癌干细胞（PC3-miR-7-S)的比例下降为对照组（PC3-null-S) 的〇. 75倍。将分选所得的细胞进行梯度稀释再次成瘤，发现PC3-miR-7-S来源的肿瘤在接 种后40天（接种量102个细胞）才有可见的瘤状突起，比PC3-null-S来源（对照）的肿 瘤出现瘤状突起的时间推迟了 10天。到接种后70天，其体积为对照组的0. 29倍，瘤重为 对照的0. 31倍。同样对于双阴（PC3-null-NS、PC3-miR-7-NS)的细胞群，进行该实验后也 发现PC3-miR-7-NS来源的肿瘤，接种后50天（接种量105个细胞），体积为对照组的0. 36 倍，瘤重为对照的〇. 45倍。其中，用于评价肿瘤干细胞"干性强弱"的梯度稀释小鼠皮下植 瘤模型，除了适用于评估miR-7抑制前列腺癌干细胞"干性维持"能力的作用，也可应用于 评估其他miRNA对不同肿瘤干细胞的"干性调控"作用，同样具有广泛的应用价值（详见实 施例9)。
[0016] 本发明建立了亚克隆细胞系及前列腺癌干细胞皮下成瘤小鼠模型：将对照及亚克 隆细胞系（分别稀释为1〇 6个细胞/50微升），或分选后获得的CD44XD133-双阴性细胞（稀 释为105个细胞/50微升、10 4个细胞/50微升两个梯度）及⑶44+⑶133+双阳性细胞（稀 释为103个细胞/50微升、10 2个细胞/50微升两个梯度）重悬于基本培养基中，在冰上与等 体积的metrogel (购于美国BD Bioscience公司）混勻后，使用胰岛素注射器注射于5周 龄无胸腺雄性裸小鼠（购于斯莱克实验动物公司）的大腿外侧皮下，建立相应的皮下成瘤 小鼠模型。在SPF级标准动物饲养房及独立净化饲养系统条件下进行饲养。在适当的时间 点观察，测量小鼠皮下瘤块的体积。待体积接近lcm 3时处死小鼠，摘除肿瘤组织，用于后续 的相关分析。对于接种了⑶44TD133^双阴性细胞或⑶44+⑶133+双阳性细胞后获取的肿瘤 组织，消化成单细胞后可用CD44, CD133作为标记物再次分选前列腺癌干细胞（双阳）及分 化程度较高的非癌干细胞（双阴），进行第二轮的梯度稀释成瘤分析，以此类推。该模型可 用于长程评估肿瘤干细胞的干性维持能力（详见实施例9)。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0018] 本发明在体内外均验证了 miR-7具有抑制前列腺肿瘤生长以及肿瘤进程（抑制前 列腺癌干细胞"干性维持"能力）的作用。提示了 miR-7这类天然核酸分子作为新型的小 分子药物在前列腺癌的临床治疗中具有广阔的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1 :使用双荧光素酶报告系统鉴定miRNA与靶标基因 mRNA3'UTR之间的互作。图 上方是成熟的KLF4mRNA的序列概图，通过序列比对提示在其3' UTR部分存在两个miR-7的 识别结合位点（黑色三角所示）。图下方是双荧光素酶报告系统检测的结果，表明在miR-7 存在的条件下，通过miR-7与KLF43' UTR的互作，能有效地降低Firefly荧光素酶的表达， 与scramble RNA对照相比能显著降低相对突光活性（p < 0. 01)。这一结果提示了 miR-7 能特异性地与KLF43' UTR互作，并在转录后水平上调控其表达。
[0020] 图2 :鉴定稳定过表达miR-7的前列腺癌亚克隆细胞系。（a)稳定过表达miR-7 后，使用TaqMan MicroRNA Assay的方法鉴定PC3-miR_7中miR-7的表达量上升为对照的 26倍。（b)通过qRT-PCR方法发现，稳定过表达miR-7后，其靶标基因 KLF4,及其下游p21 和cyclinDl ;-个已知的靶标基因 ρ100 δ，及其下游Akt和mTOR的表达与对照相比显著降 低。（c)通过蛋白免疫印迹的方法发现，在蛋白水平上相关基因的表达与mRNA的表达水平 一致，即稳定过表达miR-7后相关基因的表达及活性状态均显著下降。同时，由于p-Akt (反 映 Akt的活性状态）显著下降，导致下游的p-p21 (定位于细胞质中）的量随之下降，从而 使得进入细胞核的非磷酸化的P21的量相对增加，提示了稳定过表达miR-7后可能造成细 胞周期阻滞。GAPDH为细胞质蛋白内参，TBP为细胞核蛋白内参。:p< 0.01。
[0021] 图3:稳定过表达miR-7可在前列腺癌细胞系中实现细胞周期阻滞。（a)通过 Hoechst方法及流式细胞分选，发现细胞周期同步化后，PC3-miR-7细胞从血清饥饿的状态 恢复（G0/G1期细胞比例< 70% )需要12个小时，而对照PC3-null细胞仅需要8个小时。 S期（b)以及G2/M期（c)细胞比例变化表明，PC3-miR-7细胞完成一个细胞周期需要约14 个小时，而PC3-null细胞需时12个小时。结果提示了在前列腺癌细胞中稳定过表达miR-7 后，可引起细胞周期阻滞，进而抑制肿瘤细胞的增殖能力。
[0022] 图4 :稳定过表达miR-7在体外能显著抑制前列腺癌细胞的增殖。（a)通过CCK8 方法检测，发现稳定过表达miR-7后细胞在450nm处的吸光值较之对照显著降低。提示了 稳定过表达miR-7可以在体外，细胞贴壁生长的状态下抑制肿瘤细胞的增殖。（b)在细胞同 步化后恢复血清供给，16小时后通过免疫荧光方法检测细胞增殖相关基因 ki-67的表达， 发现稳定过表达miR-7后ki-67的表达量显著降低，提示了稳定过表达miR-7可以在体外 显著抑制贴壁生长的前列腺癌细胞的增殖。显微成像放大比例为200倍，比例尺长度为20 微米。* * :p < 0· 01。
[0023] 图5 :稳定过表达miR-7在体外能显著抑制前列腺癌细胞的离壁生长能力。通过三 维离壁培养实验，发现稳定过表达miR-7后，前列腺癌细胞形成大细胞球（直径> 80微米） 的能力显著降低。图左侧展示了两种稳转细胞系来源的有代表性的细胞球显微成像，放大 倍数分别为100倍和400倍，比例尺长度为50微米。图右侧为细胞球数量的统计结果。* 女：p < 0· 01。
[0024] 图6 :稳定过表达miR-7在体内抑制前列腺肿瘤的生长。（a)通过建立裸小鼠皮下 植瘤模型，分别在腿部外侧皮下接种PC3-null、PC3-miR-7连续观察30天肿瘤体积变化，发 现稳定过表达miR-7后肿瘤在皮下的生长得到显著抑制。图左侧为生长曲线的统计结果， 右侧为30天后处死小鼠，从皮下取出的肿瘤组织。（b)将取出的肿瘤组织称取重量，发现 PC3-miR-7来源的肿瘤组织的重量显著低于对照。（c)分别从PC3-null、PC3-miR-7来源的 肿瘤组织中提取总RNA，通过TaqMan MicroRNA Assay的方法鉴定，发现PC3-miR-7来源的 肿瘤组织中miR-7的表达量仍然维持在对照的5倍以上。通过qRT-PCR方法发现其他的相 关靶基因在PC3-miR-7来源的肿瘤组织中的表达量均显著低于其在对照中的表达量。分别 从PC3-null、PC3-miR-7来源的肿瘤组织中提取总蛋白进行蛋白免疫印迹检测，同样得到 与mRNA水平一致的结果。（d)分别将PC3-nul 1、PC3-miR-7来源的肿瘤组织进行石蜡包埋切 片并做H&E染色，发现在PC3-null来源的肿瘤组织（T指示区域）中已经有明显的肿瘤血管 生成（黑色箭头指示区域），并伴有一定程度的皮下脂肪渗入（*指示区域），而PC3-miR-7 来源的肿瘤组织中只有少量的红细胞渗入（黑色箭头指示区域），且皮肤（S指示区域）与 肿瘤组织间存在均一、界限分明的结缔组织。图左侧为放大100倍的显微成像，右侧为左侧 方框中区域的400倍显微成像，比例尺长度为20微米。* :p <0· 05, * * :p <0· 01。
[0025] 图7 :从皮下肿瘤组织、亚克隆细胞系中分别进行流式分选前列腺癌干细胞 (CD44+CD133+)。（a)将PC3-null、PC3-miR-7亚克隆细胞（图上方三组），以及两者皮下接 种来源的肿瘤组织消化所得的单细胞（图下方三组）通过APC标记的人CD44抗体以及PE 标记的人CD133抗体共染后进行流式细胞分选，发现直接从体外贴壁生长的细胞中得到的 CD44+CD133+细胞比例在两者中并无显著差异，但是进过皮下植瘤从组织中消化所得细胞中 ⑶44+CD133+细胞比例在稳定过表达miR-7后显著下降为对照的0. 75倍，提示了稳定过表 达miR-7后在体内减弱了前列腺癌干细胞的干性维持能力。（b)对于分选所得的细胞进行 甩片后，通过免疫荧光染色检测相关干性因子（以KLF4，Nanog为例，但不限于此）的表达， 发现无论是从体外贴壁生长的细胞中直接分选（图上方两行）还是经过皮下植瘤后再消化 分选（图下方两行），KLF4及Nanog在细胞核中的定位及表达量在稳定过表达mIR-7后均 显著降低，提示了稳定过表达miR-7后抑制了干性相关基因的表达，从而降低了前列腺癌 干细胞的干性维持能力。显微成像放大倍数为200倍，比例尺长度为10微米。
[0026] 图8 :体外检测稳定过表达miR-7对前列腺癌干细胞"干性维持"能力的影响。将 PC3-null、PC3-miR-7亚克隆细胞皮下植瘤后，从肿瘤组织中分选⑶44+⑶133+前列腺癌干 细胞进行三维离壁生长，在体外评估稳定过表达miR-7对前列腺癌干细胞干性的影响。15 天后统计不同直径的细胞球的数量，发现稳定过表达miR-7后，形成的大直径（> 80微 米）细胞球个数仅占总数的约10%，显著低于对照（35%)，提示了稳定过表达miR-7能通 过抑制前列腺癌干细胞的干性，发挥抑制肿瘤生长的作用。图左侧为代表性的细胞球显微 成像，放大倍数为400倍，比例尺长度为50微米；图右侧为细胞球数量的统计结果，* * :P < 0· 01。
[0027] 图9 :梯度稀释再次皮下植瘤小鼠模型在体内评价稳定过表达miR-7对前列腺癌 干细胞"干性维持"能力的抑制作用。（a)梯度稀释再次皮下植瘤小鼠模型的策略概图。（b) 通过统计皮下肿瘤生长曲线，发现对于CD44TD133^细胞（PC3-null-NS、PC3-miR-7-NS)， 在1〇 5个细胞的接种量时，稳定过表达miR-7显著地抑制了非肿瘤干细胞在体内的再次生 长；对于CD44+CD133+细胞（PC3-null-S、PC3-miR-7-S)，在10 2个细胞的接种量时，稳定过 表达miR-7同样能通过抑制前列腺癌干细胞的干性，有效地抑制了肿瘤干细胞来源的肿 瘤组织在体内的生长。（c)在分别接种后50天（PC3-null-NS、PC3-miR-7-NS)，及70天 (PC3-null-S、PC3-miR-7-S)，取肿瘤组织称重，发现稳定过表达miR-7,对于非肿瘤干细胞 及肿瘤干细胞来源的肿瘤组织，其肿瘤重量均显著低于对照，提示了 miR-7可以通过抑制 肿瘤干细胞的干性发挥抑制肿瘤生长及肿瘤进程的作用。:P< 0.01。

【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0029] 实施例1
[0030] 使用双荧光素酶报告系统鉴定miRNA与靶标基因 mRNA3' UTR之间的互作：将PC3 细胞（购买于中科院细胞库，以此为例，但不限于此）在24孔板中使用DMEM完全培养基 (含10 %胎牛血清，购于美国Gibco公司）贴壁培养，待细胞密度达到70 %?80 %时，使用 lipofectamine2000转染试剂（购于美国Life Technology公司）进行如下操作：1)取3孔 细胞作为平行样，同时转染阳性对照报告载体（此处的阳性对照为与miR-7完全互补配对 的序列，即序列四）、表达Renilla突光素酶基因的内参载体pRL-cmv (购于美国promega公 司）及对照scramble RNA (购于美国Life Technology公司，数据见图1左侧miR_7target 列中白色图注）；2)取3孔细胞作为平行样，同时转染上述阳性对照报告载体、上述内参载 体pRL-cmv及需研究的miRNA的次级前体分子pre-miRNA(此处以pre-miR-7为例，但不 限于此，购于美国Life Technology公司，数据见图1左侧miR-7target列中黑色图注）； 3)取3孔细胞作为平行样，同时转染包含靶标基因 mRNA3'UTR序列的报告载体（此处以 KLF43' UTR为例，见序列五，但不限于此）、上述内参载体pRL-cmv及上述对照scramble RNA(数据见图1右侧full-length KLF43'UTR列中白色图注）；4)取3孔细胞作为平行样， 同时转染上述包含KLF43' UTR序列的报告载体、上述内参载体pRL-cmv及pre-miR-7分子 (数据见图1右侧full-length KLF43' UTR列中黑色图注），具体操作流程按照转染试剂 制造商提供的说明书进行。转染后18?24小时，使用双荧光素酶检测试剂盒（购于美国 promega公司）在荧光素酶冷光仪（BERTHOLD Technology)上检测并计算相对荧光素酶的 活性R1/R2。其中R1表示报告载体表达的Firefly荧光素酶的活性，R2表示内参载体表达 的Renilla荧光素酶的活性（图1)。结果表明，当有pre-miR-7存在的时候，能够通过与 KLF43' UTR互作，在转录后水平上下调Firefly荧光素酶的表达，导致其相对荧光素酶的活 性相比用scramble RNA时显著降低。这一结果提示KLF4在前列腺癌中是miR-7的一个可 能的新靶标基因。
[0031] 实施例2:
[0032] (1)构建用于真核细胞稳定表达miRNA的表达载体：以pEGP-miR质粒为骨架 (购于美国Cell BioLab公司），通过常规的限制性内切酶BamHI/Nhel双酶切，将质粒线 性化。通过人工合成所需的miRNA的前体分子序列（此处以miR-7的三种不同前体分子 pri-miR-7-1、pri-miR-7-2、pri-miR-7-3为例，但不限于此，见序列一、二、三），同时在序 列的5 '端和3 '端分别引入限制性内切酶BamHI和NheI (也可以是Xbal，是NheI的同尾酶） 的识别位点。对获得的片段进行常规的限制性内切酶BamHI/Nhel (也可以是BamHI/Xbal) 双酶切，以及常规的DNA连接操作，构建用于真核细胞稳定表达miRNA的表达载体（此处以 pEGP-miR-7-1，pEGP-miR-7-2, pEGP-miR-7-3为例，但不限于此，三者均能有效地实现成熟 miR-7分子的表达，以下以pEGP-miR-7-l获得的结果为例说明）。
[0033] (2)通过嘌呤霉素抗性及EGFP荧光阳性联合筛选的方法构建稳定过表达miRNA的 前列腺癌亚克隆细胞系：通过常规的脂质体转染方法（本发明中采用lip〇fectamine2000 转染试剂，购于美国Life Technology公司，但不限于此）将稳定过表达miRNA的表达载体 (此处以pEGP-miR-7-l为例，但不限于此）或对照质粒pEGP-null (购于美国Cell BioLab 公司）分别转入前列腺癌细胞系中。涉及的前列腺癌细胞系包含但不限于：PC3, DU145， LNCaP(在三者中均能成功实现稳定过表达miR-7的亚克隆细胞系构建，以下以PC3中构建 的亚克隆细胞系为例说明，PC3前列腺癌细胞系可从中科院细胞所获得。转染后72小时，通 过常规的贴壁细胞传代培养方法将细胞转入直径l〇cm的培养dish中扩大培养至细胞密度 达到70%?80%。加入嘌呤霉素（购于美国sigma公司）至终浓度0.5微克/毫升，2? 3天换液一次，持续给予嘌呤霉素10天，观察细胞不再继续死亡后停止嘌呤霉素筛选。收 集存活的细胞，通过常规的流式细胞分选方法，筛选出EGFP阳性细胞（pEGP-miR质粒骨架 中含有嘌呤霉素抗性基因与EGFP的融合蛋白，该融合蛋白与miRNA前体分子共用同一的启 动子）。该联合筛选的方法相较于传统的单一抗性基因表达筛选方法，能有效地避免因前 列腺癌细胞系自发耐药性强造成的假阳性结果，即具有嘌呤霉素抗性且EGFP荧光阳性的 细胞才是稳定过表达miRNA的前列腺癌亚克隆细胞。将获得的亚克隆细胞在75cm 2细胞培 养瓶中扩大培养并连续传代3次，期间维持终浓度0. 5微克/毫升嘌呤霉素的含量，再次通 过流式细胞分选方法检验，其EGFP荧光阳性率高于95%，则可以确认该亚克隆细胞构建成 功。若EGFP荧光阳性率过低，可重复上述筛选过程，逐代富集EGFP荧光阳性的细胞，直至 建立所需的亚克隆细胞系PC3-miR-7。
[0034] (3)鉴定稳定过表达miR-7的前列腺癌亚克隆细胞系：此处以PC3-miR-7细胞为 例，但不限于此。将细胞使用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清，购于美国Gibco公司） 贴壁培养与6孔板中，当细胞密度达到70 %?80%时去除培养基，使用Trizol (购于美国 Life Technology公司）进行常规的总RNA抽提。使用miR-7特异性的反转录引物（购于美 国Life Technology公司），miRNA反转录试剂盒（购于美国Life Technology公司），按照 制造商提供的标准步骤进行miR-7的反转录。用同样的方法对U44(小的核RNA, snRNA，内 参）进行特异性的反转录。将得到的反转录产物作为模板，分别使用miR-7特异的探针，以 及U44特异的探针（两种探针均购于美国Life Technology公司），采用TaqMan MicroRNA Assay方法（有专用试剂盒，购于美国Life Technology公司），在实时定量PCR仪上按照试 剂盒提供的标准程序进行定量分析成熟的miR-7的表达量（图2a)。结果表明，相对于对照 细胞系PC3-null，PC3-miR-7中成熟的miR-7的表达量提高了 26倍。同时，本发明使用常规 的mRNA反转录盒（购于日本TAKARA公司）对提取的总RNA进行反转录，使用SYBR-Green 试剂（购于日本Τ0Υ0Β0公司）对KLF4, p21，cyclin Dl，pll0delta(PI3K的催化亚基）， Akt，mT0R基因的mRNA水平进行qRT-PCR分析（图2b)。结果表明miR-7的靶标基因 KLF4 及其下游的p21、cyclin D1的表达；已知的miR-7的祀标基因 pllOdelta[Hepatology，Fang YX]及其下游的Akt，mTOR的表达在PC3-miR-7中均显著下降。同时，分别从PC3-null和 PC3-miR-7细胞中通过常规方法分别提取总蛋白、细胞核蛋白和细胞质蛋白，通过蛋白免疫 印迹方法检测了上述基因的蛋白表达量（图2c)。结果与mRNA水平的定量分析一致，稳定 过表达miR-7后，总蛋白中KLF4，pll0delta，Akt，p-Akt，mT0R的表达量显著降低，其中Akt 的活化形式P-Akt的含量被显著抑制，导致细胞质中p-p21的含量下降，促进了 p21在细胞 核中的定位和富集（抗体购于美国SantaCruz公司或CST公司）。这种富集会导致细胞周 期阻滞在G1-S期，提示了稳定过表达miR-7后可能会延伸细胞周期，并因此影响细胞的增 殖。
[0035] 实施例3 :
[0036] 稳定过表达miR-7可在前列腺癌细胞系（以PC3-miR-7细胞为例，但不限于此）中 实现细胞周期阻滞：将PC3-miR-7及对照PC3-null通过常规的细胞培养方法在12孔板中 贴壁培养，每种细胞在每个检测的时间点需重复3个复孔。本实施例中每2小时检测一次 各细胞时期（G0/G1期，S期，G2/M期）的细胞数量比例，连续检测48小时，共24个时间点。 当细胞密度达到60%?70%时，将完全培养基替换成无血清的基本培养基，通过血清饥饿 30?36小时，使细胞周期同步化到G0期，并处于静息状态。恢复血清供应后开始检测，以 恢复血清供应的起点为〇小时，依次计时。在检测时间点用常规细胞消化收集方法进行消 化收集，即用0. 05%胰酶（含0. 02% EDTA)进行细胞消化后，中和胰酶并离心收集细胞，用 1 X PBS重悬后离心一次去除残余的培养基，将所收集到的细胞沉淀用500微升1 X PBS重悬 并转移至5毫升流式细胞分选上样管中。加入1微升10毫克/毫升浓度的Hoechst (购于 美国Molecular Probe公司），37°C避光孵育10分钟，通过流式细胞分选仪进行细胞周期分 析，使用ModfitLT软件进行数据分析。对数据统计后发现稳定过表达miR-7后细胞从血清 饥饿状态中恢复（G0/G1期比例低于70% )的能力减弱，对照PC3-null中恢复需要8个小 时，而PC3-miR-7需要12小时（图3a)。其次，从各个时期的比例变化可见，对照PC3-null 在血清饥饿恢复后完成一个细胞周期需12?13小时，而PC3-miR-7在相同条件下则需要 14小时（图3a-3c)，提示了稳定过表达miR-7能有效地阻滞前列腺癌细胞的细胞周期，并 可以此抑制肿瘤细胞的增殖。
[0037] 实施例4 :
[0038] 通过CCK8增殖实验和Ki-67染色法检测稳定过表达miR-7对前列腺癌细胞系（以 PC3-miR-7细胞为例，但不限于此）体外增殖能力的影响：通过实施例3中的常规细胞消化 收集方法，将收集到的对照PC3-null、PC3-miR-7细胞用完全培养基重悬于EP管中并定容 至1毫升。使用血球计数板进行细胞计数，取24孔板每孔中接种5000个细胞，连续检测一 周，每天检测5个复孔。检测时在500微升完全培养基中加入50微升CCK8试剂（购于碧云 天公司）混匀，37°C避光孵育2小时。取20微升上清液于96孔板中，使用酶标仪，在450nm 处检测吸收值。对一周的检测结果进行统计分析（图4a)，发现PC3-miR-7细胞经反应后 的吸光度显著小于PC3-null细胞，提示了稳定过表达miR-7可以在体外，细胞贴壁生长的 状态下抑制肿瘤细胞的增殖。同时，本发明取12孔板放入细胞爬片，在玻片上接种5000个 细胞（200微升体积），待细胞完全贴壁后，去除上清，在孔中加入完全培养基，通过血清饥 饿的方法进行同步化（见实施例3)，在细胞同步化后恢复血清供给，在恢复血清供应16小 时后取出玻片，通过常规的细胞免疫荧光染色方法，检测细胞中Ki-67 (抗体购于美国CST 公司）这一增殖相关基因的表达（图4b)。通过荧光显微镜下观察发现PC3-miR-7细胞的 Ki-67表达显著低于对照PC3-null细胞，再次提示了稳定过表达miR-7能显著抑制前列腺 肿瘤细胞在体外的增殖。
[0039] 实施例5 :
[0040] 通过三维培养实验在体外检测稳定过表达miR-7对前列腺癌细胞系（以 PC3-miR-7细胞为例，但不限于此）离壁生长能力的影响：通过实施例3中的常规细胞消化 收集方法，将收集到的对照PC3-null、PC3-miR-7细胞用基本培养基重悬于EP管中并定容 至1毫升，使用血球计数板进行细胞计数备用。将含有生长因子的matrigel和Geltrex (两 者均购于美国BD Bioscience公司）于冰上按1 : 1比例混匀。在96孔板中滴加入混合液 20微升/孔，迅速铺匀后在37°C细胞培养箱中静置30分钟使其充分凝固。将细胞浓度稀 释至200个细胞/40微升，滴加于凝固的基质上，在37°C细胞培养箱中孵育1小时。期间制 备上层基质：将含有生长因子的matrigel用基本培养基稀释至4% (体积比）。将100微 升上层基质滴加于已有的细胞悬液中，在37°C细胞培养箱中继续培养。3天后第一次换液， 之后每2天换液一次。换液时从液面处吸取80微升（考虑培养箱中水分蒸发）后，滴加入 新制备的上层基质。每组接种3个复孔，细胞接种后15天，使用相差显微镜拍照并统计不 同直径大小的细胞球的数量（图5)。结果表明，PC3-miR-7细胞形成的直径在20?80微 米的细胞球的数量，以及80微米以上超大细胞球的数量相比PC3-null细胞在相同条件下 形成的细胞球数量显著减少。提示在三维培养的状态下，稳定过表达mIR-7同样具有抑制 前列腺肿瘤细胞增殖的能力。
[0041] 实施例6:
[0042] 通过建立裸小鼠皮下植瘤模型在体内评价稳定过表达miR-7对前列腺肿瘤生 长的抑制作用：通过实施例3中的常规细胞消化收集方法，将收集到的对照PC3-null、 PC3-miR-7细胞用基本培养基重悬于EP管中并定容至1毫升，使用血球计数板进行细 胞计数备用。将细胞定容至1〇6个细胞/50微升，在冰上与等体积的含有生长因子的 matrigel (购于美国BD Bioscience公司）混勻。选用于5周龄无胸腺雄性裸小鼠（购于 斯莱克实验动物公司）建立动物模型。使用胰岛素注射器将混匀后的细胞悬液分别注射在 小鼠大腿外侧的皮下（本例中左侧注射对照PC3-nul 1细胞，右侧注射PC3-miR-7细胞），重 复5只小鼠作为平行样，整个过程在SPF级动物房的生物安全柜内操作。注射后的实验小鼠 在SPF级动物房中通过常规实验动物饲养方法进行饲养，每5天观察并使用游标卡尺测量 皮下肿瘤的体积（体积=长X宽X高Χ6/π)。注射后连续记录30天，统计并绘制肿瘤 体积的生长曲线（图6a)。同时，将实验小鼠处死后获取皮下肿瘤组织并称重（图6b)，将部 分组织在液氮中迅速冷却后在_80°C深冷保存，分别用于提取总RNA、总蛋白，在组织中检 测相关基因的表达（图6c);将部分组织在4%多聚甲醛中固定，用于石蜡包埋切片及HE病 理染色（图6d);将部分组织剪碎后用IV型胶原酶消化组织，用于前列腺癌干细胞的流式 细胞分选（见实施例7)。结果表明，PC3-miR-7来源的肿瘤组织，接种后30天其肿瘤体积 为对照组的0. 5倍，瘤重为对照的0. 44倍。通过前述方法提取总RNA、对相关基因进行反转 录，分别采用TaqMan MicroRNA Assay方法和常规qRT-PCR方法（见实施例2)检测miR-7， KLF4, pllOdelta，Akt，mTOR，及cyclin D1 (以这些基因为例，但不限于此）的表达。发现 PC3-miR-7来源的肿瘤组织中miR-7的表达为对照PC3-null来源的肿瘤组织中的5倍，而 KLF4和cyclin D1的表达则均小于0. 5倍、pllOdelta为0. 33倍。Akt，mTOR的表达也均 降低（图6c)。通过蛋白免疫印迹在蛋白水平上检测时也得到一致的结果（图6c)。对组 织进行HE染色后（图6d)，发现对照PC3-null来源的肿瘤组织中有明显的肿瘤血管生成， 并伴有一定程度的皮下脂肪组织渗入。而在PC3-miR-7来源的肿瘤组织中，肿瘤细胞与小 鼠皮肤之间由皮下结缔组织隔离，两者界限分明，在肿瘤组织中未见明显的肿瘤血管生成。 上述结果均提示了稳定过表达miR-7能在体内有效地抑制前列腺癌的细胞增殖。
[0043] 实施例7 :
[0044] 从皮下肿瘤组织、亚克隆细胞系中分别进行流式分选前列腺癌干细胞 (⑶44+CD133+):分别将对照PC3-null来源的肿瘤组织和PC3-miR-7来源的肿瘤组织剪碎 后，加入4毫升IV型胶原酶，终浓度为1毫克/毫升（购于美国Life Technology公司）。 在37°C水浴振荡箱中孵育30分钟后，加入1毫升0. 05%胰酶（含0. 02% EDTA)，终浓度为 0. 01 %，继续孵育5分钟，进一步将细胞消化为单细胞。加入等体积的完全培养基终止反应 离心收集细胞。使用1XPBS重悬后离心进行漂洗，重复两次。将细胞用1XPBS重悬转移 到EP管中并定容至1毫升，使用血球计数板进行细胞计数。将细胞按10 8个细胞/100微 升分装至EP管中，同时加入APC标记的人的⑶44抗体[38]和PE标记的人的⑶133抗体 [39]各5微克（两种抗体均购于德国美天旎MACS公司），4°C避光孵育40?50分钟，离心 去除上清，用PBS重悬漂洗1?2次后，用含1% FBS的PBS重悬到适当的浓度进行流式细 胞分选。采用APC-PE双通道分选获取CD44+CD133+双阳性细胞和CD44XD133-双阴性细胞 (图7a)。对于贴壁培养PC3-null和PC3-miR-7细胞，通过常规的消化收集方法，计数并定 容至相同的细胞浓度后，按照相同的方法进行抗体孵育和后续操作，并用相同的分选条件 获取的结果⑶44+CD133+双阳性细胞和⑶44TD133_双阴性细胞（图7a)。将获取的细胞依 次进行离心甩片、4%多聚甲醛固定和常规免疫荧光检测两群细胞干性相关因子的表达差 异（图7b)。结果表明，无论是从亚克隆细胞系直接分选，还是从各自接种的皮下异植瘤中 分选，稳定过表达miR-7后CD44+CD133+双阳性细胞（即前列腺癌干细胞）占总体细胞的 比例均有所下降。将获得的细胞进行甩片后，通过常规的免疫荧光染色检测干性相关因子 (以KLF4，Nanog为例，但不限于此）的表达，发现稳定过表达miR-7后CD44+CD133+双阳性 细胞中这些因子的表达水平均低于对照，提示了稳定过表达miR-7后可以通过抑制这些重 要的干性因子的表达发挥削弱前列腺癌干细胞"干性维持"能力的作用。
[0045] 实施例8 :
[0046] 通过三维培养实验在体外检测稳定过表达miR-7对前列腺癌干细胞"干性维持" 能力的影响：按照实施例5的方法，将对照PC3-null或PC3-miR-7来源的肿瘤组织中获取 的CD44+CD133+双阳性细胞（即前列腺癌干细胞）进行体外三维离壁培养，每组均接种3 个复孔。接种后15天，使用相差显微镜拍照并统计不同直径大小的细胞球的数量（图8)。 结果表明，稳定过表达PC3-miR-7后，形成的细胞球绝大部分直径在20?80微米之间，80 微米超大细胞球的数量仅占10%，显著低于对照中超大细胞球的数量（PC3-null来源的为 35% )。提示了在体外，稳定过表达PC3-miR-7后削弱了前列腺癌干细胞的干性。
[0047] 实施例9 :
[0048] 通过建立梯度稀释再次皮下植瘤小鼠模型在体内评价稳定过表达miR-7对前列 腺癌干细胞"干性维持"能力的抑制作用：将对照PC3-null或PC3-miR-7来源的肿瘤组织中 获取的CD44+CD133+双阳性细胞（即前列腺癌干细胞，分别命名为PC3-null-S、PC3-miR7-S) 和CD44XD133_双阴性细胞（非癌干细胞，分别命名为PC3-null-NS、PC3-miR7-NS)使 用血球计数板进行细胞计数后用无血清的基本培养基稀释定容到不同的浓度：对于 ⑶44XD133^双阴性细胞稀释为10 5个细胞/50微升、104个细胞/50微升两个梯度；对于 ⑶44+CD133+双阳性细胞稀释为10 3个细胞/50微升、102个细胞/50微升两个梯度。在冰 上将稀释后的细胞悬液与等体积的含有生长因子的matrigel (购于美国BD Bioscience公 司）混匀。选用于5周龄无胸腺雄性裸小鼠（购于斯莱克实验动物公司）建立动物模型。 使用胰岛素注射针，将PC3-null-NS、PC3-miR7-NS "细胞-matrigel"混合液分别注射在小 鼠的大腿外侧皮下，1〇5稀释度重复5只小鼠作为平行样；10 4稀释度重复5只小鼠作为平 行样。将PC3-null-S、PC3-miR7-S "细胞-matrigel"混合液同样分别注射在小鼠的大腿 外侧皮下，1〇3稀释度重复5只小鼠作为平行样；10 2稀释度重复5只小鼠作为平行样（图 9a)。每5天观察并测量皮下肿瘤体积（方法同实施例6)，PC3-null-NS、PC3-miR7-NS组连 续观察到接种后50天处死实验小鼠，获取皮下肿瘤组织并称重；PC3-null-S、PC3-miR7-S 组连续观察到接种后70天处死实验小鼠，获取皮下肿瘤组织并称重（图9b，9c)。结果表 明，PC3-miR7-NS来源的肿瘤组织，在10 5个细胞接种量下，接种后50天其肿瘤体积为对照 组（PC3-null-NS)的 0· 36 倍，瘤重为对照（PC3-null-NS)的 0· 45 倍。PC3-miR7-S 来源的 肿瘤组织，在1〇2个细胞接种量下，接种后70天其肿瘤体积为对照组的0. 29,瘤重为对照的 〇. 31倍。提示了 miR-7在非癌干细胞的肿瘤细胞中具有抑制其细胞增殖的能力，同时对于 癌干细胞还能有效地抑制其"干性维持"的能力。
[0049] 上述实施例的结果验证了 miR-7这一天然核酸类分子作为新型的小分子药物在 前列腺癌的临床应用中具有广阔的前景，是一种理想的靶向基因备选药物。
[0050] 本发明中例举的相关基因序列：
[0051] 序列一：
[0052] miR-7 前体分子 1 (pri-miR-7-l):染色体定位 9q21. 32
[0053] NR-029605. 1
[0054] lttggatgttg gcctagttct gtgtggaaga ctagtgattt tgttgttttt agataactaa
[0055] 61atcgacaaca aatcacagtc tgccatatgg cacaggccat gcctctacag
[0056] 序列二：
[0057] miR-7 前体分子 2(pri-miR-7-2):染色体定位 15q26. 1
[0058] NR-029606. 1
[0059] lctggatacag agtggaccgg ctggccccat ctggaagact agtgattttg ttgttgtctt
[0060] 61actgcgctca acaacaaatc ccagtctacc taatggtgcc agccatcgca
[0061] 序列三：
[0062] miR-7 前体分子 3 (pri-miR-7-3):染色体定位 19pl3. 3
[0063] NR-029607. 1
[0064] lagattagagt ggctgtggtc tagtgctgtg tggaagacta gtgattttgt tgttctgatg
[0065] 61tactacgaca acaagtcaca gccggcctca tagcgcagac tcccttcgac
[0066] 序列四：
[0067] 人工合成的与成熟的miR-7完全互补的序列：
[0068] 5, -AGA TCT GCT AGC CAA CAA AAT CAC TAG TCT TCC AGA TAT CAG ATC T-3'
[0069] 其中AGATCT是限制性内切酶Bglll的识别作用位点；GCTAGC是限制性内切酶 Nhel的识别作用位点；GATATC是限制性内切酶EcoRV的识别作用位点。下划线序列！￡1 工￡￡表示与miR-7的核心识别序列5' -GGUUGU-3'的互补区域。
[0070] 序列五：
[0071] 本发明中验证的与miR-7具有互作的KLF4mRNA中的3' UTR序列：
[0072] latcccagaca gtggatatga cccacactgc cagaagagaa ttcagtattt tttacttttc
[0073] 61acactgtctt cccgatgagg gaaggagccc agccagaaag cactacaatc atggtcaagt
[0074] 121tcccaactga gtcatcttgt gagtggataa tcaggaaaaa tgaggaatcc aaaagacaaa
[0075] 181aatcaaagaa cagatggggt ctgtgactgg atcttctatc attccaattc taaatccgac
[0076] 241ttgaatattc ctggacttac aaaatgccaa gggggtgact ggaagttgtg gatatcaggg
[0077] 301tataaattat atccgtgagt tgggggaggg aagaccagaa ttcccttgaa ttgtgtattg
[0078] 361atgcaatata agcataaaag atcaccttgt attctcttta ccttctaaaa gccattatta
[0079] 421tgatgttaga agaagaggaa gaaattcagg tacagaaaac atgtttaaat agcctaaatg
[0080] 481atggtgcttg gtgagtcttg gttctaaagg taccaaacaa ggaagccaaa gttttcaaac
[0081] 541tgctgcatac tttgacaagg aaaatctata tttgtcttcc gatcaacatt tatgacctaa
[0082] 601gtcaggtaat atacctggtt tacttcttta gcatttttat gcagacagtc tgttatgcac
[0083] 661tgtggtttca gatgtgcaat aatttgtaca atggtttatt cccaagtatg ccttaagcag
[0084] 721aacaaatgtg tttttctata tagttccttg ccttaataaa tatgtaatat aaatttaagc
[0085] 781aaacgtctat tttgtatatt tgtaaactac aaagtaaaat gaacattttg tggagtttgt
[0086] 841attttgcata ctcaaggtga gaattaagtt ttaaataaac ctataatatt ttatctgaaa
[0087] 其中下划线部分为可被miR-7识别并结合区域。
[0088] 本发明中引用的相关参考文献：
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【权利要求】
1. microRNA-7在作为PI3K/Akt信号通路的表达抑制剂方面的作用。 2. microRNA-7在作为KLF4的靶向抑制剂中的作用。 3. microRNA-7在制备抑制前列腺肿瘤生长的药物中的应用。 4. microRNA-7在制备阻滞前列腺肿瘤细胞周期进程的药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK104138603SQ201410314955
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】高维强, 方煜翔, 常云丽 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院