Otud3蛋白在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了OTUD3蛋白在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。OTUD3蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体或表达OTUD3蛋白的慢病毒在制备具有如下1)-7)中至少一种功能的产品中的应用。本发明的实验证明，OTUD3作为一个新发现的重要抑癌蛋白抑制肿瘤的生成与转移，OTUD3功能的发现将对肿瘤诊断、预防及治疗提供重要的科学依据与应用价值。
【专利说明】0TUD3蛋白在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种0TUD3蛋白在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。
【背景技术】
[0002]抑癌蛋白 PTEN (phosphatase and tens1n homologue deleted from chromosome10，又称作MMACl或TEP1)基因是1997年由美国的两个独立研究小组在人类染色体10q23.3定位的一个新的抑癌基因。该基因编码的蛋白PTEN长403个氨基酸，由磷酸酶结构域(15-185)、C2 结构域(186-351)、PEST 模序区(352-400)和 PDZ 结合区(401-403)构成，PTEN具有脂质磷酸酶和蛋白质磷酸酶活性，更为精细的研究表明，其脂质磷酸酶活性在其抑癌活性中具有更为重要的地位，它能特异性地使磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphate, PIP3)的3位磷酸基团去磷酸化，从而拮抗PI3K激酶的功能，抑制PI3K下游特别是Akt通路的信号转导，具有抑制细胞生长、增殖、迁移等多种效应。PTEN基因是继p53基因之后目前已知与肿瘤发生发展关系最为密切的抑癌基因之一，在血液系统肿瘤、脑胶质瘤、消化道肿瘤、妇科肿瘤、泌尿道肿瘤、肺癌、骨肉瘤等诸多肿瘤中均检测到该基因的突变或杂合性缺失(LOH)，并发现其蛋白表达水平下调或缺失，在肿瘤易感的疾病如Cowden疾病、Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征病人中也常检测到PTEN突变。纯合缺失PTEN基因的小鼠胚胎致死，杂合缺失PTEN基因的小鼠则自发形成多种类型的肿瘤，确证PTEN确实在体内具有抑癌基因的功能。近年来，大量组织特异性的PTEN基因敲除小鼠模型的建立及表型分析进一步揭示，PTEN在细胞代谢、细胞运动性与极性、肿瘤微环境、细胞衰老、干细胞调控等诸多细胞学过程中发挥了极为重要的生理功能。目前公认的PTEN在细胞质内的主要作用机理仍然是通过调控PIP3的去磷酸化而抑制PI3K-Akt通路，因此常称为PTEN-PI3K-Akt通路或PTEN-Akt-mTOR通路等，在几乎每一种PTEN基因敲除的组织或器官中，Akt活性均上调，且Aktl敲除可以挽救PTEN+/_小鼠在许多易感组织成瘤的表型，表明PTEN确实是Akt信号通路的重要负调控分子。近五年来，有研究揭示，PTEN不仅在细胞质以磷酸酶依赖的方式发挥作用，也可以在细胞核内以磷酸酶非依赖的方式发挥功能且对其抑癌作用同样具有重要贡献。PTEN可定位于着丝粒并与动粒蛋白CENP-C蛋白结合，维持着丝粒稳定性；作用于染色质，上调Rad51水平，促进DNA双链断裂损伤修复，维持染色体稳定性；同时也可以与泛素连接酶APC/C结合，增强APC/C-Cdhl复合体的抑癌作用。
[0003]鉴于PTEN的重要性，其活性与稳定性必然受到严谨的调控。与P53半衰期非常短(约15-30分钟)、细胞内源蛋白水平很低不同，PTEN半衰期相对较长(几个小时)、细胞内源蛋白水平较高，二者同为重要的抑癌蛋白，发挥功能的机制虽也有交叉、但更多的是不同，P53主要在细胞核内作为转录因子发挥功能，而PTEN主要在细胞质中作为磷酸酶发挥功能；在细胞周期进程中，P53主要监控G1/S期，PTEN主要调控M期。理论上讲，蛋白稳定性及蛋白量的控制，除了受到转录水平及蛋白质合成的影响外，非常重要的一种机制就是泛素化降解与去泛素化的阴阳平衡调控。泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)促进底物泛素化修饰，携带泛素链的蛋白为26S蛋白酶体识别并降解为肽段；与之相反，去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)可以去除底物的泛素化，阻断蛋白酶体介导的降解(proteasomaldegradat1n),保护底物蛋白使其水平上调。E3与DUB,就如同激酶与磷酸酶一样,构成调节蛋白稳定性的重要分子对。考虑到P53和PTEN的半衰期差异，相对而言，促进p53泛素化修饰的E3 (如Mdm2、ARFBPl等)在调节p53半衰期中具有重要功能，相反，抑制PTEN泛素化修饰、阻断蛋白酶体降解的DUB在调节PTEN半衰期中具有相对更为重要的角色。
[0004]截至目前，促进PTEN泛素化(包括单泛素化与多聚泛素化)的E3已报道有5个分子，分别是Nedd4-1、WWP2、CHIP、XIAP和刚刚在线发表的TRM27/RFP，而促进PTEN去泛素化的DUB只报道有I个分子，即HAUSP (又称作USP7)，值得注意的是HAUSP特异地去除PTEN的单泛素化、促使PTEN从细胞核移位到细胞质，但并不影响PTEN的蛋白稳定性和蛋白量。确实，单泛素化和K63链式的多聚泛素化一般并不影响蛋白质的降解，而包括K48链式在内的其他类型的多聚泛素化才介导蛋白质的降解。因此，截至目前，去除PTEN多聚泛素化、抑制PTEN降解的DUB仍未见报道。
[0005]0TUD3是在国际上首次鉴定到的一个重要的蛋白，截止目前国际上0TUD3所公开的信息只有其基因序列、蛋白序列与其OTU结构域的空间结构，关于它的生物学功能与疾病相关性则均无公开。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供0TUD3蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体或表达0TUD3蛋白的慢病毒的用途。
[0007]本发明提供的0TUD3蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体或表达0TUD3蛋白的慢病毒在制备具有如下1)-9)中至少一种功能的产品中的应用:
[0008]I)治疗和/或预防肿瘤；2)抑制肿瘤细胞增殖；3)促进肿瘤细胞凋亡；4)抑制肿瘤细胞迁移；5)抑制肿瘤细胞伪足形成；6)抑制肿瘤细胞的软琼脂集落形成能力；7)抑制正常细胞发生癌变；8)抑制肿瘤形成；9)抑制肿瘤发生转移；所述0TUD3蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0009]上述应用中，所述0TUD3蛋白编码基因的核昔酸序列为序列表中序列I。
[0010]上述应用中，所述含有其编码基因的重组载体为将所述0TUD3蛋白编码基因插入表达载体中得到的重组载体；
[0011 ] 所述表达载体具体为慢病毒表达载体或原核表达载体。
[0012]上述应用中，所述表达0TUD3蛋白的慢病毒为将含有其编码基因的重组慢病毒载体侵染宿主细胞，包装得到慢病毒；
[0013]所述重组慢病毒载体为将所述0TUD3蛋白编码基因插入慢病毒表达载体中得到的重组载体。
[0014]本发明另一个目的是提供抑制0TUD3蛋白表达的物质的用途。
[0015]本发明提供的抑制0TUD3蛋白表达的物质在制备具有如下I)-8)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围:1)促进肿瘤细胞增殖；2)抑制肿瘤细胞凋亡；3)促进肿瘤细胞迁移；4)促进肿瘤细胞伪足形成；5)促进肿瘤细胞的软琼脂集落形成能力；6)促进正常细胞发生癌变；8)促进肿瘤形成；8)促进肿瘤发生转移。
[0016]上述应用中，所述抑制0TUD3蛋白表达的物质为0TUD3蛋白的抑制剂，为干扰0TUD3基因表达的siRNA、干扰0TUD3基因表达的shRNA、含有干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的重组载体、表达干扰0TUD3基因表达的shRNA的慢病毒；
[0017]所述干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的核昔酸序列为序列表中序列6或序列7。
[0018]上述应用中，所述含有干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的重组载体为将干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因插入表达载体中得到的重组载体；
[0019]所述表达载体具体为慢病毒表达载体或原核表达载体；
[0020]所述表达0TUD3蛋白的慢病毒为将含有其编码基因的重组慢病毒载体侵染宿主细胞，包装得到慢病毒；
[0021]所述重组慢病毒载体为将所述0TUD3蛋白编码基因插入慢病毒表达载体中得到的重组载体。
[0022]上述应用中，所述肿瘤为乳腺癌、结肠癌、肝癌或子宫颈癌。
[0023]上述应用中，所述产品为药品。
[0024]本发明的第三个目的是提供一种抑制0TUD3蛋白表达的物质。
[0025]本发明提供的物质，为干扰0TUD3基因表达的siRNA、所述干扰0TUD3基因表达的shRNA、所述含有干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的重组载体或所述表达干扰0TUD3基因表达的shRNA的慢病毒；
[0026]所述干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6或序列7。
[0027]本发明的实验证明，0TUD3作为抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶，通过去除PTEN的多聚泛素化修饰、抑制PTEN蛋白质降解、稳定细胞质中PTEN的蛋白稳定性,从而抑制Akt通路的激活。裸鼠成瘤实验表明0TUD3的敲低显著促进细胞的成瘤能力及转移能力，而0TUD3的过表达则显著抑制肿瘤的生长。转基因小鼠模型也证明0TUD3的高表达能够抑制小鼠乳腺癌的发生发展。来自乳腺癌病人的临床样本显示0TUD3在癌旁组织中的表达高于癌组织，与PTEN的表达成正相关。进一步的分析发现在癌组织中0TUD3存在功能性基因突变，是在国际上首次发现0TUD3作为一个抑癌蛋白抑制肿瘤的生成与转移。
[0028]综上所述，0TUD3作为一个新发现的重要抑癌蛋白，可以抑制肿瘤的生成与转移，0TUD3功能的发现将对肿瘤诊断、预防及治疗提供重要的科学依据与应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为敲低0TUD3的表达促进肿瘤细胞的生长与迁移
[0030]其中，IA敲低0TUD3的表达细胞增殖实验结果；IB细胞凋亡实验结果；IC在乳腺癌细胞MCF7中敲低0TUD3的表达迁移能力结果；1D在结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞H印G2以及子宫颈癌细胞HeLa中敲低0TUD3的表达迁移能力结果；1E在乳腺癌细胞MCF7、结肠癌细胞HCTl 16、肝癌细胞H印G2以及子宫颈癌细胞HeLa中敲低0TUD3的表达细胞伪足结果；IF软琼脂集落形成实验。
[0031 ] 图2为0TUD3抑制肿瘤细胞生长
[0032]图2A，2B为敲低0TUD3的表达软琼脂集落形成实验及裸鼠成瘤实验结果；
[0033]图2C，2D为过表达0TUD3软琼脂集落形成及裸鼠成瘤能力；
[0034]图2E、2F、2G、2H为0TUD3抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的发生结果；
[0035]图21为其它肿瘤细胞中敲低0TUD3的表达WB结果；
[0036]图3为敲低0TUD3的肿瘤细胞发生肝转移
[0037]图3A-3D为敲低0TUD3肿瘤细胞的肝转移能力结果；
[0038]图3E为对临床肿瘤(乳腺癌、结直肠癌等)病人样本癌旁组织中0TUD3的mRNA结果;
[0039]图3F为通过免疫组化分析发现0TUD3在癌旁组织中的表达；
[0040]图3G、3H、3I对200多例临床样本分析0TUD3的表达与PTEN的表达呈正相关性；
[0041]图4为0TUD3突变体E86K对肿瘤细胞的生长与迁移的影响
[0042]图4A为0TUD3突变位点E86K ；
[0043]图4B和4C为E86K的突变导致0TUD3丧失了对PTEN的稳定作用；
[0044]图4D和4E为E86K的突变使0TUD3丧失了对PTEN的去泛素化能力；
[0045]图4F和4G为E86K突变导致细胞增殖加快；
[0046]图4H为E86K突变导致细胞迁移能力增强；
[0047]图41为E86K突变有利于细胞伪足；
[0048]图4J为E86K突变利于细胞软琼脂集落的形成。
【具体实施方式】
[0049]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0050]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051]实施例1、过表达0TUD3慢病毒和敲低0TUD3表达慢病毒的获得
[0052]1、过表达0TUD3慢病毒的获得
[0053]I)、0TUD3蛋白及编码基因的获得
[0054]人源0TUD3基因包含8个外显子和7个内含子，其mRNA序列全长6523nt (核苷酸序列为序列5)，CDS区为1197nt (核苷酸序列为序列1)，编码一个含有398个氨基酸的蛋白质0TUD3 (氨基酸序列为序列2)。
[0055]0TUD3蛋白主要含有2个结构域:0TU (ovarian tumor domain)结构域和UBA (ubiquitin-associated domain)结构域。通过激光共聚焦显微镜观察到0TUD3主要定位于细胞的细胞质中。
[0056]利用购买的0TUD3抗体，在12种乳腺癌细胞系、HCT116(结肠癌细胞)、H印G2(肝癌细胞)以及HeLa (子宫颈癌细胞)和293T (人胚肾细胞)中检测了 0TUD3的表达，结果显示0TUD3在各细胞系中均有表达，但在转移能力较强的乳腺癌细胞中表达很低。
[0057]2)、过表达0TUD3重组质粒Flag_0TUD3的制备
[0058]设计正向反向引物对:
[0059]正向引物:gatGAATTC a ATGTCCCGAAAGCAGGCGG(斜体为 EcoRI 的酶切位点)
[0060]反向引物:ataGGTACC TCAGATGTTGAGAGCGGCG(斜体为 KpnI 的酶切位点)
[0061]以人工合成的序列2为模板，用上述引物对进行PCR扩增，回收1216bpPCR扩增产物。用限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的pFlag-CMV-2表达载体(Sigma，目录号为E7398)连接，得到重组载体Flag-0TUD3,经过测序,该重组质粒为将序列表序列2所示的0TUD3插入pFlag-CMV-2表达载体的EcoR I和Kpn I酶切位点间得到的重组载体。
[0062]3)过表达0TUD3的慢病毒制备
[0063]设计正向反向引物对:
[0064]正向引物:gatggatcc ac ATGTCCCGAAAGCAGGCGG(斜体为 BamH I 的酶切位点)
[0065]反向引物:ataaccggt TCAGATGTTGAGAGCGGCG(斜体为 Age I 的酶切位点)
[0066]以Flag_0TUD3质粒为模板，用上述引物对进行PCR扩增，回收1216PCR扩增产物，用限制性内切酶BamH I和Age I双酶切上述PCR扩增产物，回收酶切产物，将酶切产物与AgeI酶切的慢病毒表达载体FUGW(Addgene，目录号为14883)连接，得到重组慢病毒过表达质粒,经过测序,重组慢病毒过表达质粒为将序列表中序列2所示的0TUD3插入慢病毒表达载体FUGW的Age I酶切位点间得到的载体。
[0067]将重组慢病毒过表达质粒与慢病毒包装载体psPAX2、pMD2.G(Invitrogen)共转染293T细胞，收集带病毒的细胞培养液，浓缩储存，得到过表达0TUD3的慢病毒(滴度为5X108TU/ml)。
[0068]将FUGW与慢病毒包装载体psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞，收集带病毒的细胞培养液，浓缩储存，得到阴性对照慢病毒。
[0069]2、敲低0TUD3表达的慢病毒制备
[0070]设计如下三条靶向人源0TUD3基因的shRNA的编码基因:
[0071 ] #1: TGGAAATCAGGGCTTAAAT (序列 6)
[0072]#2:GAGTTACACATCGCATATC (序列 7)
[0073]#3: CGTCTGCCATCGCATATTA (序列 8)
[0074]Contro 1: TTCTCCGAACGTGTCACGT (序列 9)
[0075]以上各条shRNA以及阴性对照control shRNA由Dharmacon公司负责合成。
[0076]分别将合成的四条shRNA连接到慢病毒载体GV112上，得到连接不同shRNA的重组慢病毒敲低质粒#1、#2、#3。
[0077]经过测序，
[0078]重组慢病毒敲低质粒#1为将序列表中序列6所示的核苷酸插入慢病毒载体GV112的Agel和EcoRl酶切位点间得到的载体；
[0079]重组慢病毒敲低质粒#2为将序列表中序列7所示的核苷酸插入慢病毒载体GV112的Agel和EcoRl酶切位点间得到的载体；
[0080]重组慢病毒敲低质粒#3为将序列表中序列8所示的核苷酸插入慢病毒载体GVl 12的Agel和EcoRl酶切位点间得到的载体。
[0081]将重组慢病毒敲低质粒#1、重组慢病毒敲低质粒#2、重组慢病毒敲低质粒#3分别与慢病毒包装载体psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞，收集带病毒的细胞培养液，浓缩储存，得到敲低0TUD3表达的慢病毒#1、#2、#3 (滴度均为5X 108TU/ml)。
[0082]实施例2、0TUD3或敲低0TUD3表达的物质的功能研究
[0083]一、0TUD3在抑制肿瘤细胞的增殖中的应用
[0084]用由实施例1制备的敲低0TUD3表达的慢病毒#1、过表达0TUD3的慢病毒和阴性对照慢病毒分别感染乳腺癌细胞MCF7(北京协和医科大学细胞库)，通过嘌呤霉素筛选得到敲低0TUD3表达的细胞系MCF7、过表达0TUD3的细胞系MCF7和阴性对照细胞系MCF7。
[0085]将IX 13个上述3种细胞分别种植于96孔板中，培养24小时、48小时、72小时、96小时、120小时后加入0.05mg Inr1MTS (Promega)，在37°C继续培养4小时后，检测490纳米光波下的吸光度值(0D490)。根据标准曲线计算相应的细胞数。
[0086]结果如图1A所示:
[0087]敲低0TUD3表达的细胞系MCF7 (sh0TUD3#l)培养24小时、48小时、72小时、96小时的细胞数分别为3X 103、5.5X 103、8X 103、1.6X 14个;阴性对照细胞系MCF7 (control)培养24小时、48小时、72小时、96小时的细胞数分别为1.5Χ103、3.5Χ 103、4X 103、7X 13个。
[0088]结果如图4G所示:
[0089]过表达0TUD3的细胞系MCF7 (0TUD3-WT)培养24小时、48小时、72小时、96小时、120小时的细胞数分别为2X103、3X103、4.5X 13,8X 13U.1 X 14个；阴性对照细胞系MCF7培养24小时、48小时、72小时、96小时、120小时的细胞数分别为3Χ103、5.5Χ103、8Χ103、1.2Χ104、1.8Χ104 个。
[0090]从上述可以看出，与阴性对照细胞系相比，过表达0TUD3细胞系抑制肿瘤细胞增殖；敲低0TUD3细胞系促进肿瘤细胞增殖，表明，0TUD3抑制肿瘤细胞增殖、敲低0TUD3表达的慢病毒促进肿瘤细胞增殖。
[0091]二、0TUD3促进肿瘤细胞的凋亡
[0092]敲低0TUD3表达的细胞系MCF7 (sh0TUD3#l)和阴性对照细胞系MCF7 (control)培养48小时后加10 μ M cisplatin(Sigma)和阴性对照试剂DMSO处理12小时，收集细胞，用PBS 洗漆后，用 fluorescein isoth1cyanate-Annexin V and propidium 1dide (BeijingB1sea b1technology Annexin V Kit)染色。用流式细胞仪检测凋亡细胞的比率。
[0093]结果如图1B所示:
[0094]敲低0TUD3表达的细胞系凋亡细胞的比率为12% ；
[0095]阴性对照细胞系转染的细胞系凋亡细胞的比率为28%。
[0096]从上述可以看出，与阴性对照细胞系相比，敲低0TUD3细胞系抑制肿瘤细胞凋亡，表明，0TUD3促进肿瘤细胞凋亡，敲低0TUD3的慢病毒抑制肿瘤细胞凋亡。
[0097]三、0TUD3抑制肿瘤细胞的迁移
[0098]用敲低0TUD3表达的慢病毒#1、#2和阴性对照慢病毒分别感染乳腺癌细胞MCF7、结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞H印G2以及子宫颈癌细胞HeLa，通过嘌呤霉素筛选得到敲低0TUD3 表达的细胞系 MCF7 (#1、#2)、HCTl 16 (#1、#2)、H印G2 (#1、#2)、HeLa (#1、#2)和阴性对照细胞系MCF7、HCT116、H印G2、HeLa。用0TUD3过表达的慢病毒和阴性对照慢病毒分别感染乳腺癌细胞MCF7，通过嘌呤霉素筛选得到0TUD3过表达的细胞系MCF7和阴性对照细胞系MCF7。
[0099]将IX 16个上述各种细胞分别悬浮于不含有血清的培养基中种植于transwell小皿的内室中，外室中添加含有10% FBS的培养基。培养48小时后，用棉签去除内室的细胞，在外室培养基中加入终浓度0.05mg Iiir1MTS(Promega)，在37°C继续培养4小时后，在490纳米光波下检测吸光度值。
[0100]结果如图1C所示:
[0101]敲低0TUD3表达的细胞系MCF7(sh01D3#l)迁移的细胞数为1.4X 15个；
[0102]敲低0TUD3表达的细胞系MCF7 (sh01D3#2)迁移的细胞数为1.6 X 15个；
[0103]阴性对照的细胞系MCF7的迁移细胞数为0.6 X 15个；
[0104]结果如图1D所示:
[0105]敲低0TUD3表达的细胞系HCT116(sh0TUD3#l)迁移的细胞数为1.2X 15个；
[0106]敲低0TUD3表达的细胞系HCT116(sh0TUD3#2)迁移的细胞数为1.0X 15个
[0107]敲低0TUD3表达的细胞系H印G2(sh0TUD3#l)迁移的细胞数为1.4X 15个；
[0108]敲低0TUD3表达的细胞系H印G2 (sh0TUD3#2)迁移的细胞数为1.5 X 15个
[0109]敲低0TUD3表达的细胞系HeLa(sh0TUD3#l)迁移的细胞数为0.85 X 15个；
[0110]敲低0TUD3表达的细胞系HeLa(sh0TUD3#2)迁移的细胞数为0.9 X 15个；
[0111]阴性对照的细胞系HCT116的迁移细胞数为0.3X105个；
[0112]阴性对照的细胞系!fepG2的迁移细胞数为0.4 X 15个；
[0113]阴性对照的细胞系HeLa的迁移细胞数为0.2 X 15个。
[0114]结果如图4H所示:
[0115]0TUD3过表达的细胞系MCF7 (0TUD3-WT)迁移的细胞数为0.5 X 14个；
[0116]阴性对照的细胞系MCF7(_)的迁移细胞数为2.2 X 14个；
[0117]可以看出，0TUD3抑制肿瘤细胞的迁移，敲低0TUD3表达的慢病毒促进迁移。
[0118]四、0TUD3抑制肿瘤细胞伪足的形成
[0119]用敲低0TUD3表达的慢病毒#1和阴性对照慢病毒分别感MCF7、HCT116、H印G2和HeLa ;通过嘌呤霉素筛选得到敲低0TUD3表达的细胞系MCF7、HCT116、H印G2、HeLa和阴性对照细胞系 MCF7、HCTl 16、H印G2、HeLa。
[0120]将上述各种细胞株种植在confocal小皿中，48小时后，对细胞进行固定。封闭处理后对F-actin，PTEN, 0TUD3进行间接免疫荧光染色以及对细胞核进行DAPI染色。通过激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞伪足的形成情况。
[0121]结果如图1E所示，control为阴性对照细胞系MCF7、sh0TUD3为敲低0TUD3表达的细胞系MCF7(sh 0TUD3#1)，可以看出，与control相比，sh0TUD3伪足的形成能力显著增强。
[0122]转染结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞H印G2以及子宫颈癌细胞HeLa，结果与上述无显著差异。
[0123]表明，0TUD3抑制肿瘤细胞伪足的形成、敲低0TUD3表达的慢病毒促进肿瘤细胞伪足的形成。
[0124]五、0TUD3抑制肿瘤细胞的软琼脂集落形成能力
[0125]用敲低0TUD3表达的慢病毒#1、#2、过表达0TUD3的慢病毒和阴性对照慢病毒分别感染乳腺癌细胞MCF7，通过嘌呤霉素筛选得到敲低0TUD3表达的细胞系MCF7、过表达0TUD3的细胞系MCF7、阴性对照细胞系MCF7。
[0126]在6孔板中加入Iml含有0.7%低熔点琼脂糖和10% FBS的DMEM培养基。将上述各细胞系IX 14个稳定细胞株悬浮于含有0.35%低熔点琼脂糖和10% FBS的DMEM培养基，加入上层。在37°C、5% CO2恒温箱中连续培养3周后，进行结晶紫染色对直径大于
0.1mm的克隆群进行计数。
[0127]结果如图1F所示:
[0128]敲低0TUD3表达的细胞系MCF7(sh0TUD3#l)的克隆群数为100个左右，敲低0TUD3表达的细胞系MCF7 (sh0TUD3#2)的克隆群数为90个左右，阴性对照细胞系MCF7的克隆群数为25个左右；
[0129]结果如图4J所示:
[0130]过表达0TUD3的细胞系MCF7(WT)的克隆群数为100个左右，阴性对照细胞系MCF7的克隆群数为35个左右。
[0131]表明，敲低0TUD3的慢病毒促进MCF7细胞的软琼脂集落形成能力，0TUD3抑制MCF7细胞的软琼脂集落形成能力。
[0132]六、敲低0TUD3促进正常细胞的癌变
[0133]用敲低0TUD3表达的慢病毒#1、#2和阴性对照慢病毒分别感染正常乳腺上皮细胞MCFlOA(北京协和医科大学细胞库)，通过嘌呤霉素筛选得到敲低0TUD3表达的细胞系MCF1A、阴性对照细胞系MCF1A。
[0134]用Western blotting检测(WB检测)敲低 0TUD3 表达的细胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、阴性对照细胞系MCF10A，结果如图2A所示，可以看出，与阴性对照细胞系MCFlOA相比，sh0TUD3#l和sh0TUD3#2细胞中0TUD3表达量明显降低，说明敲低成功。
[0135]在6孔板中加入Iml含有0.7%低熔点琼脂糖和10% FBS的DMEM培养基。将I X 14个敲低0TUD3表达的细胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、阴性对照细胞系MCFlOA悬浮于含有0.35%低熔点琼脂糖和10% FBS的DMEM培养基，加入上层。在37°C、5% CO2恒温箱中连续培养3周后，进行结晶紫染色对直径大于0.1mm的克隆群进行计数。
[0136]结果如图2B所示，
[0137]敲低0TUD3表达的细胞系MCFlOA(sh0TUD3#l)的克隆群数为100个左右；敲低0TUD3表达的细胞系MCFlOA (sh0TUD3#2)的克隆群数为90个左右；
[0138]阴性对照细胞系MCFlOA却没有克隆形成。
[0139]将24只6周龄雌裸鼠随机分为3组，分别将2X 17个上述制备的敲低0TUD3表达的细胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、阴性对照细胞系MCFlOA (control)种植在6周龄雌裸鼠的近腋窝处的皮下。每周观察小鼠的成瘤情况。对肿瘤做H&E染色和免疫组化分析。
[0140]结果如下表I所示，
[0141]
裸鼠皮+K注射敲低0TUD3奪圍性对愿_胞系MCFlOA后的成瘤怙况
?瘤小鼠的数.? (%)—
3周4周5周
Control 0/8 (0)0/8 (0)0/8 (0)
shOTUDS #1 4/8 (50)δ/8 (62.δ)5/8 (62.5)
shOTUDS #2 3/8 (87.5) 4/8 (50)5/8 (62.5)
[0142]sh0TUD3#l组有5只小鼠成瘤；
[0143]sh0TUD3#2组有5只小鼠成瘤；
[0144]control组有O只小鼠成瘤；
[0145]可以看出，敲低0TUD3促进正常细胞的癌变。
[0146]七、过表达0TUD3抑制肿瘤的形成
[0147]用上述得到的0TUD3过表达的以及阴性对照慢病毒感染乳腺癌细胞MCF7，通过嘌呤霉素筛选得到0TUD3过表达细胞系MCF7、阴性对照细胞系MCF7。
[0148]用WB检测0TUD3过表达细胞系MCF7 (WT)、阴性对照细胞系MCF7，结果如图2C所示，可以看出，与阴性对照细胞系MCF7相比，0TUD3过表达细胞系MCF7 (WT)中0TUD3表达量明显提高，说明过表达成功。
[0149]在6孔板中加入1ml含有0.7%低熔点琼脂糖和10% FBS的DMEM培养基。将I X 14个0TUD3过表达细胞系MCF7 (WT)、阴性对照细胞系MCF7悬浮于含有0.35%低熔点琼脂糖和10% FBS的DMEM培养基，加入上层。在37°C、5% CO2恒温箱中连续培养3周后，进行结晶紫染色对直径大于0.1mm的克隆群进行计数。
[0150]结果如2D所示， [0151 ] 0TUD3过表达细胞系MCF7 (WT)的克隆群数为35个左右；
[0152]阴性对照细胞系MCF7的克隆群数为100个左右。
[0153]将16只6周龄雌裸鼠随机分为2组，将2 X 17个0TUD3过表达细胞系MCF7 (WT)、阴性对照细胞系MCF7分别种植在6周龄雌裸鼠的近腋窝处的皮下。每周观察小鼠的成瘤情况。对肿瘤做H&E染色和免疫组化分析。
[0154]结果如表2所示，
【权利要求】
1.0TUD3蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体或表达0TUD3蛋白的慢病毒在制备具有如下1)-9)中至少一种功能的产品中的应用: 1)治疗和/或预防肿瘤； 2)抑制肿瘤细胞增殖； 3)促进肿瘤细胞凋亡； 4)抑制肿瘤细胞迁移； 5)抑制肿瘤细胞伪足形成； 6)抑制肿瘤细胞的软琼脂集落形成能力； 7)抑制正常细胞发生癌变； 8)抑制肿瘤形成； 9)抑制肿瘤发生转移； 所述0TUD3蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述0TUD3蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述含有其编码基因的重组载体为将所述0TUD3蛋白编码基因插入表达载体中得到的重组载体； 所述表达载体具体为慢病毒表达载体或原核表达载体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述表达0TUD3蛋白的慢病毒为将含有其编码基因的重组慢病毒载体侵染宿主细胞，包装得到慢病毒； 所述重组慢病毒载体为将所述0TUD3蛋白编码基因插入慢病毒表达载体中得到的重组载体。
5.抑制0TUD3蛋白表达的物质在制备具有如下1)-8)中至少一种功能的产品中的应用: 1)促进肿瘤细胞增殖； 2)抑制肿瘤细胞凋亡； 3)促进肿瘤细胞迁移； 4)促进肿瘤细胞伪足形成； 5)促进肿瘤细胞的软琼脂集落形成能力； 6)促进正常细胞发生癌变； 7)促进肿瘤形成； 8)促进肿瘤发生转移。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于: 所述抑制0TUD3蛋白表达的物质为干扰0TUD3基因表达的siRNA、干扰0TUD3基因表达的shRNA、含有干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的重组载体、表达干扰0TUD3基因表达的shRNA的慢病毒； 所述干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6或序列7。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于: 所述含有干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因的重组载体为将干扰0TUD3基因表达的shRNA编码基因插入表达载体中得到的重组载体； 所述表达载体具体为慢病毒表达载体或原核表达载体； 所述表达0TUD3蛋白的慢病毒为将含有其编码基因的重组慢病毒载体侵染宿主细胞，包装得到慢病毒； 所述重组慢病毒载体为将所述0TUD3蛋白编码基因插入慢病毒表达载体中得到的重组载体。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于:所述肿瘤为乳腺癌、结肠癌、肝癌或子宫颈癌。
9.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于:所述产品为药品。
10.一种抑制OTUD3蛋白表达的物质，为干扰OTUD3基因表达的siRNA、所述干扰OTUD3基因表达的shRNA、所述含有干扰OTUD3基因表达的shRNA编码基因的重组载体或所述表达干扰OTUD3基因表达的shRNA的慢病毒； 所述干扰OTUD3基因表达的shRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6或序列7。
【文档编号】A61K48/00GK104174012SQ201410413298
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】张令强, 贺福初, 袁林, 吕艳蓉, 李洪昌, 邢桂春 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所