抑制肿瘤生长与转移的siRNA双干扰组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤治疗药物应用领域，特别涉及一种抑制乳腺癌肿瘤生长与转移的SiRNA双干扰组合物及其应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来包括中国在内的发展中国家女性乳腺癌的发病正呈明显升高的趋势。据统计2008年我国女性乳腺癌发病率约为47.64/10万，居女性恶性肿瘤发病率的第二位，仅次于第一位的肺癌。当前乳腺癌肿瘤治疗的方针是以手术及放疗、化疗为主，得益于乳腺癌防治知识的普及以及早期诊断技术的提高，乳腺癌致死率的增长趋势近年来得以缓解，但是乳腺癌晚期及手术后的肿瘤转移现象仍然不能完全避除，这大大影响了治疗的预后及患者的生存质量，因此，探寻肿瘤转移发生的机制，寻找有效的防止肿瘤转移的方法已然成为解决乳腺癌肿瘤治疗的当务之急。临床研究表明，淋巴系统与早期乳腺癌转移密切相关，淋巴转移往往是乳腺癌转移发生的第一个步骤。
[0004]淋巴管生长因子C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)属于 VEGF家族的成员，由Joukov于1996年首次发现，是唯一特异性作用于脉管内皮细胞的生长因子。由于其在癌组织中大量表达，而且能促进肿瘤内新淋巴管的生成，因此被认为在肿瘤的淋巴转移中起到关键作用。VEGF-C的受体为VEGFR-2与VEGFR-3，其中VEGFR-2结合VEGF-C后可以促进血管的生成，而VEGFR-3结合VEGF-C后可以诱导胞内的丝裂原活化蛋白酶(MAPK)与蛋白激酶B(Akt)发生磷酸化，从而保护内皮细胞免于凋亡，促进淋巴内皮细胞增殖与迁移，最终促进淋巴管的新生与肿瘤的淋巴管转移。VEGF-C在乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌等肿瘤组织中高表达，能够通过促进淋巴管的生成以及改变癌细胞的生物学性状影响肿瘤疾病的进程。
[0005]细胞凋亡是一个多基因控制下的细胞自我灭亡过程，而Survivin是乳腺癌肿瘤细胞避免凋亡的重要因素。survivin是凋亡抑制基因家族成员，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，在细胞生长发育中起到重要的作用。Survivin在分化成熟的正常组织中几乎不表达，却在胚胎期的脏器以及肿瘤组织中大量表达。Survivin可以作用于细胞的紡锤体微管，从而发挥抗凋亡作用，进而促进肿瘤细胞的分裂增殖和浸润能力。Survivin还能保护肿瘤细胞并能够增强肿瘤细胞的转移，降低肿瘤细胞对化疗药物和放射的敏感性，其表达与肿瘤的恶性程度及病人的预后密切相关。
[0006]目前公开的均为单一抑制Survivin表达的siRNA分子，如专利号200910051374.0 —种抑制Survivin表达的siRNA分子及其应用和专利号200910054393.3 一种干扰Survivin表达的siRNA分子及其应用。然而单一抑制靶向基因表达的应用有其使用的局限性，例如VEGF-C的抑制主要是针对肿瘤的淋巴转移进行治疗，虽然有报道称VEGF-C对肿瘤具有一定的抑凋亡及促进生存的作用，但抑制VEGF-C所造成的促进肿瘤细胞凋亡及抑制增长的效果相对于survivin的抑制来讲仍然不具有优势。相反survivin的主要作用为抑制肿瘤细胞的凋亡以及促进肿瘤细胞的增长，同时也具有增强肿瘤细胞转移的功能，但对于survivin单独沉默而言，其抑制肿瘤细胞淋巴转移的结果并不及VEGF-C的抑制。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术中的不足，提供了一种包含靶向VEGF-C与靶向survivin的siRNA药物组合物，以及该组合物在乳腺癌症治疗中的用途。
[0009]由于VEGF-C与survivin作为乳腺癌肿瘤治疗的靶点均具有肿瘤的特异性，同时又具有肿瘤的普遍适宜性特点，应用小干扰RNA (siRNA)沉默VEGF-C与survivin的表达能够有效的抑制肿瘤的生长与转移，将VEGF-C-siRNA与survivin-siRNA组合应用，比单一的任何一种siRNA能够更加有效的治疗乳腺癌肿瘤疾病。进一步而言，针对不同的肿瘤类型以及病情发展状况可以相应的调节本组合药物中两种siRNA的配比进行有侧重的对症治疗。
[0010]本发明的技术方案是:
一种SiRNA双干扰组合物，包括寡聚核酸VEGF-C-SiRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子；所述寡聚核酸VEGF_C_siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ IDN0.1，反义链为SEQ ID N0.2 ;所述寡聚核酸survivin-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID N0.3，反义链为 SEQ ID N0.4。
[0011]以上方案的基础上，所述寡聚核酸VEGF-C-SiRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子按照质量比(0-2): (2-0)混合。
[0012]优选的，所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和所述寡聚核酸survivin-siRNA分子按照质量比1:1混合。
[0013]以上寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子核苷酸序列的获得均通过以下方法:
首先在NCBI网站的Genbank中获取小鼠VEGF-C mRNA的全长序列(GenBankaccess1n N0.NM_009506)以及小鼠 survivin mRNA 的全长序列(GenBank access1nN0.NM_009689)，然后将其分别输入invitrogen公司的在线设计软件进行靶向siRNA设计以及BLAST同源基因序列比对排除。
[0014]本发明所解决的另一问题是，提供所述的siRNA双干扰组合物在制备抗乳腺癌基因治疗药物中的应用。
[0015]本发明公开的siRNA双干扰组合物，可包含至少一种药学上可接受的载体。
[0016]所述的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的双链RNA分子相容。所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)，jetPEI(线性聚乙烯亚胺)，TF-PEU转铁蛋白聚乙烯亚胺)脂质体，转铁蛋白，叶酸等。
[0017]本发明的有益效果是:
将小鼠乳腺癌细胞株4T1接种于Balb/c小鼠的腋下脂肪垫中，用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染移植瘤细胞的实验结果表明VEGF-C- siRNA+survivin-siRNA的组合物能够在体内有效抑制上述肿瘤生长以及肿瘤细胞的肺转移。
[0018]作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。
【附图说明】
[0019]图1 为 MTT 法检测不同配比{(0-2): (2-0)}的 survivin-siRNA 与VEGF-C-siRNA组合物转染肿瘤细胞48小时后对肿瘤细胞增殖的影响；
其中，a表示与Blank组比较有统计学意义(P〈0.05) ;b表示与10nM浓度siVC组比较有统计学意义(P〈0.05)。
[0020]图2为细胞划痕实验检测不同配比{(0-2): (2-0)}的survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物转染肿瘤细胞24小时后对肿瘤细胞迁移性能的影响；
其中，a表示与Blank组比较有统计学意义(P〈0.05) ;b表示与10nM浓度siVC组比较有统计学意义(P〈0.05)。
[0021]图3为细胞划痕实验检测不同配比{(0-2): (2-0)}的survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物转染后，不同实验组肿瘤细胞增殖率(对应组OD值/Blank组OD值)与迁移率(对应组迁移距离/Blank组迁移距离)在同一图表中表示的曲线图；
其中，I 为 10nM 浓度 NC-siRNA 组；2_10 分别代表 VEGF-C-siRNA:survivin-siRNA 质量浓度配备分别为0:2,0.5:2、1:2U.5:2、2:2、2:1.5、2:1、2:0.5的各实验组。
[0022]图 4 为 RT-PCR 检测 survivin-siRNA 及 survivin-siRNA 与 VEGF-C-siRNA 组合物抑制肿瘤细胞的survivin的mRNA表达图；
其中，泳道I为未转染的细胞，2为转染随机序列的阴性对照(NC)，3为转染survivin-siRNA, 4 为转染组合 siRNA。
[0023]图 5 为 RT-PCR 检测 VEGF-C-siRNA 及 survivin-siRNA 与 VEGF-C-siRNA 组合物抑制肿瘤细胞的VEGF-C的mRNA表达图；
其中，泳道I为未转染的细胞，2为转染随机序列的阴性对照(NC)，3为转染转染VEGF-C-siRNA，4 为转染组合 siRNA。
[0024]图6 为生理盐水、NC-siRNA、survivin-siRNA, VEGF-C-siRNA 以及二者组合物治疗乳腺癌移植瘤6次以后各组间小鼠的