抑制肿瘤生长的新抗体、其衍生物及其应用的制作方法

专利名称：抑制肿瘤生长的新抗体、其衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗人癌蛋白HER2(erbB2)的单克隆抗体及生产其的杂交瘤细胞。本发明还涉及该单克隆抗体的重链和轻链可变区基因，及应用所述基因产生的一族抗体衍生物，及所述抗体及衍生物的应用。
HER2又称c-erbB2，是一种原癌基因，编码一分子量为185KD的具有酪氨酸激酶活性的细胞跨膜蛋白，定义为p185，属表皮生长因子(EGFR)受体家族的成员，但其特性不同于EGFR。1981年Shih等首先发现在乙基硝脲诱导的大鼠神经母细胞瘤中存在一种有转化活性的癌基因，并命名为neu，此后Sohechter进一步证实了neu癌基因的存在，在人类肿瘤中也发现相应的基因，命名为HER2或c-erbB2。人HER2的产物p185磷酸蛋白由三部分组成，即胞外区，跨膜区及胞内区，HER2基因位于人17号染色体q21带上。
众多的研究资料证明，人类多种上皮来源的恶性肿瘤都有HER2的扩增或过度表达，而正常组织或良性肿瘤组织极少有HER2表达或低表达，Clark报道30-60％的乳癌有HER2的过度表达或扩增，20-30％卵巢癌、30-55％胃癌、27-56％的非小细胞肺癌、肺腺癌、40％肾癌、36％膀胱癌等均有HER2的过量表达或扩增，同时还发现癌旁组织HER2表达显著低于癌组织、转移灶HER2明显地高表达，这些资料表明HER2在肿瘤发生发展转移中起着重要的作用，是肿瘤进展中的一个重要步骤，因此HER2是治疗恶性肿瘤的一个重要的特异性强的靶分子。有实验证明HER2拮抗剂，如抗体、反义寡核苷酸均能抑制多种肿瘤的生长、转移并与病人的预后及存活期密切相关。Slamon等报道HER2表达水平越高的乳癌病人易于复发，预后差，存活期越短。HER2高表达的卵巢癌病人平均存活期只有0.67年，而HER2低表达的病人平均存活期为5年，类似的资料还见于小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤病人。目前临床上常规治疗肿瘤的三大措施为手术、放射治疗(放疗)、化学药物治疗(化疗)，对早期肿瘤病人及尚未发生转移的病人有较好的疗效，但对已发生转移或手术后又发生复发转移的病人则无济于事，这些病人治愈率低、死亡率高，尽管化疗也能用于治疗已发生转移或复发的肿瘤病人，但因化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞，因此毒副作用大，许多病人常因严重副作用而无法完成常规的治疗疗程。同时目前肿瘤死亡率居高不下(占疾病死亡的第一、二位)，其主要原因之一是目前三大常规治疗后的各种肿瘤病人复发率高，一般可达40-50％，有的肿瘤高达60-70％，因此寻找和开发新的特异性杀伤肿瘤细胞、解决肿瘤复发转移的治疗剂是肿瘤治疗急待解决的重要问题，也是降低肿瘤病人死亡率的关键问题，目前正在研制开发的各种生物治疗剂中，如基因治疗、继承性免疫治疗(如LAK细胞、TIL细胞)、各种因子及抗体导向治疗等尚未找到一类有效的治疗剂。HER2在多种肿瘤的特异性高表达且与肿瘤的复发、转移及预后密切相关，因此为开发以HER2为靶分子的特异性地杀伤HER2高表达的肿瘤细胞的新治疗剂提供了重要依据。HER2是在肿瘤细胞表面表达的大分子蛋白，具有免疫原性，能在异种动物体内产生抗人HER2的抗体，这种抗体能特异地识别HER2蛋白分子(抗原)，并与之结合，这种识别的特异性非常专一，因此抗人HER2的抗体只能与人HER2抗原结合，决不会与任何其它分子结合。利用小鼠，采用杂交瘤技术可以制备抗人HER2的单克隆抗体，将这种抗体偶联上能有效杀伤肿瘤细胞的放射核素、化疗药物及其它有效生物制剂，注入人体内，由于HER2抗体能专一地识别HER2蛋白分子，这些抗体的偶联物，将由抗HER2抗体特异地带到细胞表面表达有HER2蛋白分子的肿瘤细胞上，直接杀伤肿瘤细胞，而无HER2表达的正常细胞因为这些带有偶联物的抗体不可能与它们结合而不致被损害，这不仅克服了放、化疗在杀伤肿瘤细胞同时杀伤正常细胞的毒副作用，而且放射核素或药物直接到达肿瘤细胞所在部位提高了局部放射强度及药物剂量，因此疗效更好，尤其对于那些用现有设备不能检出的复发或转移的微小肿瘤灶及散在的癌细胞均能有效地识别杀伤，因此能有效地治疗肿瘤的复发转移。
因此，本发明的一个目的即在于提供一种杂交瘤细胞系，其能分泌特异于抗人癌蛋白HER2的单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供由所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体，本发明的HER2抗体在不偶联任何放射核素、化疗药物的情况下也能阻止肿瘤细胞的生长从而达到治疗的目的。
本发明的再一目的在于提供本发明的单克隆抗体的可变区基因，以及由该基因构建的一系列衍生抗体或融合蛋白的基因以表达所述衍生抗体或融合蛋白。
本发明的又一目的在于提供本发明的单克隆抗体及其衍生物在诊断肿瘤、肿瘤复发转移以及判断肿瘤预后中的应用以及在分离、纯化或分析HER2癌蛋白或HER2癌蛋白配体中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞系，其命名为HER2-McAB-YFC10C25(以下称为YFC10C25)，其能分泌抗人癌蛋白HER2的单克隆抗体。所述杂交瘤细胞系于2000年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 0457。
根据本发明的另一方面，提供了一种新的抗人HER2单克隆抗体，其能抑制HER2阳性肿瘤细胞的增殖及转移，增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性。
根据本发明的再一方面，提供了所述单克隆抗体的重链和轻链可变区基因。所述重链可变区基因具有SEQ ID NO1所示的序列，所述轻链可变区基因具有SEQ ID NO2所示的序列。本发明还包括含有所述基因的表达载体及宿主细胞。
根据本发明的又一方面，提供了所述单克隆抗体的一系列衍生物，它们能够特异性地杀伤HER2高表达的肿瘤细胞及抑制其生长、转移，增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性，所述衍生物包括嵌合抗体、全人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、胞内抗体、单链抗体嵌合受体、Fab及Fab表达库产生的肽段等。本发明的抗人HER2单克隆抗体及衍生物可与各种放射核素、生物毒素、化疗药物、酶前体物偶联制成特定的生物制剂。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及本发明的抗人HER2单克隆抗体及其衍生物在体内外诊断肿瘤、肿瘤复发转移以及判断肿瘤预后中的用途，以及在分离、纯化或分析HER2癌蛋白或其配体中的应用。
如上所述HER2蛋白分子只特异地高表达于肿瘤细胞表面，正常细胞极少表达，抗人HER2的抗体也只与表面有HER2蛋白分子高表达的肿瘤细胞结合，同时肿瘤细胞HER2蛋白分子是否阳性表达与肿瘤病人的复发转移、预后密切相关，因此通过检测HER2蛋白分子的存在能辅助诊断肿瘤，预示病人的预后，为临床确定治疗方案提供重要依据，是一个有用的生物标志物。本发明的HER2抗体可用于制备检测病人肿瘤组织、体液中的HER2抗原的制剂。目前能够有效、特异地检测诊断肿瘤和判断预后的生物学标志甚少。鉴于HER2在肿瘤细胞表面特异的高表达，正常组织低表达或不表达，因此抗人HER2的抗体标记放射核素后能用于制备体内放射免疫显像诊断肿瘤的显像剂。这种放射免疫显像剂，不仅能用于诊断肿瘤的部位、大小、以及微小转移病灶，而且其特异性较目前临床应用B超、CT、核磁等诊断方法更高，因为后几种诊断手段只能提示体内某器官或部位，有占位性病变(肿块)，但不能完全确定是癌肿。此外这种HER2放射免疫显像剂还能检出较小的肿瘤(小于1cm)，从而可弥补B超、CT、核磁诊断方法的不足。
在目前用于肿瘤治疗的三种手段之一的化学药物治疗(化疗)，在临床治疗中应用非常广泛，但在临床治疗中发现相当多的肿瘤对化疗产生耐药，有的是原发耐药，有的是在治疗过程中产生的继发耐药，从而导致没有疗效，这类病人常常是无法手术的晚期病人，或放疗后再度复发不能再放疗，对于这样一些病人目前几乎没有任何可用的治疗措施，因此解决肿瘤耐药的问题是降低肿瘤病人死亡率的重要问题。已有的研究表明肿瘤耐药的产生是由于肿瘤细胞内基因的改变，其中HER2基因的扩增和高表达与肿瘤耐药性有关。Wright等发现用三苯氧胺化疗药治疗无效的乳癌有HER2高表达，有疗效的乳癌HER2表达低或者阴性。Gusterson等报道高表达HER2的乳癌对CTX、MTX、5-Fu、顺铂等化疗药的敏感性显著低于HER2低表达的乳癌，类似的资料也见于卵巢癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤。Haucock等用抗HER2的抗体处理卵巢癌细胞，可增加其对顺铂等化疗药的敏感性，提高该药杀伤癌细胞的效力。本发明的抗人HER2的抗体能增加顺铂、氨甲喋呤、泰素及长春新碱等化疗药对乳腺癌细胞的杀伤作用，提高这些药物的疗效，这表明抗HER2抗体与肿瘤细胞的HER2蛋白结合可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此，在目前尚无任何能克服或解决肿瘤耐药的措施和手段的情况下，抗人HER2抗体对那些晚期病人、复发、转移的病人以及对化疗药不敏感的肿瘤病人无疑是一个福音。
根据本发明的一个实施方案，本发明人采用杂交瘤技术制备出抗人HER2单抗。用于免疫动物的抗原和用于筛选产生单抗的阳性杂交瘤克隆的抗原分别采用了不同的制备方法。用于免疫宿主包括但不限于小鼠的抗原来源于HER2高表达的细胞如SKBR3细胞，当然也可使用其它细胞。根据宿主的种类，使用各种佐剂增强免疫反应，这些佐剂包括但不限于完全和不完全弗氏佐剂、无机凝胶、氢氧化铝、表面活性剂、油乳剂、钥孔嘁血兰蛋白、卡介苗等等。免疫途径可以是腹腔注射、皮下注射、脾脏、淋巴结或尾静脉注射等，免疫次数以免疫动物血清中抗体滴度超过1∶320为宜。在筛选融合后产生抗人HER2单抗的杂交瘤克隆时，采用现代分子生物学重组DNA技术表达的HER2蛋白作为抗原，用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选测定。即将克隆获得的HER2基因用目前公开的DNA重组技术克隆到原核、真核、或昆虫表达载体中构建重组表达载体，再用此重组载体转染原核细胞、真核细胞或昆虫细胞表达人的HER2蛋白抗原。采用PAGE胶凝胶电泳、ELISA、Western Blot技术鉴定表达的HER2蛋白的生物活性及各种特性。以此具有生物学活性的人HER2蛋白作为抗原包被96孔酶标板，采用间接ELISA方法筛选产生抗人HER2单抗的阳性克隆细胞株。筛选获得的产生抗人HER2单抗的杂交瘤克隆扩大培养冻存于液氮，并对获得的单抗用高表达HER2的肿瘤细胞和不表达HER2抗原的非肿瘤细胞，采用免疫荧光、细胞ELISA、免疫组化、流式细胞仪和放射免疫等方法分析、鉴定抗体与人HER2结合的特异性、亲和性、敏感性及在人体的组织分布。采用MTT法分析所获HER2抗体对肿瘤细胞生长和增殖的抑制作用。采用肿瘤细胞药物敏感试验测定HER2抗体增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性作用及提高化疗药物杀伤肿瘤细胞的作用。将那些能与人HER2抗原特异结合、亲和力和敏感性高、能抑制肿瘤细胞的增殖、提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用、体内抑制肿瘤生长的HER2单抗的杂交瘤细胞株扩大培养冻存于液氮。
目前国内外研制抗肿瘤抗原或相关抗原的单抗，包括HER2单抗是采用高表达某一抗原的肿瘤细胞免疫动物，并用这一高表达同一抗原的肿瘤细胞筛选产生单抗的杂交瘤克隆，这种技术很难获得只与HER2抗原表达阳性的肿瘤细胞结合的单抗，所获得单抗特异性较差，易与不表达HER2抗原的细胞(如正常人体细胞)发生非特异交叉反应，这样的单抗既不能用于临床诊断疾病，也不能用于治疗疾病，无明显的应用价值。同时这样获得的单抗有时只能用于免疫组化法检测肿瘤抗原的存在，不能用于ELISA、Western Blot法检测肿瘤抗原，在应用上受到极大的限制。也有人采用分子生物技术在原核细胞表达的抗原免疫动物和筛选产生抗体的阳性克隆，这种方法所获的单抗通常只与表达的抗原反应，而不能与肿瘤细胞表面的天然抗原结合，这样的抗体不能用于临床诊断和治疗疾病，只能用于纯化可溶性抗原，针对这些问题，本研究采用了两种不同技术制备免疫动物的抗原和用于筛选产生抗体的阳性克隆的抗原，本研究采用的这种技术操作简便，所获单抗特异性、亲和性、敏感性高，只识别HER2抗原阳性的肿瘤细胞并与之结合，与HER2阴性的非肿瘤细胞不反应，可用于肿瘤的体内外诊断和治疗，并能用于多种检测技术中，如免疫组化、流式细胞、免疫荧光、ELISA、Western Blot等等。同时这样获得的单抗也能与可溶性HER2抗原结合，用于抗原蛋白的纯化。
根据本发明的一个实施方案，本发明的单克隆抗体的可变区基因的获得是通过首先采用Trizol一步法从产YF10C25单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA并用逆转录酶合成cDNA，设计用于扩增YF10C25轻重链可变区基因的PCR引物，即设计并合成了基因5′端的简并引物，基因3′端引物选择了部分小鼠免疫球蛋白(Ig)恒定区基因序列，从而提高PCR扩增目的基因的特异性和有效性从而有利于目的基因的分离克隆。用上面合成的cDNA为模板，采用上面合成的引物进行PCR扩增反应，分别获得了YF10C25单抗轻重链可变区基因。回收PCR扩增获得的单抗可变区基因，经限制性内切酶切后，插入克隆载体的质粒DNA中(如pUC18、pUC19、pGEM等载体，但不限于这些载体)，构建重组克隆载体。将这些重组克隆载体转染宿主菌，如大肠杆菌DH5α(但不限于DH5α)中经酶切法筛选鉴定正确的阳性重组克隆后，从筛选出的轻重链可变区重组克隆中随机挑选2个以上克隆，采用荧光标记Sanger双脱氧末端终止端法，进行单抗可变区基因的核苷酸序列测定，测的结果根据Kabat等总结的小鼠单抗可变区亚群共有序列分析，确定正确重排的有功能性的单抗可变区基因，YF10C25单抗重链和轻链可变区基因的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列分别见SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，所述基因分别称为HER2单抗轻链可变区基因YF10C25VL基因和HER2单抗重链可变区基因YF10C25VH基因。
该HER2单抗可变区基因编码序列采用DNA重组技术可克隆到多种克隆载体包括但不限于pUC18、pUC19、pGEM等中保存，也可转染原核细胞，包括但不限于大肠杆菌中保存，也可克隆到多种表达载体，包括但不限于原核、真核、酵母、昆虫等多种载体中保存，并可转染多种宿主细胞包括但不限于各种大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母菌、昆虫细胞中表达HER2单抗或肽段。
本发明的HER2单抗可变区基因编码序列可用于分离克隆HER2单抗的全长基因。例如，在一个实施方案中，将编码序列YF10C25VL和YF10C25VH用放射核素标记或用地高辛标记后作为筛选HER2单抗的噬菌体cDNA文库和基因组DNA文库的探针筛选分离抗人HER2单抗的全长cDNA和DNA序列，包括抗体的可变区、恒定区、启动子、增强子、内含子及信号肽序列的全长基因。
本发明的HER2单抗可变区基因编码序列还可用于制备HER2单抗基因的突变物、类似物。例如，采用DNA定点突变技术或PCR诱导突变技术和DNA重组技术改变或修饰YF10C25VL和YF10C25VH基因或YF10C25的cDNA、DNA全长的核苷酸序列，但不限于采用不同核苷酸的缺失、添加或取代而产生YF10C25单抗的突变物、类似物或修饰物，它们具有与YF10C25单抗相同或类似的功能活性及特征。
另外，根据本发明的单抗可变区基因可用于提高HER2单抗的活性和多样性。根据YF10C25VL和YF10C25VH基因的编码序列可设计出并连接各种末端的肽段或编码序列，在上述基因上包括但不限于采用定点突变、引入突变序列、插入限制性内切酶位点、改变糖基化模式、磷酸化等修饰序列，以提高单抗的亲和力及多样性，也可在引入异源序列，包括但不限于His、GST等序列以表达出融合蛋白，以便用于筛选肽库，也可引入具有治疗意义的基因编码序列，包括但不限于抑癌基因、反义癌基因序列，通过抗体的特异性将这些治疗的目的基因带到特定的目的病灶，实现定向基因治疗。
本发明的单抗可变区基因还可用于合成HER2单抗的类似物。采用现有技术中已公开的化学合成方法，可全部或部分地合成YF10C25VL和YF10C25VH基因或其它突变物、类似物、修饰物的氨基酸编码序列，并用序列分析证实这些合成肽的序列，表达出相同或类似HER2单抗及其类似物、突变物功能的蛋白和多肽。
本发明还涉及HER2单抗的衍生物，本发明人采用基因工程方法及免疫学、细胞生物学技术、以HER2单抗基因为基础还可以制备一系列HER2单抗的衍生物，它们包括但不限于嵌合抗体，改形抗体、全人源化抗体、小分子抗体、双特异性抗体、胞内抗体及单链抗体嵌合受体等。
1、HER2嵌合抗体采用DNA重组技术将HER2单抗的可变区基因YF10C25VL和YF10C25VH基因或用这两个基因为探针从HER2单抗cDNA或DNA文库筛选分离的可变区基因与抗人抗体IgG1或IgG2、IgG3、IgG4的恒定区基因拼接在一起，构建一种可变区为鼠单抗可变区基因、恒定区为人抗体恒定区基因的鼠/人嵌和抗体基因。再将该嵌合抗体基因采用DNA重组技术克隆到表达载体中构建重组表达载体。表达载体应含有调节嵌合基因表达的调节序列，如启动子、终止基因转录的转录终止信号序列和多聚腺苷酸信号肽序列，增强基因表达的增强子序列，能实现抗体分泌表达的前导肽序列，以及能区别表达嵌合抗体基因的细胞与不表达嵌合抗体基因细胞的选择标志基因序列包括neo基因、gpt基因、dhfr基因、his基因等选择标志基因序列。重组表达载体构建成功后采用DNA转染技术，将重组表达载体导入宿主细胞中，包括但不限于原核的大肠杆菌(如DH5α、JM109、BL21)，哺乳动物细胞(如sp2/0、CHO、YB10、COS)昆虫细胞(sf9、sf21、high5等)，酵母细胞(如Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe)等表达嵌合抗体，采用ELISA、Western Blot、RT-PCR、免疫组化、肿瘤细胞生长抑制、肿瘤细胞药敏测定以及裸鼠移植瘤试验等技术，分析、鉴定表达嵌合抗体的产量、特异性、生物活性等。这样制备的抗人HER2嵌合抗体较鼠源HER2单抗免疫原性低，在人体内应用可降低毒副作用，并能增加该抗体在人体内的半衰期，用于治疗疾病可提高疗效。
2、改形抗体尽管HER2嵌合抗体的恒定区是人源的，但嵌合抗体中仍有35％序列来源于鼠HER2单抗，仍能在人体内引起毒副作用，可将HER2鼠单抗可变区基因中能与HER2结合的超变区序列移植到人抗体可变区基因的骨架区FR中，在用人抗体的恒定区拼接构建HER2改形抗体基因。该改形抗体基因采用如嵌合抗体所述的技术克隆到表达载体中，构建重组表达载体，再转染宿主细胞表达改形抗体，该改形抗体中90％以上的成分均为人源性，大大降低毒副作用，更有利于用于人体内治疗。
3、全人源化抗体研制HER2全人源化抗体，可采用噬菌体抗体库技术、表位印模选择技术及转基因动物技术等。噬菌体抗体库技术是首先从人外周血分离淋巴细胞，提取淋巴细胞中RNA、反转合成cDNA，设计并合成一组RT-PCR引物，采用RT-PCR技术扩增淋巴细胞cDNA中的人抗体可变区基因。将扩增获得的抗体轻重链可变区基因分别克隆到噬菌体表达载体，构建人抗体轻重链噬菌体表达库，用HER2抗原从噬菌体抗体表达库中筛选人源化抗体。筛选获得的人抗体轻重链可变区基因，再采用如嵌合抗体表达所述的技术表达HER2全人源化抗体。表位印模选择技术是在噬菌体抗体库技术的基础上发展起来的方法，首先是建立从淋巴细胞来源的人抗体噬菌体库，用鼠HER2抗体的轻链可变区基因与人抗体的噬菌体抗体库重组构建鼠-人杂合抗体库，用HER2抗原筛选有结合抗原活性的克隆，从而获得人抗体重链基因(VH)。用获得的人VH基因与人抗体的噬菌体抗体库重组构建成人抗体库，再用HER2抗原筛选抗体库，获得人抗体轻链基因(VL)。这样获得人抗体可变区基因，再用人抗体恒定区基因拼接后建成全人源化抗体基因，按嵌合抗体所述的技术可表达全人源化抗体。转基因动物技术是将人完整的抗体基因组替代动物的抗体基因组，再免疫转基因动物而获得完全人源化的抗体，如利用转基因小鼠、转基因鸡等，经免疫而直接获得全人源化的HER2抗体。这样研制的全人源化抗体有更好的特异性，与改形抗体相比没有任何鼠源的序列，是全人源化抗体，完全克服了鼠单抗用于人体可能产的毒副作用。
4、小分子抗体根据抗体分子的结构可知，抗体分子的抗原结合部位局限在可变区的FV段，从而可以研制构建分子量较小的只有与HER2抗原结合功能的分子片段，成为小分子抗体。小分子抗体具有以下特点①分子量小，易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶部位。②不含抗体恒定区Fc，可降低免疫原性，不与Fc受体结合，减少非特异分布。③易于进行基因工程改造。④可在原核细胞如大肠杆菌中表达，降低成本。⑤分子小，排出体外快，适合用于体内显像诊断。小分子抗体包括Fab单链抗体、scFv及Fv等几种。Fab抗体可采用木瓜蛋白酶对完整的HRE2单抗进行酶解，再进行分离纯化即可获得，也可将抗体重链Fd基因与轻链基因5′端接上细菌蛋白的信号肽序列，包括但不限于来自细菌外膜蛋白碱性磷酸酶，果胶酸盐裂解酶的信号肽序列，再在大肠杆菌中表达，可表达Fab、Fv等小分子抗体。单链抗体(scFv)是将HER2抗体的轻重链可变区基因用设计的一段寡聚核苷酸序列连起来，再在宿主细胞中表达为一条单一肽链的抗体，即单链抗体。
5、双特异性抗体根据抗体的分子结构，抗体分子有两个与特异抗原结合的臂，每一臂均有二硫键将抗体轻重链连接固定在一起形成特定的空间结构，一种单抗的两个臂结合相同的抗原分子。将HER2单抗分子的一臂用另一种单抗如抗人T细胞表面抗原CD3的抗体代替，这样构建的抗体分子的一臂能与HER2抗原结合，而另一臂又能与另一种抗原CD3结合，并同时具有两种结合特异性，两种功能。故称这种抗体为双特异性抗体。双特异性抗体可采用杂交瘤技术获得，也可采用DNA重组技术，用一种抗体的轻重链可变区基因取代另一种抗体分子一个臂的轻重链可变区基因，构建双特异抗体基因在转染大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达双特异性抗体，这样的抗体具有更广泛的临床应用范围。
6、胞内抗体胞内抗体是指将抗体基因导入非淋巴细胞的细胞内并定位，滞留在细胞内特定部位，从而特异地干扰定位于该部位的生物大分子的生物活性或其加工、分泌过程，从而干扰细胞的生长及代谢达到治疗的目的，胞内抗体的制备是在单链抗体基因的N端加入细胞定位信号肽序列，以便将单链抗体引导进入细胞内有关部位，如加入定位于核的、定位于内质网的信号肽等使单链抗体定位于细胞核或内质网。同时在单链抗体的C端加入滞留信号肽序列，则可使单链抗体滞留在细胞内的特定部位。构建好胞内抗体基因，再克隆到病毒表达载体，如逆转录病毒载体中，再转染需导入胞内抗体基因的细胞，胞内抗体在细胞内的表达干扰细胞的生物学功能。
7、融合蛋白HER2抗体的融合蛋白是指将HER2抗体的某条肽链后融合上其它效应分子的肽链，从而利用HER2抗体的特异识别HER2抗原的能力，将效应分子带到并密集于靶部位，发挥其特殊的效应功能，通常采用在抗体基因后以合适的编码框直接连接效应分子基因的方法构建而成。通常使用的效应分子包括细胞因子、毒素、催化前药的酶等，抗体形式包括全分子抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、单链抗体等。
单链抗体嵌合受体也是一种融合蛋白，是通过构建单链抗体与T细胞受体(TCR)或肥大细胞Fc受体(Fc(ε)RI)的某亚基的嵌合分子，如单链抗体与TCR/CD3复合体的ζ链、β链；Fc(ε)RI的γ链构建成的嵌合分子，然后转染CTL使嵌合分子在CTL细胞表面表达，从而将抗体的特异性移植给CTL使其能够特异性地杀伤HER2高表达的肿瘤细胞。
根据本发明的又一方面，本发明还涉及HER2单抗及衍生物在制备肿瘤诊断制剂中的应用。
如前所述人类多种上皮来源的肿瘤细胞表面都有HER2抗原的高表达，而正常组织极少表达或表达很低，而且肿瘤HER2的表达高低与肿瘤病人的复发、转移、预后以及对化疗药物是否耐药密切相关，因此可以通过检测肿瘤病人血清、体液、肿瘤组织中HER2抗原的表达情况，为临床诊断多种肿瘤，判断病人预后，为设计化疗方案提供依据。因此HER2单抗及其衍生物可用于制备检测HER2抗原的制剂中及其系列衍生物，在制备检测体液中HER2抗原或肿瘤组织匀浆中的HER2抗原的ELISA制剂中HER2单抗及衍生物可用于作为捕获抗原的第一抗体，在制备检测肿瘤组织中的HER2抗原的免疫组化制剂时，HER2单抗及衍生物可用作识别抗原的第一抗体，同样也可用于流式细胞仪测定及免疫荧光测定中作为识别抗原的第一抗体。此外小分子HER2抗体在制备体内放射显像诊断多种肿瘤及判断肿瘤复发转移的制剂中广泛应用，HER2小分子抗体标记放射核素后，用于体内显像诊断能诊断小于0.5cm的微小病灶，而且较CT、B超、核磁等诊断手段更特异。
本发明还涉及HER2单抗及衍生物在制备肿瘤治疗剂中的应用。HER2在多种肿瘤的特异高表达，在正常组织不表达，使其成为治疗多种肿瘤的重要的靶分子，而且还由于HER2抗原本身的特点，决定了它是肿瘤治疗的最佳的靶分子，其特点是①HER2抗原分子量大，含有1255个氨基酸，并含有合适的抗原表位和MHC识别位点，易被抗体识别，干扰肿瘤细胞生物代谢活性。②HER2在多种肿瘤高表达，正常组织低表达或不表达。③HER2表达在肿瘤细胞膜上，而不是在胞内，抗体能尽快识别和结合。④对一种特定肿瘤HER2抗原表达的密度基本均一，因此用HER2抗体治疗时，抗体能分布于肿瘤的所有区域。⑤肿瘤的原发病灶、转移病灶或复发病灶HER2抗原表达水平一致。因此抗HER2抗体可用于肿瘤原发转移复发病灶的治疗。⑥HER2在肿瘤表面的高表达是向肿瘤传递一种生长优势的信号，因此应用HER2拮抗剂如HER2单抗及衍生物可直接干扰抑制肿瘤细胞的增殖和生长，可以不用标记或偶联杀伤肿瘤细胞的弹头。⑦HER2的表达参与肿瘤对化疗药物形成耐药的机制。因此HER2抗体能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高化疗药物杀伤肿瘤细胞的疗效，因此，HER2单抗及衍生物在制备肿瘤治疗剂中具有广阔的应用范围和应用价值。
HER2单抗及衍生物，尤其是嵌合抗体，改形抗体及全人源化抗体，应用氯氨T法或氯甘脲法可标记放射性核素，制备放射免疫治疗剂，包括但不限于I131、I125、I111、I123等放射核素标记上述抗体，这种HER2放射免疫治疗剂能将放射核素特异地带到HER2高表达的肿瘤，直接杀伤肿瘤细胞达到治疗目的。此外也可将对肿瘤有效的化疗药物与HER2抗体及衍生物偶联制备抗体化疗药物偶联剂用于治疗肿瘤，也可将生物毒素、前体酶以及有治疗意义的基因包括但不限于各种细胞因子基因、抑癌基因、反义癌基因与HER2抗体及衍生物偶联制备相应的治疗剂用于多种肿瘤治疗，为肿瘤的治疗开辟一条新的治疗途径。
鉴于HER2在肿瘤细胞的高表达还参与肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，降低阻断HER2在肿瘤细胞的表达及生物活性，可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高化疗药物杀伤肿瘤细胞作用，因此将HER2抗体及衍生物与各种化疗药联合应用，可大大提高化疗药物的疗效，本研究研制的YF10C25单抗及衍生物已证明能显著提高顺铂、氨甲喋呤、泰素、长春新碱等多种化疗药物杀伤肿瘤细胞的疗效。
HER2抗体及衍生物还能用于从肿瘤细胞基因表达库中筛选分离HER2蛋白或多肽抗原，应用该抗原可以制备出HER2蛋白、多肽、DNA或负载HER2抗原(肽)的树突状细胞等多种肿瘤疫苗，这种疫苗应用于人体可调动机体产生抗肿瘤的免疫反应，即激活机体内杀伤肿瘤细胞的CTL使之更有效杀伤肿瘤细胞达到治疗肿瘤及阻止肿瘤复发、转移的目的。
以下将参照附图和实施例更详细地描述本发明，其中，

图1示出HER2单抗YF10C25对人乳腺癌SKBR3细胞和人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制曲线。
图2示出YF10C25单抗对顺铂(CDDP)杀伤SKBR3细胞的增敏作用。
图3示出YF10C25单抗对裸鼠体内人乳腺癌SKBR3细胞生长的抑制。
图4示出YF10C25单抗对裸鼠体内人卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制。
图5为抗体轻、重链可变区基因克隆载体pRGWL/VL和pRUWH/VH的结构示意图，图中P鼠抗体基因启动子，L前导肽序列，S剪切位点。
实施例1HER2单克隆抗体的制备及生物学特性分析一、杂交瘤的制备以高表达HER2的人乳腺癌细胞系SKBR3细胞免疫BABL/c小鼠，每次用4～5×107个细胞加50％福氏佐剂进行免疫，间隔3周一次。期间构建含有人HER2胞外区基因的重组质粒并转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达后用亲合层析柱纯化。用所得到的HER2胞外区蛋白作为包被抗原，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，采用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体滴度。3个月以后当抗体滴度达1∶2500左右时加强免疫一次，3天后取脾细胞1～1.5×108个与1.25～2×107个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用50％的PEG4000进行融合，以大约2～5×104个细胞的数目接种入96孔板。融合7天后用含HAT的培养液半量换液，以后每2～3天半量换液一次，两周后改用HT培养液半量换液。待出现杂交瘤细胞克隆后计数。当细胞长至1/2孔左右时，用HER2胞外区抗原包被，采用上述间接ELISA方法检测细胞上清中HER2抗体。选阳性孔进行亚克隆，同样方法进行4～5轮亚克隆，选抗体滴度高者扩大培养并冻存，筛选出10株分泌抗HER2胞外区单抗的杂交瘤细胞株，ELISA测定各株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价在1∶2500～12500之间，后经3～6个月传代及反复冻存、复苏后仍稳定地分泌抗体。其中的一株杂交瘤细胞，称为HER2-McAb-YFC10C25，于2000年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0457。二、HER2单克隆抗体的制备、纯化及基本特性1、腹水的制备及抗体的纯化选雌性BABL/c小鼠腹腔注射石蜡油0.5ml/只，致敏3天后，腹腔接种3×106杂交瘤细胞，大约一周后开始产腹水。收集腹水经离心去除油脂和细胞后供纯化之用。属于IgG类的单抗用饱和硫酸铵沉淀，PBS溶解沉淀后用亲合层析法经Protein A Sepharose-4B Fast Flow柱纯化。属于IgM类的单抗用简易正辛酸法纯化。首先用2倍体积0.06M、PH＝4.0的醋酸缓冲液调腹水至PH＝4.8，然后滴加1％的正辛酸室温放置30分钟，经离心后取上清进行PBS透析。再经饱和硫酸铵沉淀、PBS溶解沉淀并透析。纯化后的单抗经SDS-PAGE胶电泳鉴定纯度。
2、HER2抗体的基本特性2.1 HER2单抗的亚类分析取培养上清用IsoDetectTM单抗表位试剂盒(Stratagene公司)对筛选出的10株单抗的类及亚类进行分析测定，结果表明其中4株(YE2C12、YE5C23、YF10C25、YG12C41)属于IgG1、κ型轻链；1株(YF6A26)属于IgG3、κ型轻链；5株(YF11A5、YD8A36、YC9B14、YE4D24、YE2D33)属于IgM、κ型轻链。
2.2抗体的标记用氯胺-T法以125I标记纯化的HER2胞外区单抗。取50μg抗体用0.25M、PH＝7.4的PB稀释至100μl，加入1mci Na125I及25μl浓度为1mg/ml的氯胺-T，室温反应3～5分钟。加入浓度为2mg/ml的偏重亚硫酸钠25μl终止反应3～5分钟。用Sephadex G50柱层析分离纯化标记抗体后立即加入0.5～1倍体积的1％BSA保存于4℃。
2.3单抗的亲和常数测定及识别抗原表位分析以固相竞争放射免疫法进行抗体的亲和常数测定和表位分析。在放免专用管中加入100μl用PH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释为10μg/ml的HER2胞外区抗原，4℃包被24小时。用1％的BSA4℃封闭12小时，经洗涤后分别加入50μl/管稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/ml的未标记抗体，然后加入50μl/106cpm/管同种标记抗体4℃反应24小时，经洗涤后用γ计数仪测cpm值。以仅加标记抗体的对照管cpm值为分母，以各管cpm值为分子，求取不同管结合标记抗体的百分数，以此百分数的对数为纵座标，以未标记抗体浓度(mg/ml)的负对数为横坐标作图。50％(log10＝1.7)结合时的未标记单抗浓度的倒数即为该单抗的亲和常数。表位分析是在包被抗原、封闭、洗涤后分别加入标记抗体量200倍的各种未标记抗体50μl/管，然后加入50μl/106cpm/管某种标记抗体。经洗涤后用γ计数仪测cpm值，求取不同管结合标记抗体的百分数，大于90％被认为表位不同，反之则与该标记单抗识别相同或相近表位。
HER2抗体的基本特征见表1。
表1抗HER2胞外区单抗的基本特性杂交瘤细胞培养 单抗的亚类单抗 上清中的抗体滴单抗的亲合常数 单抗的表位度 重链 轻链YE2C121∶6250 IgG1κ2×108M-1IYE5C231∶6250 IgG1κ 1.63×108M-1IYF10C25 1∶6250 IgG1κ2×108M-1IYG12C41 1∶6250 IgG1κ2.3×108M-1IYF6A261∶6250 IgG3κ 4.57×106M-1IIYF11A51∶12500 IgM κNDIIIYD8A361∶12500 IgM κNDIIIYC9B141∶6250 IgM κNDIIIYE4D241∶6250 IgM κNDIIIYE2D331∶6250 IgM κNDIIIL87 NDIgG1κNDIV注ND未检测三、HER2单克隆抗体生物学特性1、单抗识别抗原特性分析分别以变性和复性形式的HER2胞外区蛋白包被，常规间接ELISA法测定自制单抗与这两种抗原的反应能力。Western Blot是用复性后的HER2胞外区蛋白在PAGE胶中分别进行非还原和还原电泳，采用半干式电转移法进行。ELISA结果显示自制单抗与复性后HER2抗原结合而与变性形式HER2抗原结合能力很弱，这与用YF10C25单抗进行Western Blot结果相吻合，该单抗与还原电泳中HER2胞外区抗原反应能力很弱(免疫染色带很浅)，而与复性后非还原电泳中HER2胞外区抗原反应出现单一免疫染色带。
2、细胞增殖实验按1×104个SKBR3或人卵巢癌细胞系SKOV3细胞/孔加入96孔板中，次日弃培养液加入含抗体(终浓度20μg/ml)培养液维持5天后，吸弃培养液加入含MTT的培养液培养4～6小时，以含10％SDS的0.01M HCl裂解细胞，测OD570/630。依下列公式计算抑制率抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。结果表明单抗YE2C12、YE5C23、YF10C25、YG12C41对SKBR3或SKOV3细胞的增殖有明显的抑制作用，抑制率分别达到SKBR356.3％、52.7％、60.63％、52.7％；SKOV335.1％、32.5％、35.1％、31.6％。其余单抗对SKBR3或SKOV3细胞的增殖抑制不明显，抑制率在9.5％～14％之间。各单抗对HER2阴性的NIH/3T3细胞的增殖无影响。其中不同稀释度的YF10C25单抗对SKBR3和SKOV3细胞增殖的抑制作用见图1。
3、免疫组化将SKBR3或SKOV3细胞培养在盖玻片上，丙酮固定、H2O2-甲醇液处理、封闭后加HER2单抗，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，DAB显色，苏木精复染，经脱水、透明后封片。用自制单抗YF10C25进行SKBR3培养细胞的免疫组化染色可见特异性膜阳性染色，而相同条件下NIH/3T3细胞和人骨髓基质细胞(HFCL)染色均为阴性。用商品抗体L87进行对照实验结果SKBR3细胞膜染色较弱。选用YF10C25单抗以SP法对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌的石蜡切片标本进行染色，其中乳腺癌阳性率为37％。阳性细胞可见特异性细胞膜染色，有些细胞可见胞浆着色。
4、YF10C25单抗对化疗药物的增敏作用本实验选用临床常用的几种化疗药物顺铂(CDDP)、泰素(TAX)、氨甲喋呤(MTX)、长春新碱(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)。将1×104个/孔SKBR3细胞加入96孔板中，24小时后弃培养液加入含一系列按二倍梯度稀释的抗体的培养液和阴性对照培养液，继续孵育24小时后按比例加入一系列二倍梯度稀释的化疗药物(浓度见表2)和阴性对照(PBS)，每个梯度三个复孔。抗体及化疗药物的剂量根据预实验中IC50的结果确定。继续孵育72小时后加入终浓度为0.5mg/ml的MTT再培养4～6小时，以含10％SDS的0.01M HCl裂解细胞，测OD570/630。依公式(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％计算各梯度的抑制率；按公式q＝E(A＋B)/EA＋(1－EA)×EB计算抗体与化疗药联合应用效果，其中E(A＋B)表示两药合用的抑制率，EA、EB分别表示两单药的抑制率，q＞1.15时两药具协同作用，q＝0.85～1.15时两药具相加作用，q＜0.85时两药具拮抗作用。
表2 YF10C25单抗与化疗药联合应用对人乳腺癌SKBR3细胞的杀伤作用药物 YF10C25/药物 药物剂量范围q值相互作用 P值摩尔比 (μM) (Mean±SD)CDDP3.125×10-33.1×10-1～80 1.21±0.04协同作用 ＝0.002(q＞1.15)MTX 5×10-21.95×10-2～5.0 1.01±0.08相加作用 ＝0.001(q＝0.85～1.15)TAX 1.25×10-27.8×102～201.00±0.02相加作用 ＜0.001(q＝0.85～1.15)VCR 8.3×10-21.17×10-2～3.0 1.02±0.07相加作用 ＜0.001(q＝0.85～1.15)5-Fu2.5×10-43.9～1.0×1030.83±0.03拮抗作用 ＜0.001(q＜0.85)P值表示与q＝1.15或q＝0.85比的差异显著性结果表明YF10C25单抗与CDDP具协同作用(如图2所示)。目前顺铂(CDDP)是乳腺癌、卵巢癌等癌症化疗的一线药物，本实验结果提示YF10C25单抗可能成为顺铂治疗HER2高表达肿瘤的增敏剂。YF10C25单抗与TAX、MTX、VCR具相加作用，与5-FU具拮抗作用。
5、YF10C25单抗的体内抑瘤作用选6周龄雌性CD-1裸鼠(nu/nu)，分4组，每组5只。于侧肋处皮下注射2×106个人乳腺癌SKBR3细胞或人卵巢癌SKOV3细胞各2组，注射细胞前所有裸鼠皮下注射雌二醇以启动肿瘤细胞生长。从接种细胞的0～9天，每种细胞组每天静脉注射YF10C25单抗100 μg/只或PBS对照。6天后开始测量肿瘤体积并进行统计分析。结果显示，10天里与对照组相比注射抗体组SKBR3或SKOV3细胞的生长被显著抑制，这种抑制持续到第14天，以后肿瘤才开始生长。说明YF10C25单抗可明显抑制裸鼠体内肿瘤的生长(图3、4)。
6、YF10C25单抗与化疗药物联合的体内抑瘤作用选6周龄雌性CD-1裸鼠(nu/nu)，分18组，每组5只。于侧肋处皮下注射5×106个SKBR3或SKOV3细胞各2组，注射细胞前所有裸鼠皮下注射雌二醇以启动肿瘤细胞生长。从接种细胞的14天肿瘤体积约为50～100mm3时，每种细胞组每天静脉注射YF10C25单抗100μg/只或鼠IgG1对照，同时选用4种化疗药物腹腔注射进行联合组(8组)及单独用药(8组)或单独用抗体组(2组)。化疗药物剂量为环磷酰胺(80mg/kg，0、4、8天)、氨甲喋呤(2mg/kg，1～5天)、5氟尿嘧啶(16mg/kg，1～4天)、泰素(15mg/kg，1～3天)。21天后开始测量肿瘤体积并进行统计分析。结果显示，环磷酰胺、氨甲喋呤与抗体联合组的肿瘤体积显著小于单药组和单独抗体组(P＜0.05)、5-氟尿嘧啶与抗体联合组的肿瘤体积与单药组相比无明显差别、泰素与抗体联合组的肿瘤体积小于单药组和单独抗体组但无显著性差异。实施例2YF10C25单抗可变区基因克隆及序列分析根据HER2单抗生物学特性鉴定结果，选YF10C25单抗进行可变区基因克隆及序列分析为进一步构建人鼠嵌合抗体奠定基础。一、细胞总RNA提取收集1×107个YF10C25杂交瘤细胞，10000rpm离心1分钟，吸弃上清，按TrizolTM试剂(Gibco BRL公司)说明书采用一步法提取细胞总RNA。即加入1ml Trizol充分溶解细胞，室温静置3-5分钟后加入0.2ml氯仿，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心10分钟。转移上清约0.6ml在新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置5-10分钟，4C下12000rpm离心10分钟。弃上清，75％乙醇洗涤一次，空气干燥。加入50μl ddH2O溶解沉淀，取1μl用0.7％非变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，可见18S RNA和28S RNA大小正确，亮度比约1∶2，泳道清晰，说明所提总RNA比较完整。用紫外分光光度法测定总RNA浓度。二、cDNA第一条链的合成按M-MLV反转录酶(Gibco BRL公司)说明书进行。简要的步骤如下在20μl的体系中加入5×缓冲液4μl，10mM DDT，10μg总RNA，终浓度0.5mM的dNTP，终浓度10μg/ml的Oligo d(T)15，40u RNasin，200u M-MLV反转录酶，混匀。37C水浴1小时，沸水浴5分钟灭活反转录酶。三、YF10C25可变区基因的PCR扩增以cDNA第一条链为模板，用Taq PlusI DNA聚合酶(生工公司)进行可变区基因的扩增，选用Winter等设计的引物，序列如下轻链可变区VL55′-GACAT TCAGC TGACC CAGTC TCCA-3′
VL35′-GTTAG ATCTC CAGCT TGGTC CC-3′重链可变区VH55′-AGGTS MARCT GCAGS AGTCW GG-3′(S＝C/G，M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T)VH35′-TGAGG AGACG GTGAC CGTGG TCCCT TGGCCCCAG-3′在100μl的反应体系中含有10×缓冲液10μl，10mM dNTP 2μl，cDNA 20μl，扩增引物各50pmol，混匀后表面覆盖石蜡油。95℃水浴5分钟后，透过石蜡油加入1-2u的Taq PlusI DNA聚合酶，开始以下循环，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，最后一个循环72℃10分钟。扩增产物以1.2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用重链引物VH5、VH3进行PCR，扩增出370bp大小左右的重链可变区基因片段；采用轻链引物VL5、VL3进行PCR，扩增出330bp大小左右的轻链可变区基因片段；未加模板的空白对照无扩增带。扩增出的可变区基因片段大小与一般抗体可变区基因的大小相符，初步说明扩增片段为抗体轻、重链可变区基因片段。四、YF10C25单抗可变区基因的克隆1、感受态细胞的制备和转化将冻存的DH5α菌种接种于100ml LB培养基中，37℃、300rpm震荡培养至OD600约为0.6，将菌液置冰上预冷10分钟，4℃、4000rpm离心10分钟，弃上清。以20ml预冷的0.1M CaCL2/100ml菌液重悬细菌，冰上静置10分钟，4℃、4000rpm离心10分钟，弃上清。以4ml预冷的0.1M CaCL2/100ml菌液重悬细菌放置于冰上，4℃放置12小时后即可用于转化。将待转化的质粒DNA(＜50ng)加入到200μl感受态细菌中，旋转混匀，冰上静置30分钟，42℃水浴90秒后立即置冰上2分钟。加入0.8ml37℃预温的LB培养基，37℃、200rpm震荡培养45分钟后，以200μl感受态细菌/90mm板铺于含抗生素的平板上，37℃倒置培养16小时以上。
2、YF10C25单抗轻、重链可变区基因克隆载体构建将YF10C25单抗的轻、重链可变区基因PCR扩增产物采用NucleoTrap DNA purification试剂盒(Clontech公司)回收。以限制性内切酶(BoehringerMennheim公司产品)PvuII和BglII对质粒pRGWL及轻链扩增产物进行完全酶解，以PstI和BstEII对质粒pRUWH及重链扩增产物进行完全酶解。回收相应片段后，用T4 DNA连接酶(Boehringer Mennheim公司)分别定向连接轻链片段和pRGWL、重链片段和pRUWH，分别命名为pRGWL/VL和pRUWH/VH(见图5)，并转化大肠杆菌DH5α感受态菌。采用含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选转化菌。轻链共得111个转化菌落，随机挑取10个克隆经质粒小量快提后进行PvuII、BglII双酶切及HindIII单酶切鉴定，其中7个克隆为正确重组克隆。重链共得133个转化菌落，随机挑取10个克隆进行PstI、BstEII双酶切及EcoRI、HindIII双酶切鉴定，其中8个克隆为正确重组克隆。
3、核苷酸序列测定采用荧光标记双脱氧末端链终止法，使用载体克隆位点两端的测序引物，按DyeDeoxyTM Terminator DNA测序试剂盒(Perkin Elmer公司)说明书对2个经鉴定的重链可变区基因的重组克隆和2个经鉴定的轻链可变区基因的重组克隆进行核苷酸序列测定。结果2个重链可变区基因(366bp)的重组克隆的序列完全相同，2个轻链可变区基因(327bp)的重组克隆的序列完全相同。测序结果根据Kabat等总结的小鼠单抗可变区亚群共有序列分析，确定克隆的YF10C25单抗轻、重链可变区基因为正确重排的有功能性的单抗可变区基因。轻、重链可变区基因的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列见SEQ IDNO1和SEQ ID NO2。实施例3 HER2人/鼠嵌合抗体的构建及表达一、HER2人/鼠嵌合抗体表达载体的构建以pRGWL/VL和pRUWH/VH为模板，采用PCR技术，扩增带有引导肽和5′-端剪切位点的YF10C25单抗轻、重链可变区基因。产物用NucleoTrap DNApurification试剂盒(Clontech公司)回收，BamHI和NotI酶切后，分别克隆入本室构建的带有人抗体κ链恒定区基因的表达载体pSRNC-Cκ和带有人抗体IgG1恒定区基因的pSRDC-Cγ1中的相应位点，构建成完整的HER2嵌合抗体基因的真核表达载体。
1、pRGWL/VL和pRUWH/VH质粒的提取取已转有质粒的DH5α菌，接种单个菌落于2ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。按1∶100的体积比接种过夜培养物于100ml含100μg/ml Amp的TB培养基(1.3％tryptone，2.7％yeast extract，0.4％glycerol，0.17mol/L KH2PO4，0.72mol/L K2HPO4)中，37℃、200rpm振荡培养22小时使OD600达到1.0以上。冰浴预冷，4℃、10000rpm离心10分钟，弃上清，用40ml的洗涤液(0.15mol/LNaCL，10mmol/L Tris·HCL，1mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，4℃、10000rpm离心10分钟，弃上清。加入4ml溶液I(25mmol/L Tris·HCL，50mmol/L glucose，10mmol/L EDTA，4mg/ml溶菌酶，pH8.0)吹匀，室温放置10分钟。加入8ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)混匀，室温放置10分钟。加入6ml溶液III(3mol/LKAc＋2mol/L HAc)混匀，冰浴10分钟。4℃、10000rpm离心20分钟，转移上清，加入RNase至终浓度为100μg/ml，55℃温育1小时。饱和酚抽提一次，4℃、10000rpm离心10分钟，转移上清，再继续以酚∶氯仿和氯仿各抽提一次。加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2小时，4℃、12000rpm离心30分钟。弃上清，70％乙醇洗涤一次，4℃、12000rpm离心10分钟。弃上清，空气干燥，加入2ml TE溶解沉淀，再加入5mol/L NaCL 0.6ml、30％PEG6000 0.78ml，混匀沉淀30分钟。4℃、12000rpm离心30分钟。弃上清，加入2ml TE溶解沉淀，再加入50μl20％SDS和60μl蛋白酶K(20mg/ml)混匀，37℃温育1小时。饱和酚抽提一次，4℃、10000rpm离心10分钟，转移上清，再继续以酚∶氯仿和氯仿各抽提一次。加入2倍体积无水乙醇、0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)混匀，-20℃沉淀2小时，4℃、12000rpm离心30分钟。弃上清，70％乙醇洗涤一次，4℃、12000rpm离心10分钟。弃上清，空气干燥，加入200μl ddH2O溶解沉淀。
2、PCR扩增带有引导肽和5′-端剪切位点的YF10C25单抗轻、重链可变区基因方法同实施例2中PCR方法，扩增带有引导肽和5’剪接位点的轻、重可变区基因的引物序列如下5′引物PVNP5′-GCTCG GAAGC TTGAA TTCGG ATCCA TGAATATGCA AATCC TCTG-3′3′引物PVLS5′-GGGTC CAAGC TTGCG GCCGC AACTG AGGAAGCAAA GTTTA AATTC TACTC ACGTT TGATCACCA-3′PVHS5′-GGGTC CGAAT TCGCG GCCGC TATAA ATCTCTGGCC ATGAA G-3′所用模板为pRGWL/VL和pRUWH/VH各0.5μg，循环次数改为20次。PCR反应结果扩增出带有引导肽的YF10C25的VL片段，大小约500bp；和带有引导肽的VH片段，大小约710bp。
3、HER2人/鼠嵌合抗体高效表达载体构建回收带有引导肽的VL片段与本室构建的具人抗体κ链恒定区的真核表达载体pSRNC-Cκ同时经BamHI和NotI酶切后，定向克隆入载体。转化DH5α感受态菌并快提质粒后经BamHI和NotI酶切筛选重组克隆，10个克隆中筛选到7个正确的重组克隆，命名为pSRNC-Cκ-YF10C25，此即HER2人/鼠嵌合抗体的轻链表达载体。
回收带有引导肽的VH片段与本室构建的具人抗体IgG1恒定区的真核表达载体pSRDC-Cγ1同时经BamHI和NotI酶切后，定向克隆载体。转化DH5α感受态菌并快提质粒后经BamHI和NotI酶切筛选重组克隆，10个克隆中筛选到6个正确的重组克隆命名为pSRDC-Cγ1-YF10C25，此即HER2人/鼠嵌合抗体的重链表达载体。二、HER2人/鼠嵌合抗体在真核细胞CHO/dhfr-中的高效表达1、HER2人/鼠嵌合抗体轻、重链表达载体共转染CHO-dhfr-细胞CHO-dhfr-细胞在含10％FBS、0.03mmol/l次黄嘌呤(H)、0.003mmol/l胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0.1mmol/l脯氨酸(Pro)、0.1mmol/l甘氨酸(Gly)、100u/ml青链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM＋F12完全培养液中，5％CO2、37℃的条件下培养。
使用LipofectAMINE(GibcoBRL公司)进行转染。接种1×106CHO-dhfr-细胞于25cm2培养瓶中，待细胞长至60～80％满时，取轻、重链表达载体各4μg稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中，取40μl LipofectAMINE试剂，稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中。轻轻混合，室温放置30分钟。在静置期间，以每次5ml的无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞3次，最后加2ml无血清、无抗生素的DMEM培养基于细胞中。将0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于细胞瓶内，边滴边混匀。5％CO2、37℃培养4小时。吸弃上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培养液5％CO2、37℃培养72小时。
2、HER2人/鼠嵌合抗体在CHO/dhfi-细胞中的表达取培养72小时的上清，采用羊抗人Ig多抗包被、HRP标记的羊抗人IgG-Fc为二抗的夹心ELISA测定细胞培养上清中的HER2人/鼠嵌合抗体的瞬时表达，结果上清中瞬时表达的嵌合抗体含量约为1μg/ml。
72小时后将25cm2培养瓶中细胞经消化后接种10块96孔板，培养三天后采用含200μg/ml G418并撤除H、T、Gly的DMEM＋F12选择培养基进行筛选，得到neo+、dhfr+双表型阳性的细胞克隆，10天后可见克隆生长，共得到neo+、dhfr+双表型阳性的细胞克隆420个。三周后，采用夹心ELISA筛选嵌合抗体高表达的克隆，按1.5个细胞/孔的数量进行亚克隆。亚克隆筛选时，96孔板细胞基本长满后，换液继续培养2天，取上清测定其嵌合抗体含量。同前法，用夹心ELISA挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆并扩大培养，按1∶5传代后换含1×10-8mol/L氨甲喋呤(MTX)的DMEM＋F12选择培养基进行培养。待细胞适应了1×10-8mol/L MTX后，继续进行亚克隆，筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。筛选出的嵌合抗体表达最高的克隆，在25cm2培养瓶中扩大培养，待细胞长满后，换液继续培养3天，取上清测定其嵌合抗体含量，并以此次测得的抗体含量值为准，挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。按同样方法相继换含5×10-8mol/LMTX、2.5×10-7mol/LMTX、1.25×10-6mol/LMTX的DMEM＋F12选择培养基进行培养、亚克隆，筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。三、HER2人/鼠嵌合抗体的鉴定1、HER2人/鼠嵌合抗体的人源性及特异性1.1 RT-PCR检测嵌合抗体在mRNA水平上的人源性及特异性取转染并经G418筛选后的neo+、dhfr+双表型阳性的细胞，一步法提取细胞总RNA，反转录为cDNA模板进行RT-PCR检测。结果显示，采用扩增原鼠单抗可变区基因的引物(VL5、VL3及VH5、VH3)，可扩增出特异的327bp的VL和366bp的VH片段；采用人Cκ轻链(HCκ3)或Cγ1重链(HCγ13)3′-端引物和相应的原鼠单抗可变区5′端引物(VL5及VH5)，均可扩增出700bp左右的含有鼠单抗轻、重链可变区和人Cκ或Cγ1恒定区基因的轻、重链链嵌合基因片段。说明所表达的HER2嵌合抗体在mRNA水平上含有人Cκ轻链和人Cγ1重链基因，同时含有YF10C25单抗的可变区基因。因此所表达的抗体应是含有鼠单抗可变区和人抗体恒定区的人/鼠嵌合抗体并且具有与亲本鼠单抗相同的抗原特异性。
HCγ135′-GCATG TACTA GTTTT GTCAC AAGA-3′HCκ3 5′-GCGCC GTCTA GAACT AACAC TCTCC CCTGT TGAAGCTCTT TGTGA CGGGC AAG-3′1.2间接ELISA检测嵌合抗体的人源性以羊抗人Ig多抗包被酶标板，用HRP标记的羊抗人IgG-Fc为二抗，进行间接ELISA试验，以未转染抗体基因的细胞上清及鼠单抗为对照。结果显示，培养上清中含有约1μg/ml的人IgG成分，说明上清中所测得的抗体含有人抗体的恒定区片段，所表达的嵌合抗体的恒定区为人IgG的恒定区。
1.3嵌合抗体的抗原结合特异性1.3.1 Western Blot分析用复性后的HER2胞外区蛋白在PAGE胶中进行非还原电泳，采用半干式电转移法进行转膜，用HRP标记的羊抗人IgG-Fc为二抗。结果显示，HER2嵌合抗体与用HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗的YF10C25单抗相同能和复性后非还原电泳中HER2胞外区抗原反应出现单一免疫染色带，说明HER2嵌合抗体与原鼠单抗具相同的抗原特异性。
1.3.2、细胞ELISA检测嵌合抗体的抗原结合特异性接种转染了人HER2基因的NIH/3T3细胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000个细胞/孔，以NIH/3T3细胞为阴性细胞对照。以高表达HER2嵌合抗体的CHO细胞培养上清为一抗、CHO/dhfr-细胞培养上清为阴性对照。HRP标记的羊抗人IgG为二抗。结果显示，HER2嵌合抗体可特异性的识别NIH/3T3/HER2细胞而与NIH/3T3细胞不反应，说明HER2嵌合抗体可特异性的识别细胞表面的HER2抗原。
2、HER2嵌合抗体在CHO/dhfr-细胞中表达产量的测定用静态耗尽培养法，已生长至100％汇合的细胞按0.2ml培养液/cm2细胞换含10％FBS的新鲜培养液后4天收集上清，夹心ELISA测定上清中嵌合抗体含量，结果表明静态耗尽培养方式的嵌合抗体产量为40～60μg/ml。
至此已成功制备HER2人源化嵌合抗体，并对其所有生物学特性进行了分析。实施例4HER2改形抗体的构建及表达根据HER2单抗生物学特性鉴定结果，选YF10C25单抗可变区基因构建HER2改形抗体。一、HER2改形抗体基因核苷酸序列的确定将实施例2获得的HER2单抗YF10C25轻、重链可变区基因序列与Kabat(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，3.sup.thedition)的人抗体轻、重链亚群的共有序列进行比较，发现HER2单抗YF10C25轻链可变区基因与Kabat的人抗体κ轻链亚群IV共有序列同源性最高，YF10C25重链可变区基因与Kabat的人抗体重链亚群III共有序列同源性最高。以Kabat的人抗体κ轻链亚群IV共有序列和Kabat的人抗体重链亚群III共有序列的框架区(FR)作为改形抗体的FR，将YF10C25轻、重链的互补决定区(CDR)代入FR中，并考虑可能影响抗原与抗体结合的位点应保留原鼠单抗的序列，决定在轻链FR的第3位、第4位、第85位以及重链FR的第1位、第5位、第24位、第30位、第73位、第75位、第94位保留YF10C25的序列。根据由此获得的改形抗体氨基酸序列，推导出该改形抗体核苷酸序列如SEQ ID NO3和4所示。二、HER2改形抗体的构建设计并合成以下引物PL15’-GAC ATC CAG CTG ACC CA-3’PL25’-GCATGAGATGGTGGCCCTCTCCCCCAGAGATACAGCTAAGGAGTCTGGAGACTGGGTCAGCTGGATGTC-3’
PL35’-GCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAA-3’PL45’-TTGTAGGTTGGATGCAAGATAGATGAGGAGTTTGGGTGGCTGTCCTGGTTTCTGTTGGTACCAGTGCAT-3’PL55’-GCATCCAACCTACAATCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC-3’PL65’-GAGGGTGAAGTCTGTATAGGTTGCGACATCCTCTGCTTGGAGACTACTGATGGTGAGGGTGAAGTCTGT-3’PL75’-TACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCCACGTTCGGACAGGGGACCAAGGTGGAGATC-3’PL85’-GATCTCCACCTTGGTCCCCTG-3’PH15’-CAGGTCCAACTGCAGGA-3’PH25’-TGCACAGGAGAGTCTCAGAGAACCCCCAGGCTGTACCAAGCCTCCTCCAGACTCCTGCAGTTGGACCTG-3’PH35’-AGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA-3’PH45’-TGTGTAACCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAACCCAACCACTCAAGTCCCTTTCCTGGAGCCTGGCGGAC-3’PH55’-GCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCC-3’PH65’-GACGGCAGTGTCCTCAGCTCTCAGGGAGTTCATTTGAAGATAGAGGGTATTTTGGGAATTATCTCTGGA-3’PH75’-GAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCAAGCCTCTACTATGGTTACAACTATGCTATGGACTACTGGGGC-3’PH85’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCAT-3’改形抗体轻链可变区基因的Overlap PCR合成以PL1、PL2、PL3、PL4为引物，不加模板，使用TaqplusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增35个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。回收PCR产物。以PL5、PL6、PL7、PL8为引物，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增35个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。回收PCR产物。将上述两种PCR产物等量混合，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增10个循环，再94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增25个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。回收PCR产物。即为改形抗体轻链可变区基因。
改形抗体重链可变区基因的Overlap PCR合成以PH1、PH2、PH3、PH4为引物，不加模板，使用TaqplusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增35个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。回收PCR产物。以PH5、PH6、PH7、PH8为引物，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增35个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。回收PCR产物。将上述两种PCR产物等量混合，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增10个循环，再94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增25个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。回收PCR产物。即为改形抗体重链可变区基因。
将改形抗体的轻、重链可变区基因PCR扩增产物采用NucleoTrap DNApurification试剂盒(Clontech公司)回收。以限制性内切酶(Boehringer Mennheim公司产品)PvuII和BglII对质粒pRGWL及轻链扩增产物进行完全酶解，以PstI和BstEII对质粒pRUWH及重链扩增产物进行完全酶解。回收相应片段后，用T4 DNA连接酶(Boehringer Mennheim公司)分别定向连接轻链片段和pRGWL、重链片段和pRUWH，分别命名为pRGWL/VLR和pRUWH/VHR，并转化大肠杆菌DH5α感受态菌。轻链进行PvuII、BglII双酶切及HindIII单酶切鉴定，筛选正确重组克隆。重链进行PstI、BstEII双酶切及EcoRI、HindIII双酶切鉴定，筛选正确重组克隆。轻重链克隆进行核苷酸序列测定，验证合成的基因的正确性。
PCR扩增带有引导肽和5′-端剪切位点的改形抗体轻、重链可变区基因方法同实施例2中PCR方法，扩增带有引导肽和5’剪接位点的轻、重可变区基因的引物序列如下5′引物PVNP5′-GCTCG GAAGC TTGAA TTCGG ATCCA TGAAT ATGCAAATCC TCTG-3 ′3′引物PVLS5′-GGGTC CAAGC TTGCG GCCGC AACTG AGGAA GCAAAGTTTA AATTC TACTC ACGTT TGATC ACCA-3′PVHS5′-GGGTC CGAAT TCGCG GCCGC TATAA ATCTC TGGCCATGAA G-3′所用模板为pRGWL/VLR和pRUWH/VHR各0.5μg，循环次数改为20次。PCR反应结果扩增出带有引导肽的改形抗体的VL片段，大小约500bp；和带有引导肽的VH片段，大小约710bp。
HER2改形抗体高效表达载体构建回收带有引导肽的VL片段与本室构建的具人抗体κ链恒定区的真核表达载体pSRNC-Cκ同时经BamHI和NotI酶切后，定向克隆入载体。转化DH5α感受态菌并快提质粒后经BamHI和NotI酶切筛选正确的重组克隆，命名为pSRNC-Cκ-RHER2，此即HER2改形抗体的轻链表达载体。
回收带有引导肽的VH片段与本室构建的具人抗体IgG1恒定区的真核表达载体pSRDC-Cγ1同时经BamHI和NotI酶切后，定向克隆载体。转化DH5α感受态菌并快提质粒后经BamHI和NotI酶切筛选正确的重组克隆，命名为pSRDC-Cγ1-RHER2，此即HER2改形抗体的重链表达载体。三、HER2改形抗体在真核细胞CHO/dhfr-中的高效表达使用LipofectAMINE(Gibco BRL公司)进行转染。接种1×106CHO-dhfr-细胞于25cm2培养瓶中，待细胞长至60～80％满时，取上述轻、重链表达载体各4μg稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中，取40μl LipofectAMINE试剂，稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中。轻轻混合，室温放置30分钟。在静置期间，以每次5ml的无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞3次，最后加2ml无血清、无抗生素的DMEM培养基于细胞中。将0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于细胞瓶内，边滴边混匀。5％CO2、37℃培养4小时。吸弃上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培养液5％CO2、37℃培养72小时。
72小时后采用含200μg/ml G418并撤除H、T、Gly的DMEM＋F12选择培养基进行筛选，得到neo+、dhfr+双表型阳性的细胞克隆。四、HER2改形抗体的鉴定间接ELISA检测嵌合抗体的人源性以羊抗人Ig多抗包被酶标板，用HRP标记的羊抗人IgG-Fc为二抗，进行间接ELISA试验，以未转染抗体基因的细胞上清及鼠单抗为对照。结果显示，转染细胞培养上清中含有约1μg/ml的人IgG成分，说明转染细胞上清中所测得的抗体含有人抗体的恒定区片段，所表达的改形抗体的恒定区为人IgG的恒定区。
Western印迹分析用复性后的HER2胞外区蛋白在PAGE胶中进行非还原电泳，采用半干式电转移法进行转膜，以转染细胞培养上清为一抗，用HRP标记的羊抗人IgG-Fc为二抗。结果显示，HER2改形抗体与用HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗的YF10C25单抗相同能和复性后非还原电泳中HER2胞外区抗原反应出现单一免疫染色带，说明HER2改形抗体与原鼠单抗具相同的抗原特异性。
细胞ELISA检测嵌合抗体的抗原结合特异性接种转染了人HER2基因的NIH/3T3细胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000个细胞/孔，以NIH/3T3细胞为阴性细胞对照。以表达HER2改形抗体的CHO细胞培养上清为一抗、CHO-dhfr-细胞培养上清为阴性对照。HRP标记的羊抗人IgG为二抗。结果显示，HER2改形抗体可特异性的识别NIH/3T3/HER2细胞而与NIH/3T3细胞不反应，说明HER2改形抗体可特异性的识别细胞表面的HER2抗原。实施例5HER2单链抗体的构建及表达根据HER2单抗生物学特性鉴定结果，选YF10C25单抗可变区基因构建HER2单链抗体。一、HER2单链抗体基因的构建设计并合成以下引物P35｀＞GACATCCAGCTGACCCAGTC＜3｀P45｀＞CCACCAGAGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCACGTTTGATCACCACCTTGGTC＜3｀P55｀＞GGCAGCGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGAGGTGGCTCTCAGGTCCAAACTGCAGCAGTCTG＜3｀P65｀＞GATGAGATCTAGTGGATGCTGCGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG＜3｀P75｀＞ACTGACAAGCTTAATGGTGATGATGGTGATGAGATCTAGTGGATGCG＜3｀HER2单链抗体可变区基因VL的扩增以P3，P4为引物，实例二中的pRGWL/VL为模板，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分半，扩增25个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。
重链可变区基因VH的扩增以P5，P6为引物，实例二中的pRUWH/VH为模板，扩增条件与VL相同。
重叠PCR将VL，VH的产物稀释10倍，各取2μl混合，加入10×缓冲液，dNTP.ddH2O及Taq plusI酶，条件同上进行7个循环后，加入P3，P6，再按上述条件进行25轮扩增。再以重叠PCR产物为模板，P3，P7为引物，条件同VL扩增25个循环。
原核表达载体pKpL-3a(北京医科大学马大龙惠赠)经StyI酶切后，Klenow补平，再用HindIII酶切，上述的PCR产物经Klenow补平，用HindIII部分酶切，与经酶切的表达载体pKpL-3a连接，构建出HER2单链抗体表达载体pKpL-3a-HER2。二、HER2单链抗体在大肠杆菌中的表达将构建出的HER2单链抗体表达载体采用CaCI2的方法转化大肠杆菌，挑取在氨苄平板上生长的转化单个菌落，碱裂解小量提取DNA，HindIII单酶切鉴定重组克隆，再将经鉴定的重组克隆接种氨苄平板。接种含有重组质粒的单个菌落至50ml LB中，30℃培养至OD600为1.0时，加入50ml 50℃预热的LB，42℃诱导6小时。收集细菌，超声破碎后离心获得包涵体，用SDS-PAGE分析及Western Blot检测。包涵体用洗涤液(2mMol/l EDTA，10mMol/l TrisCl，1％Triton-x-100，PH8.0)洗涤三次后，加入变性液(6Mol/l盐酸胍，100mMol/l TrisCl，2mMol/l EDTA，PH8.0)室温变性4小时以上，离心留上清，用TEA缓冲液稀释，4℃放置16小时复性，再用TEA缓冲液透析去除盐酸胍。获得在大肠杆菌中的表达的HER2单链抗体。三、HER2单链抗体的鉴定接种转染了人HER2基因的NIH/3T3细胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000个细胞/孔，以NIH/3T3细胞为阴性细胞对照。以上述获得的HER2单链抗体为一抗、空菌诱导提取物为阴性对照。HRP标记的鼠抗His6为二抗。结果显示，HER2单链抗体可特异性的识别NIH/3T3/HER2细胞而与NIH/3T3细胞不反应，说明HER2单链抗体可特异性的识别细胞表面的HER2抗原。实施例6HER2胞内抗体的构建及表达以YF10C25单抗可变区基因构建的HER2单链抗体来构建HER2胞内抗体。一、HER2胞内抗体基因的构建设计并合成以下引物P15’-CTGTAGTCTAGAGACATCCAGCTGACC-3’P25’-CTGTAGTCTAGATGAGGAGACGGTGACCGTGG-3’
以P1，P2为引物，实例五中的pKpL-3a-HER2(含HER2单链抗体基因)为模板，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，扩增30个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。
以上PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化后，采用XbaI酶切，并克隆入表达载体pScFvexpress-er(美国Bradbury惠赠)。转化大肠杆菌HB101后筛选重组克隆。二、HER2胞内抗体转染肿瘤细胞SKOV3使用LipofectAMINE(Gibco BRL公司)进行转染。接种1×106SKOV3细胞于25cm2培养瓶中，待细胞长至60～80％满时，取上述表达载体各8μg稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中，取40μl LipofectAMINE试剂，稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中。轻轻混合，室温放置30分钟。在静置期间，以每次5ml的无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞3次，最后加2ml无血清、无抗生素的DMEM培养基于细胞中。将0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于细胞瓶内，边滴边混匀。5％CO2、37℃培养4小时。吸弃上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培养液5％CO2、37℃培养72小时。
采用含200μg/mlG3418的DMEM＋F12选择培养基进行筛选，得到neo+表型阳性的细胞克隆。三、HER2胞内抗体的鉴定接种HER2胞内抗体转染的肿瘤细胞SKOV3于96孔板，10000个细胞/孔，以未转染的肿瘤细胞SKOV3为对照。以YF10C25单抗为一抗，FITC标记的羊抗鼠为二抗进行免疫荧光试验。结果显示，HER2胞内抗体可特异性的识别肿瘤细胞SKOV3内质网中合成的HER2，降低了细胞膜上HER2的数量，HER2胞内抗体转染的肿瘤细胞SKOV3荧光较对照未转染的SKOV3弱。说明HER2胞内抗体可特异性的识别细胞中的HER2抗原。实施例7HER2Fab抗体的构建及表达根据HER2单抗生物学特性鉴定结果，选YF10C25单抗可变区基因构建HER2Fab抗体。一、HER2 Fab抗体的构建及其在大肠杆菌中的表达设计并合成以下引物
P15’-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTCCAACTG-3’P25’-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT-3’P35’-GCTACAAACGCGTACGCTGACATCCAGCTC-3’P45’-TTTGATCTCCACCTTGGTCC-3’使用PCR反应，以实例二中的pRUWH/VH为模板，采用P1、P2扩增YF10C25单抗重链可变区基因，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，扩增30个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。
使用PCR反应，以实例二中的pRGWL/VL为模板，采用P3、P4扩增YF10C25单抗轻链可变区基因，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，扩增30个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。
以上PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化后，重链产物采用MluI＋ApaI酶切，并克隆入中间载体pRH(本室构建，含有MluI及人重链CH1 cDNA序列)；轻链产物采用MluI＋StyI酶切，并克隆入中间载体pRL(本室构建，含有MluI及人轻链CκcDNA序列)。转化大肠杆菌16C9后筛选重组克隆。重链重组克隆采用MluI＋NheI酶切，轻链重组克隆采用SpeI＋SphI酶切，表达载体pRHL(本室构建，含原核启动子及分泌信号肽phoA)采用MluI＋SphI酶切，琼脂糖电泳分离纯化以上3个片段，连接，构建成HER2 Fab抗体分泌型表达载体pRHL-HER2。
将pRHL-HER2采用CaCI2法转化大肠杆菌16C9，挑取单菌落接种5ml含氨苄的2×YT培养基，37度200rpm培养6小时，离心收集菌体，重悬于20ml含氨苄的AP5培养基，30度250rpm培养20小时，离心收集菌体。-20度冻融1次，加入1ml细菌周质腔提取液/20ml培养物，混匀，4度轻摇1小时，12000rpm离心20分钟，取上清，PBS透析过夜，获得HER2 Fab抗体。二、HER2Fab抗体的鉴定接种转染了人HER2基因的NIH/3T3细胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000个细胞/孔，以NIH/3T3细胞为阴性细胞对照。以上述获得的HER2 Fab抗体为一抗、空菌诱导提取物为阴性对照。HRP标记的羊抗人κ链为二抗。结果显示，HER2 Fab抗体可特异性的识别NIH/3T3/HER2细胞而与NIH/3T3细胞不反应，说明HER2 Fab抗体可特异性的识别细胞表面的HER2抗原。实施例8HER2双特异性抗体的构建及表达以由YF10C25单抗可变区基因得到的HER2嵌合抗体以及抗CD3嵌和抗体基因构建HER2双特异性抗体。一、HER2双特异性抗体基因的构建如实施例3所述，获得含HER2嵌合抗体基因的表达载体pSRNC-Cκ-YF10C25和pSRDC-Cγ1-YF10C25。表达载体pBDLH-CD3为本室构建，同时含有CD3嵌和抗体的轻重链基因，标志基因为hyg。二、HER2双特异性抗体在真核细胞中的表达使用LipofectAMINE(Gibco BRL公司)进行转染。接种1×106CHO-dhfr-细胞于25cm2培养瓶中，待细胞长至60～80％满时，取上述三种表达载体各3μg稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中，取40μl LipofectAMINE试剂，稀释于250μl无血清、无抗生素的DMEM培养基中。轻轻混合，室温放置30分钟。在静置期间，以每次5ml的无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞3次，最后加2ml无血清、无抗生素的DMEM培养基于细胞中。将0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于细胞瓶内，边滴边混匀。5％CO2、37℃培养4小时。吸弃上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培养液5％CO2、37℃培养72小时。
培养三天后采用含200μg/ml G418、潮霉素、并且撤除H、T、Gly的DMEM＋F12选择培养基进行筛选，得到neo+、hyg+、dhfr+三表型阳性的细胞克隆。三、HER2双特异性抗体的鉴定消化转染了人HER2基因的NIH/3T3细胞(NIH/3T3/HER2)，与表达CD3的Jurkat细胞等量混合，以NIH/3T3细胞为阴性细胞对照。加入上述三表型阳性的细胞克隆培养上清、CHO/dhfr-细胞培养上清为阴性对照。37度孵育30分钟。结果显示，HER2双特异性抗体可特异性的识别NIH/3T3/HER2细胞而与NIH/3T3细胞不反应，并同时与Jurkat细胞反应，导致在显微镜下观察到两种细胞相互粘连的桥联现象，说明HER2双特异性抗体可同时特异性的识别细胞表面的HER2抗原和CD3抗原。实施例9HER2单链抗体免疫毒素(融合蛋白)的构建及表达以YF10C25单抗可变区基因构建的HER2单链抗体和毒素构建HER2单链抗体免疫毒素。一、HER2单链抗体免疫毒素基因的构建及表达设计并合成以下引物P1GGCGCCGCCATATGGACATCCAGCTGACCCAGTCP2CGCCCAAGCTTTAGTACTTGAGGAGACGGTGACCGA使用PCR反应，以实例五中的HER2单链抗体表达载体pKpL-3a-HER2为模板，采用P1、P2扩增HER2单链抗体基因，使用Taq plusI酶，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，扩增30个循环，补加一轮延伸7分钟的循环。
以上PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化后，产物采用NdeI＋HindIII酶切，并克隆入表达载体pRK78(美国Pastan惠赠，含有NdeI＋HindIII克隆位点和HindIII位点后的假单胞菌毒素-PE40的基因)。转化大肠杆菌BL21后筛选重组克隆。
接种含有重组质粒的单个菌落至50ml LB中，30℃培养至OD600为1.0时，加入50ml50℃预热的LB，42℃诱导6小时。收集细菌，超声破碎后离心获得包涵体，用SDS-PAGE分析及Western Blot检测。包涵体用洗涤液(2mMol/l EDTA，10mMol/l TrisCl，1％Triton-x-100，PH8.0)洗涤三次后，加入变性液(6Mol/l盐酸胍，100mMol/l TrisCl，2mMol/l EDTA，PH8.0)室温变性4小时以上，离心留上清，用TEA buffer稀释，4℃放置16小时复性，再用TEA buffer透析去除盐酸胍。获得在大肠杆菌中的表达的HER2单链抗体免疫毒素。二、HER2单链抗体免疫毒素的鉴定接种HER2高表达的SKBR3于96孔板，1.6×104细胞/孔。24小时后换液，加入含1000ng/ml的HER2单链抗体免疫毒素、PE40或BSA的培养液，继续培养24小时。换液，每孔加入含1μCi的3H-Leu的培养液，继续培养6小时，收获进行β记数，计算杀伤率。结果表明，BSA与未加任何物质的对照相比未见明显差别。而加HER2单链抗体免疫毒素的组记数值仅为正常对照的93％，杀伤作用非常明显。同时单纯加PE40的组记数值为正常对照的54％。这说明表达的HER2单链抗体免疫毒素既识别HER2高表达的肿瘤细胞，其所带的PE40毒素对细胞又具有显著的杀伤作用。实施例10HER2F(ab’)2抗体的构建及表达根据HER2单抗生物学特性鉴定结果，选YF10C25单抗可变区基因构建HER2 F(ab’)2抗体。一、HER2 F(ab’)2抗体的构建及其在昆虫细胞中的表达设计并合成以下引物Vleader5′-GAATCGGGATCCATGGGATGGAGCTGTATCACκdown5′-AGTTGAGAATTCGGATCCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCCγ1down5′-AGTTGAGAATTCTTAGAGGGTGTCCTTGGGTTTTG用Trizol试剂提取实例三中表达抗HER2嵌合抗体的细胞株的总RNA，分别以Cκdown和Cγ1down为引物反转录，再都以VLeader为上游引物，各自进行PCR扩增，将扩增出的轻链基因和Fd基因分别克隆入pGEM-3Zf(+)，用ABI377型自动测序仪双向测序后，再先将轻链基因克隆入载体pAcUW51的polyhedrin启动子下游，然后将Fd基因克隆入pAcUW51的p10启动子下游。用Qiagen Plasmid Midi Kit纯化重组的质粒后，利用Cellfectin将其与BaculoGoldDNA共转染sf9细胞，4天后收获第一代病毒，进行扩增后，继续感染sf9细胞，检测细胞上清中抗HER2F(ab’)2抗体的表达。二、HER2F(ab’)2抗体的鉴定接种转染了人HER2基因的NIH/3T3细胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000个细胞/孔，以NIH/3T3细胞为阴性细胞对照。以上述获得的HER2F(ab’)2抗体细胞上清为一抗、sf9细胞上清为阴性对照。HRP标记的羊抗人κ链为二抗。结果显示，HER2F(ab’)2抗体可特异性的识别NIH/3T3/HER2细胞而与NIH/3T3细胞不反应，说明HER2F(ab’)2抗体可特异性的识别细胞表面的HER2抗原。
序列表VH(SEQ ID NO1)属于小鼠IgG1第III(A)亚群9 18 27 36 45 545’CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTGGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu63 72 81 90 99 108AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AGC TGGArg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser TrpCDR1117 126 135 144 153 162GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA AAC AAAVal Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys171 180 189 198 207 216GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATCAla Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr IleCDR2225 234 243 252 261 270TCC AGA GAT AAT TCC CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCTSer Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr LeuArg Ala279 288 297 306 315 324GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT GCA AGC CTC TAC TAT GGT TAC AAC TAT GCTGlu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr AlaCDR3333 342 351 360ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA3’Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser SerVL(SEQ ID NO2)属于小鼠κ轻链第III亚群9 18 27 36 45 545’GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCC TTA GCT GTA TCT CTG GGG CAG AGGAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg63 72 81 90 99 108GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TATAla Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser TyrCDR1117 126 135 144 153 162ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTTMet His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu171 180 189 198 207 216GCA TCC AAC CTA CAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGGAla Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyCDR2225 234 243 252 261 270ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TATThr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr279 288 297 306 315 324TAC TGT CAG CAC AGT AGG GAG CTT CCC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAGTyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val GluCDR3ATC 3’IleVH(SEQ ID NO3)9 18 27 36 45 545’CAG GTC CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTGGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
63 72 81 90 99 108AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AGC TGGArg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser TrpCDR1117 126 135 144 153162GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA AAC AAAVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys171 180 189 198 207 216GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATCAla Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr IleCDR2225 234 243 252 261 270TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAT ACC CTC TAT CTT CAA ATG AAC TCC CTG AGA GCTSer Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala279 288 297 306 315 324GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCA AGC CTC TAC TAT GGT TAC AAC TAT GCTGlu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr AlaCDR3333 342 351 360ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 3’Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerVL (SEQ ID NO 4) 9 18 27 36 45 545’ GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA GAC TCC TTA GCT GTA TCT CTG GGG GAG AGGAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg63 72 81 90 99 108GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TATAla Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser TyrCDR1117 126 135 144 153 162ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTTMet His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu171 180 189 198 207 216GCA TCC AAC CTA CAA TCT GGG GTC CCT GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGGAla Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyCDR2225 234 243 252 261 270ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC AGT AGT CTC CAA GCA GAG GAT GTC GCA ACC TATThr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr279 288 297 306 315324TAC TGT CAG CAC AGT AGG GAG CTT CCC ACG TTC GGA CAG GGG ACC AAG GTG GAGTyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluCDR3ATC 3’Ile
权利要求
1.一种杂交瘤细胞，其于2000年6月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO 0457。
2.由权利要求1的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，所述抗体为抗人癌蛋白HER2的单克隆抗体。
3.一种抗体重链可变区基因，其为权利要求2所述的单克隆抗体的重链可变区基因，并具有SEQ ID NO1所示的序列。
4.一种抗体轻链可变区基因，其为权利要求2所述的单克隆抗体的轻链可变区基因，并具有SEQ ID NO2所示的序列。
5.由权利要求3和/或4所述的基因构建的人—鼠嵌合抗体、改形人源化抗体、双特异性抗体、胞内抗体、Fab、Fab表达库抗体或融合蛋白的基因。
6.含有权利要求3的抗体的重链可变区基因和/或的权利要求4的抗体的轻链可变区基因的表达载体。
7.含有权利要求5所述的人—鼠嵌合抗体、改形人源化抗体、双特异性抗体、胞内抗体、Fab、Fab表达库抗体或融合蛋白的基因的表达载体。
8.用权利要求6和/或7所述的表达载体转化的宿主细胞。
9.由权利要求8所述宿主细胞产生的抗体、抗体衍生物或融合蛋白。
10.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于体内外诊断肿瘤、肿瘤复发转移以及判断肿瘤预后的试剂中的应用。
11.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于治疗肿瘤、肿瘤复发转移的药物中的应用。
12.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于分离、纯化或分析HER2癌蛋白的制剂中的应用。
13.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于分离、纯化或分析HER2癌蛋白配体的制剂中的应用。
14.权利要求9所述的抗体、抗体衍生物或融合蛋白在制备用于体内外诊断肿瘤、肿瘤复发转移以及判断肿瘤预后的试剂中的应用。
15.权利要求9所述的抗体、抗体衍生物或融合蛋白在制备用于治疗肿瘤、肿瘤复发转移的药物中的应用。
16.权利要求9所述的抗体、抗体衍生物或融合蛋白在制备用于分离、纯化或分析HER2癌蛋白的制剂中的应用。
17.权利要求9所述的抗体、抗体衍生物或融合蛋白在制备用于分离、纯化或分析HER2癌蛋白配体的制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及抗人癌蛋白HER2的单克隆抗体及生产其的杂交瘤细胞。本发明还涉及该单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,含有所述基因的表达载体和宿主细胞及由所述细胞产生的抗体、抗体衍生物或融合蛋白。本发明还涉及所述单克隆抗体、抗体衍生物或融合蛋白在制备诊断肿瘤、肿瘤复发转移以及判断肿瘤预后的试剂中和制备治疗肿瘤、肿瘤复发转移的药物中的应用,以及在分离、纯化或分析HER2癌蛋白或HER2癌蛋白配体中的应用。
文档编号C07K16/30GK1334343SQ0012130
公开日2002年2月6日 申请日期2000年7月14日 优先权日2000年7月14日
发明者杨治华, 冉宇靓, 杨光 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所