抗三唑磷单链抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种抗=挫憐单链抗体及其用途，设及基因工程、抗体工程技术领域 和免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 农药是农业生产中用于防治农作物中病、虫、杂草等不可缺少的物质，对保障和促 进农业稳产增收有极其重要的作用。然而，在获益的同时，长期不合理的使用使人类面临暴 露在农药污染及残留超标的工作、饮食和自然环境中。=挫憐农药是一种广谱有机憐杀虫 剂，主要祀标是昆虫的神经系统，广泛用于防治农作物的害虫危害，已有研究表明即使暴露 在较低的=挫憐环境中，对哺乳动物的正常生理、激素水平、组织均可产生明显影响。国内 外已开始限制或禁止=挫憐农药的使用与销售，英国HSE机构对=挫憐浓度最低检出限要 求已达到0.Olmg/kg。为保护人类的健康和安全，对该农药的残留进行有效监控显得尤为必 要，具有重要意义。
[0003] 现有的=挫憐检测方法有气相色谱法、液相色谱法W及基于第二代抗体的酶联免 疫吸附分析的方法。其中仪器方法需要价格昂贵的仪器和具备专业技能的操作人员；而基 于单克隆抗体的免疫反应，需要长期保存杂交瘤细胞，定期驯化保证分泌性能，若杂交瘤细 胞突变或保存不当，则需要重新制备。然而，第S代抗体之基因工程抗体的产生规避了优异 的杂交瘤细胞因保存不当损失的风险，节省了实验动物饲养时间某种程度上，抗体片段的 获得使得具备良好性能的抗体特性得W永存，并且具备遗传信息可改造，生产形式多样化 的优势，在技术操作上简单方便，易于投入生产。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、制备方便的抗S挫憐 的单链抗体及在检测=挫憐中的应用。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗=挫憐单链抗体，该抗体为SEQID No:1所示的氨基酸序列。
[0006] 作为本发明的抗=挫憐单链抗体的改进：该氨基酸序列由重链可变区、连接肤和 轻链可变区组成，连接肤位于重链可变区和轻链可变区之间。
[0007] 备注说明：所述重链可变区如SEQIDNo:1自N端第1至123位氨基酸残基所示， 所述连接肤如SEQIDNo:1自N端第124至138位氨基酸残基所示，所述轻链可变区见SEQ IDNo:1自N端第139至247位氨基酸残基所示。
[0008] 本发明还同时提供了另一类的抗=挫憐单链抗体，是上述单链抗体经过改造得到 的衍生抗体，改造包括氨基酸缺失、突变或插入形成的具有抗=挫憐生物活性的单链抗体。
[0009] 本发明还同时提供了编码上述抗=挫憐单链抗体的基因，该抗体基因为SEQID No:2所示的核巧酸序列（741个核巧酸）。
[0010] 作为本发明基因的改进，该基因由所述重链可变区、连接肤和所述轻链可变区核 巧酸序列组成。
[0011] 所述重链可变区如SEQIDNo:2自5'末端第1至369位核巧酸所示；
[0012] 所述连接肤如SEQIDNo:2自5'末端第370至414位核巧酸所示；
[0013] 所述轻链可变区如SEQIDNo:2自5'末端第415至741位核巧酸所示。
[0014] 本发明还同时提供了含有上述基因的克隆载体或菌株。
[0015] 本发明还同时提供了含有上述基因的表达载体或宿主；所述表达载体为将所述抗 体基因插入PIT2载体得到的重组质粒；所述宿主为将所述重组质粒转化大肠杆菌得到的 基因工程菌。
[0016] 本发明还同时提供了制备上述抗=挫憐单链抗体的方法：将含有上述基因的表达 载体转化、转导或转染宿主细胞，进行培养后分离蛋白从而获得抗=挫憐单链抗体。
[0017] 本发明还同时提供了上述抗=挫憐单链抗体的用途：用于=挫憐农药的检测。
[0018] 抗体基因的表达载体可为本领域常规的可在宿主内复制和表达的各种载体，具 体可为将所述抗体基因插入PIT2载体得到的重组质粒，更具体可为将所述抗体基因插入 PIT2质粒的化Ol和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。所述宿主可为原核细胞，如细菌 细胞；真核细胞，如昆虫、酵母。哺乳动物细胞等，具体可为将所述重组质粒转化大肠杆菌得 到的基因工程菌，更具体可为将所述重组质粒转化大肠杆菌皿2151菌株得到的基因工程 菌。本发明还包括将含所述单链抗体基因的表达载体转化、转导或转染宿主细胞，进行培养 后分离蛋白从而获得抗=挫憐单链抗体的制备方法，具体可为发酵培养所述基因工程菌， 得到所述单链抗体。本发明保护任一所述单链抗体在=挫憐农药检测中的应用。
[0019] 本发明的单链抗体W杂交瘤细胞株为基因来源，选用亚型特异性的简并引物对抗 体可变区进行正确扩增，获得特性优良的抗体片段。通过原核表达系统表达该抗体片段，低 成本，快速制备了具备生物活性的单链抗体，省去了免疫、饲养动物的繁琐工序，同时也免 去了文库建立和筛选的较高技术要求，减少了非目的抗体的干扰。本发明的=挫憐单链抗 体对=挫憐具有高灵敏度和识别特异性，适用于立挫憐残留样品的快速免疫检测，将在= 挫憐检测中发挥巨大应用潜力。
【附图说明】
[0020] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[002。 图1为WS挫憐杂交瘤细胞的CDNA为模板，PCR扩增抗体重链可变区基因、轻链可 变区基因。通过柔性连接肤基因，将重链可变区基因和轻链可变区基因进行重叠延伸PCR， 获得全长单链抗体基因；
[002引 图中：M:Dk2000DNA分子量Marker,VH:抗体重链可变区基因，VL:抗体轻链可变 区基因，SCFv:抗S挫憐单链抗体全长基因。
[0023] 图2是单链抗体在培养基上清和大肠杆菌周质空间中的可溶表达，免疫印迹法验 证。图中：M:蛋白分子量，Medium:培养基上清中单链抗体；Periplasm:周质空间内单链抗 体。
[0024] 图3是单链抗体对S挫憐的竞争曲线。
【具体实施方式】
[00巧]W下结合实施例便于更好理解本发明，下述实施例是说明性的，并不限定本发明， 不能W下述实施例来限定本发明的保护范围。如无特殊说明，W下实施例中的实验方法均 为常规方法，试验材料均为常规生化试剂商店购买得到。如无特殊说明，实施例中所用的 TES缓冲液为0. 2mol/LP册.OTris-HCl,包含0. 5mmol/L邸TA、0. 5mol/L薦糖，实施例中所 用的纯化缓冲液均为0.02mol/LpH7.4Tris-HCl包含500ml化C1。如无特殊说明，实施例 中所用的CBS缓冲液均为0. 05mol/LpH9.6的碳酸钢缓冲液，实施例中所用的PBS缓冲液 均为0.Olmol/L抑7. 4的憐酸盐缓冲液。鸡血清白蛋白简称0VA，半抗原T皿U如下式： [0026]
[0027]实施例1:单链抗体的扩增
[002引 1.抗体重链、轻链可变区基因扩增
[0029] 本实验筛选所得新鲜单克隆细胞株8C10 (分泌抗S挫憐特异性单克隆抗体），亚 型IgGl/lambda。取均一性、纯度良好的5XIO6个杂交瘤细胞，提取总RNA并纯化得到mRNA， 反转录合成第一条cDNA链。使用亚型特异性的简并引物对，WcDNA为模板进行PCR扩增， 分别获得重链可变区基因（VH)、轻链可变区基因（VL)，分别克隆至Bluntzero载体并转化 大肠杆菌Transl-Tl感受态细胞后测序，序列经数据库Blast比对后，鉴定出功能域完整、 亚型相符和正确表达框的VH和化基因。
[00引]备注说明：
[0032]VH基因（对应重链可变区）如SEQIDNo:2自5'末端第1至369位核巧酸所示；
[0033] 化基因（对应轻链可变区）如沈Q IDNo:2自5'末端第415至741位核巧酸所 /J、-O
[0034] 2.构建单链抗体片段
[0035] 根据上述经测序鉴定的重链和轻链可变区基因设计上下游引物，通过柔性连接肤 化inker)连接，构建VH-Linker-化串联方式的单链抗体（scFv)片段。
[0036] 为构建重组载体，重链上游引入化Ol酶切位点（下划直线）和两个胞喀晚碱基 (C)，轻链下游引入NotI酶切位点（下划波浪线），重链下游和轻链上游引入部分Linker序 列，保证正确的表达框，具体通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法拼接串联，获得的全长SCFv 基因，进一步scFv基因克隆至Bluntzero载体并转化大肠杆菌Transl-Tl感受态细胞后 测序并进行序列分析。SCFv序列如序列表的序列2(SEQIDNo:2)所示，重链可变区的编 码序列见序列2自5'末端第1至369位核巧酸所示，连接肤的编码序列见序列2自5'末 端第370至414位核巧酸所示，轻链可变区的编码序列见序列2自5