玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及玉米赤霉締酬抗独特型纳米抗体 (zearalenoneanti-idiotypicnanobodies)制备及其应用.
【背景技术】
[0002] 玉米赤霉締酬狂earalenone，ZEN)是由镶刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒素， 其化学名为6- (10-径基-6氧基-十一碳締基）0 -雷锁酸内醋161~163°C，不溶于水，溶 于碱性溶液、乙酸、苯、甲醇化及乙醇等。玉米赤霉締酬广泛存在于霉变的玉米、高梁、小麦、 燕麦、大麦等谷类作物W及奶中。产生玉米赤霉締酬最常见菌属是禾谷镶刀菌，此外为=线 镶刀菌、木贼镶刀菌、雪腐镶刀菌、粉红镶刀菌等。ZEN具有类雌激素样作用、生殖发育毒性、 免疫毒性、细胞毒性、肝毒性，对肿瘤产生也有一定影响，因此谷物在田间、收获及在储存过 程中一旦被ZEN污染，不仅会给养殖业带来巨大的经济损失，更重要的是可能对人类和动 物的健康造成严重的危害，因此对食品中ZEN的检测具有重要意义。
[0003] 目前比较常用的检测ZEN方法有：高效液相色谱法，气相色谱法，薄层层析法，高 效液相色谱-质谱联用法，免疫检测法等，但W免疫学检测方法较为方便、实用，适合于大 规模样品的快速检测。免疫学检测方法往往设及到使用毒素小分子标准品来建立标准曲 线。用标准品的劣势首先在于毒素小分子提取工作困难，现在我国大多使用进口产品，而且 某些产品进口受限，运样相对增加了成本，最重要的是毒素分子标准品的使用很容易造成 环境的污染和对操作人员身体的危害。因此，人们开始利用抗独特型抗体和抗原模拟表位 来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。隧菌体展示肤库技术的主要 特点是可有效地筛选出与目标祀体特异结合的隧菌体展示多肤，并且在探索受体与配体之 间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位 等方面应用广泛。
[0004] 本发明通过用隧菌体展示技术，从驼源天然单域重链抗体库中筛选能与祀分子 (抗ZEN单克隆抗体）特异性结合的纳米抗体，W纳米抗体作为ZEN抗原的替代物应用于免 疫学分析检测领域。该方法避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫过程，且具有普 遍适用性，筛选得到的纳米抗体具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可替代价格昂 贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。
【发明内容】
[0005] 本发明W抗ZEN单克隆抗体为祀分子，将祀分子固相包被于酶标板上，投入驼源 天然单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种玉米赤霉締酬抗独特型纳米抗体狂6)，其 具有SEQIDNO. : 1所示的氨基酸序列。
[0006]其氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。
[0007]本发明所提及的纳米抗体包括四个框架区（化ameworkregion,FR)和S个互补 决定区（Complementarit^determiningregion,CDR)。其中，框架区（FR1-FR4)分别选自 沈QIDNO. :2,沈QIDNO. :4,沈QIDNO.:6和沈QIDNO. :8,互补决定区（CDR1-CDR3)分 别选自SEQIDNO. :3,SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :7。框架区结构相对保守，主要起着维 持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。
[0008] 本发明提供一种蛋白质或多肤，包含沈Q ID NO. :2,沈Q ID NO. :4,沈Q ID NO. :6 和SEQ ID NO. :8中的一个或两个及W上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有 90%同源性。
[0009] 本发明提供一种蛋白质或多肤，包含SEQIDNO. : 3,沈QIDNO. : 5和沈QIDNO. : 7 中的一个或两个及W上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源性。
[0010] 本发明还设及编码该纳米抗体氨基酸序列的核巧酸，其序列为SEQIDNO. :9。
[0011] 本发明提及的纳米抗体可通过隧菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量 制备。隧菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的隧菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产 展示有该纳米抗体的隧菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基 因，通过克隆至表达载体，W蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
[0012] 本发明还设及所述纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。免 疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗 体特异性反应的免疫学分析检测类型。
[0013] 本发明所述的纳米抗体在应用时，可W通过隧菌体扩增获得的展示有纳米抗体的 隧菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可W将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后 W蛋白的形式进行免疫学检测分析。该纳米抗体W固相抗原或竞争抗原在非疾病诊断治疗 目的免疫学检测分析中的应用。
[0014] 本发明还设及该纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用，具体 为纳米抗体在制备ZEN的模拟物试剂中的应用。
[0015] 本发明中所叙述的一些术语具有如下含义：
[0016] 同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨 基酸序列之间的同源性百分比可W通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置 处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除W【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘W 【100%】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加（与第一 氨基酸相比）被认为是有差别。另外，同源性百分比也可W利用已知的用于序列比对的计 算机运算程序（如：NCBIBlast)获得。
[0017] 结构域：蛋白质=级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0018]IMGT编号：IMGT数据库（TheInternationalImMunoGeneTicsDat油ase)中的一 种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可W参考文献巧虹enmann，F.，Q. Kaas,etal. (2010). "IMGT/3Dst;ructure-DBandIMGT/DomainGapAli即：adatabase andatoolforimmunoglobulinsorantibodies,Tcellreceptors,MHC,IgSF andMhcSF."NucleicAcidsRes38 化atabaseissue) :D301-307.Lefranc,M.P.,C. Pommie,etal. (2003)."IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcell receptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-Iikedomains."DevCompTmmunol 27(1) :55-77.)中的描述。
[0019]密码子（codon):亦称S联体密码（tripletcode)，指对应于某种氨基酸的核巧 酸=联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肤链的位置。
[0020] 前述纳米抗体可W替换价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相 包被抗原应用于ZEN的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性， 效果良好。
[0021] 本发明的有益效果是：本发明纳米抗体可W替代价格昂贵且毒性强的ZEN标准 品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。该纳米抗体具有与天然ZEN 分子相似的免疫反应特性，可提高ZEN检测灵敏度，减少ZEN标准品对操作人员健康和环境 的危害，节约成本。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质抗 原替代物的筛选和制备，具有很高的应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1为纳米抗体狂6)的氨基酸编号及结构域示意图。
[0023] 图2为W纳米抗体狂6)建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围为 0.2_1.22ng/mL，ICso为 0. 49ng/mL。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1.驼源天然单域重链抗体库的构建
[00巧]1)驼源白细胞的分离：在离屯、管中加入淋己细胞分离液，再缓慢加入等体积血液 样品，1000 g离屯、50min;小屯、吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离屯、管中，加入1/2体积的 PBS，1000 g离屯、15min;弃上清，用PBS洗下离屯、管壁上的白细胞，1000 g离屯、IOmin;弃上 清，加入500yLPBS重悬白细胞并计数；W体积比1 :15加入裂解液（RNAiso)保存备用。
[0026] 2)总RNA提取：向上述裂解液中加入1/4体积的氯仿，剧烈震荡20s使其充分乳 化，室溫静置5min;4°C12000g离屯、15min，取上清转移至另一新鲜离屯、管中；加入等体积 的异丙醇，充分混匀后室溫静置IOmin;4°C1000 Og离屯、20min，弃上清，缓慢加入75%乙醇 1血，小屯、洗涂离屯、管管壁；4°C，12000g离屯、5min后弃去乙醇；室溫干燥沉淀5min，加入适 量的RNase-化ee水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0027] 3)cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTPMixUire和模板RNA混合，65°C5min，迅 速冰浴。具体配制如下：
[0029] 然后在上述Microtube中配置下列反转录反应液：
[0030]
[0032]PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42°C35min，50°C45min，70°ClOmin。PCR产 物于-20°C保存备用。
[0033] 4)抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应。
[0034]第一轮PCR :
[0036]PCR反应条件：96°CImin;98°C6s，55°C20s，72°C65s，35cycles;75°ClOmin。
[0037] 采用试剂盒回收PCR扩增产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板。
[0038]第二轮PCR:
[0039]
[0040]PCR反应条件：94°C5min;98°C8s，52°C15s，72°C50s，6cycles;98°C10s，68°C45s，30cycles;72°C7min。
[00川。文库构建：