可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其 应用。
【背景技术】
[0002] 玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEN)是由镰刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒素， 其化学名为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基）β -雷锁酸内酯，广泛存在于霉变的玉米、 高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶中。禾谷镰刀菌是产生ZEN的主要菌属，此外为三 线镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌等，由于ZEN在谷物粮食中污染普遍，可通 过食物链的作用对家禽及人体健康产生毒害作用，因此对ZEN的监测就显得尤为重要。
[0003] 目前比较常用的检测ZEN的方法主要包括：高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC)，气相色谱法（Gaschromatography，GC)，薄层层析法（Thin layer chromatography，TLC)，高效液相色谱-质谱联用法（High performance liquid chromatography-mass sepectrum，HPLC-MS)，微生物检测法和免疫检测法等，其中免疫学 分析方法以其灵敏度高、操作简单以及可实现规模化筛选等优点，在ZEN的快速检测领域 中得到了广泛的应用。
[0004] 免疫学分析方法的核心在于抗原-抗体间的特异性识别及结合，因此制备特异性 结合抗原的抗体就成为发展免疫学分析方法的前提与核心。抗体的研宄近年来发展迅猛， 已经从传统的多克隆、单克隆抗体，发展至以单链抗体、噬菌体展示抗体、单域重链抗体、抗 独特型抗体等为代表的基因工程抗体领域。相比于传统抗体制备必须经历动物免疫、细胞 融合、阳性克隆筛选等复杂程序，基因工程抗体以其可定向改造、淘选方便等优点已成为目 前研宄的热点。除此以外，近年来包括我国在内的众多学者已经开始着眼于不以免疫球蛋 白为主体组成结构的新型抗体研宄，例如基于SELEX技术的核酸适配体、基于分子印迹聚 合体技术的人工抗体以及基于Lipocalin蛋白家族的抗体类似物等都取得了可喜的进展， 为传统抗体的替代性研宄提供了扎实的理论和方法学基础。纵观抗体的发展动态，可以 看出新型抗体具有分子量小、结构简单、可自我进化、制备快捷的特点及发展趋势。例如， 单克隆抗体、单链抗体、单域重链抗体的分子量逐渐减少，分别为150、30-50、15-20kDa，以 Lipocalin为骨架蛋白的抗体类似物为18-20kDa，而核酸适配体则仅为一小段核酸序列。
[0005] 近年来人们热衷于研宄发展肽模拟物（peptido-mimetics)，目的之一是将具有生 物活性的复杂分子逐步修饰、取代、改造、最终压缩至仅包含功能单位的小分子，称之为肽 模拟物的合理设计。因此，多肽分子可成为潜在的新型抗体分子。随着噬菌体展示多肽库技 术的迅速发展，通过噬菌体展示肽库的淘选，可快速、简单地获得与特定靶体分子特异性结 合的多肽分子。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的 噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活 性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛，但是上述 噬菌体展示多肽技术的应用大多局限于以大分子蛋白质为靶体分子进行亲和淘选。由于蛋 白质表面具有多个拷贝的表位，因此非常容易获得与之对应结合的多肽分子。目前的多肽 分子大多作为抗原的模拟表位（抗原替代物）应用于免疫学分析中，而将多肽分子作为小 分子物质抗体的替代物应用于免疫学分析的报道较少，其原因在于，小分子物质体积过小， 且表面没有丰富的氨基、羧基基团，难以与多肽分子结合，从而造成淘选困难。
[0006] 本发明通过噬菌体展示多肽库技术，采用磁珠液相亲和淘选并结合ZEN抗体竞争 性洗脱的方式，从噬菌体展示多肽库中快速筛选到能与ZEN特异性结合的多肽分子，该多 肽分子具有与传统的 ZEN单克隆抗体分子相似的免疫学检测特性，且线性检测范围宽广， 可作为传统ZEN抗体的替代物应用于ZEN的免疫学分析体系。该方法避免了制备传统的单 克隆抗体分子所需要经过周期长的免疫过程、细胞融合、单克隆筛选等流程，具有无需免疫 过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。
【发明内容】
[0007] 本发明以ZEN全抗原（ZEN与牛血清白蛋白的偶联物ZEN-BSA)为靶分子，将 靶分子结合到磁珠上，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行磁珠液相亲和淘选，结合ZEN 抗体竞争性洗脱的方式，获得了一种可特异性结合ZEN的多肽分子，其氨基酸序列为： MTPTRSRQLLLR。
[0008] 上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其 D-型异构体的一种，即M代表蛋氨酸残基，T代表苏酸残基，P代表脯氨酸残基，R代表精氨 酸残基，S代表丝氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，L代表亮氨酸残基。
[0009] 本发明还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列的核苷酸，其序列为：
[0010] ATG ACT CCT GAC CGT TCT CGT TAG CTT CTT CTT CGT
[0011] 本发明提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进 行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖 生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通 过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基 因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。
[0012] 本发明还涉及所述多肽分子在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括 酶联免疫吸附检测等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明所提及的多肽分子可替代传统的ZEN抗体分子，作 为ZEN的结合分子直接应用于免疫学检测分析，基于多肽分子的间接竞争ELISA标准曲线 其线性范围宽广，该多肽分子具有无需免疫过程、获取方便、快速、周期短等特点。
【附图说明】
[0014] 图1基于多肽分子的ZEN间接竞争ELISA标准曲线（线性检测范围为l-400ng/ mL)。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1.与ZEN特异性结合多肽分子的磁珠液相亲和淘选及其鉴定
[0016] 1)亲和淘选与ZEN特异性结合多肽分子的具体方法为：为高效获得可与ZEN分 子特异性结合的多肽分子，采用了新型的磁珠液相亲和淘选并结合ZEN抗体竞争性洗脱 的方式，具体方法为：取〇. 5mg羧基化的磁珠分子（直径500nm)，用PBST洗涤3次。加 入10 μ L噬菌体随机展示十二多肽库（2 X 10npfu，NEB公司），后加入900 μ L PBST，与磁 珠混合，室温下轻摇震荡反应30min，磁分离后（此步骤的目的在于去除噬菌体展示肽库 中与磁珠表面修饰基团结合的多肽分子，这类多肽分子吸附在磁珠表面并通过磁分离而 去除掉），小心吸取上清液（不与磁珠表面修饰基团结合的多肽分子）至另一新离心管， 加入0. 5mg ZEN-BSA偶联的磁珠（直径500nm，ZEN-BSA的偶联量为1.0 mg，ZEN = BSA的偶 联比为 20:1，偶联物的制备方法参见 Burkin ea al·，2000, Applied biochemistry and microbiology, 36, 282-288))，室温下震荡反应60min。磁分离后，用TBST洗涤6次，洗去未 结合的菌体。加入ImL 100ng/mL ZEN抗体（PBS体系），室温下轻摇震荡30min。磁分离 后，小心吸取上清，获得第一轮亲和淘选产物，留10 μ L测滴度，将剩余噬菌体投入处于对 数前期的ER2738进行扩增，然后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相 同，每次加入的噬菌体量均为2Χ 10npfu，不同之处在于：第2、3轮筛选的噬菌体展示多肽 与ZEN-BSA偶联磁珠的孵育时间分别为45min、30min，