竞争洗脱液（ΖΕΝ抗体）的浓度分别 为 50ng/mL，25ng/mL〇
[0017] 2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑 取80个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体 克隆的鉴定，具体方法为：首先，用IOmM PBS(pH 7.4)稀释ZEN-BSA抗原，2yg/mL包被 96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.05%Tween-20(v/v))洗涤3次 后，用含有3 %脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育1小时；投入100 μ 1噬菌体斑扩增液 (1.0 X IO12Pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37°C孵育1小时；加入I :5000倍稀释的 HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μ 1，37°C孵育1小时；加入100 μ I TMB底物液，避光显色 5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取OD45tl大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克 隆。
[0018] 3)特异性结合ZEN多肽分子的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行与ZEN特异 性结合噬菌体展示多肽的鉴定，具体方法为：用IOmM PBS (pH 7.4)稀释ZEN-BSA，2 μ g/mL 包被酶标板 100 μ L，4°C孵育过夜；第二天用 PBST (IOmM PBS, 0. 05 % Tween-20 (v/v))洗涤 3次后，用含有3 %脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育1小时；投入50 μ 1经间接ELISA鉴 定为阳性的噬菌体克隆（1.0 X IO11Pfu)和50 μ I ZEN标准品（浓度范围为0-1000ng/mL)， 37°C孵育1小时；加入I :5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μ 1，37°C孵育1小时； 加入100 μ I TMB底物液，避光显色5min，读取OD45tl。若噬菌体展示的的多肽分子可特异性 结合ZEN，则加入了 ZEN标准品的孔的OD值要低于对照孔（未加入ZEN标准品）。
[0019] 实施例2.与ZEN特异性结合的多肽分子编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
[0020] 将经过间接竞争ELISA鉴定展示有特异性结合ZEN多肽分子的噬菌体进行扩增， 提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800 μ 1 含噬菌体上清转入一新离心管。加入200 μ I PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于 100 μ 1 碘化物缓冲液（IOmM Tris-HCl (pH 8. 0)，ImM EDTA, 4M NaI)，加入 250 μ 1 无水乙醇 沉淀DNA，离心后再用70 %乙醇洗涤沉淀（DNA测序模板）。沉淀最终重悬于20 μ 1灭菌水， 取2 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5 μ L噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII测序引物 为：5' -mCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。依据DNA测序结果及密码子表可获得多肽分 子的氨基酸序列：MTPTRSRQLLLR。
[0021] 实施例3.特异性结合ZEN多肽分子在ELISA中的应用
[0022] (1)样品提取
[0023] 称取5g待测样品，加入25ml 60%的甲醇-PBS溶液，200rpm振荡5分钟；将提取 液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取Iml滤液加入4ml PBS (磷酸盐缓冲液，pH = 7. 2)混 匀后，即为样品提取液，待用。
[0024] (2)包被及封闭
[0025] 用IOmM PBS(pH 7. 4)稀释的ZEN-BSA(2 μ g/ml)，包被酶标板，4°C孵育过夜。第二 天用PBST (IOmM PBS，0.05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行 封闭，37°C孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
[0026] (3)标准曲线的建立
[0027] 取出经步骤（2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 1展示有特异性结合ZEN多肽 分子的噬菌体（1. 0X IO12PfU)和一系列不同浓度的50 μ I ZEN标准品（0-1000ng/ml)，37°C 孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育1小时。然后用TMB 底物显色，读取OD45tl。以ZEN浓度对数为横坐标，结合率（加入ZEN的孔的OD45tl/未加入 ZEN的孔的OD45ciXlOO^ )为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
[0028] (4)样品的检测
[0029] 取出经步骤（2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 1展示有特异性结合ZEN多肽 分子的噬菌体（1.0 X IO12PfU)和待测样品提取液，37°C孵育1小时。加入1:5000稀释HRP 标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD45tl，计算结合率， 并根据标准曲线，倒推出样品中ZEN的含量。
[0030] 实施例4与ZEN特异性结合多肽分子的的大量制备
[0031] 1)以噬菌体扩增的方式
[0032] 将与ZEN特异性结合的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738的培养物中，37度 220rpm振荡培养4. 5h。将培养物转入另一离心管中，4°C 1000 Orpm离心10min，将上清的上 部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C下静置120min。4°C 1000 Orpm离心 PEG/NaCL静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入ImL TBS进行重悬， 即为噬菌体扩增液。
[0033] 2)以多肽-融合蛋白的方式进行制备
[0034] A. PCR扩增多肽分子的外源编码基因
[0035] PCR 反应体系：（50 μ L)
[0036]
【主权项】
1. 可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子，其特征在于其氨基酸序列为： MTPTRSRQLLLR。
2. 编码权利要求1所述多肽分子氨基酸序列的核苷酸。
3. 如权利要求2所述的核苷酸序列对应为： ATG ACT CCT GAC CGT TCT CGT TAG CTT CTT CTT CGT〇
4. 如权利要求1所述多肽分子制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基 因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示多肽分子的噬菌体，通 过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有可特异性结合ZEN多肽分子的噬菌体粒子；所述 化学合成指依据多肽分子的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成；所述基 因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合 蛋白的形式进行大量制备。
5. 权利要求1所述多肽分子在免疫学检测分析中的应用。
6. 如权利要求4所述应用，其特征在于多肽分子替代玉米赤霉烯酮抗体在免疫学检测 分析中的应用。
【专利摘要】可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其应用。本发明属于生物技术领域，涉及可特异性结合玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)的多肽分子及其应用，该多肽分子的氨基酸序列为MTPTRSRQLLLR。本发明采用磁珠液相亲和淘选并结合ZEN抗体竞争性洗脱的方式，快速淘选获得可特异性结合ZEN的多肽分子，所述的多肽分子可以替代传统的ZEN抗体并应用于ZEN的免疫学分析体系中，其线性检测范围宽广，该多肽分子的获得无需免疫过程、制备简单、成本低、周期短，该多肽分子既可通过生物培养的方式大量扩增，也可以通过化学合成或者基因工程的方法进行大量制备，为ZEN抗体的制备提供了新的路径，具有较好的应用价值。
【IPC分类】G01N33-68, C07K7-08, C12N15-11
【公开号】CN104804070
【申请号】CN201510172848
【发明人】何庆华, 许杨
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月13日