一种多肽及其应用和将多肽共价连接到固相界面的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物分子固定领域，具体而言是一种多肽及其应用和将多肽共价连接 到固相界面的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人类基因组计划的完成，蛋白质将逐渐成为生命科学领域研究的重点。鉴于 蛋白质与其他生物分子，如蛋白、糖、脂等的相互作用，大多都是通过多肽介导的。因此，多 肽在这些相互作用中起着举足轻重的作用。另外，固定化技术特有的优势，使得多肽固定在 亲和纯化、生物传感、生物芯片、新材料等领域有着广泛的应用。
[0003] 随着技术的发展，针对多肽共价连接到固相界面，越来越多的方法被开发出来。但 是这些方法或是需要修饰，引入非氨基酸的组分；或是受限于多肽序列的组成，尤其是序列 中含有赖氨酸和半胱氨酸的情况下。此外，多肽的固定密度低也是这些方法不容忽视的缺 陷。最后，这些方法大都费时、费力、低效，极大地阻碍了多肽在相关领域的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种多肽及其应用和将多肽共价连接到固相界面的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] -种多肽，多肽序列为SEQ ID No. 1中氨基酸所示。
[0007] -种多肽的应用，所述多肽作为靶标识别元件用于定性/定量的监测纤维素酶内 切葡聚糖酶I (EG I)。
[0008] -种将多肽共价连接到固相界面的方法，将SEQ ID No. 1中所示的多肽装载于对 称的载体表面，再共价连接到固相界面。
[0009] 具体地说，将SEQ ID No. 1中所示的多肽装载于对称的载体表面，再将其转移至含 有氨基反应活性基团的固相界面表面，经共价反应后，实现多肽的固定。
[0010] 利用上述固定的多肽定性/定量地监测纤维素酶内切葡聚糖酶I (EG I)。
[0011] 对称的载体为具有对称结构的生物体或合成材料。具有对称结构的生物体如Ff 噬菌体、烟草花叶病毒等；具有对称结构的合成材料如纳米微球、壳、微珠、棒、线等。
[0012] 将多肽装载在上述对称的载体中；装载的方式可以通过标准的遗传操作，借助生 物体中具有对称结构的组份，将其整合到生物体表面，如Ff噬菌体的主要衣壳蛋白pVIII， 实现其高密度、对称装载；也可直接在纳米微球、壳、微珠、棒、线等具有对称结构的载体表 面直接合成。
[0013] 蛋白质与其他生物分子，如蛋白、糖、脂等的相互作用，通常由多肽序列介导。鉴于 多肽载体本身具有对称性的特点，多肽序列能够在这些载体上对称、高密度地分布，并维持 自由的氨基基团。因此，使用常见的氨基反应活性基团（如环氧基、醛基、琥珀酰胺基）活化 的固相界面进行多肽固定时，载体表面的绝大多数多肽由于远离这些活性基团，不参与反 应，从而最大程度地保留了多肽的功能。
[0014] 本发明所具有的优点：本发明方法简便，并且固定多肽的有效密度高。此外，该固 定方法还不受多肽序列组成的影响，具有普适性。同时将多肽探针共价连接到固相界面，这 为检测纤维素酶含量、优化多酶组份的比例、开发高效酶制剂等奠定基础。最后，该多肽固 定策略将为其他生物分子的固定、材料界面的功能化、生物传感和生物芯片等领域提供借 鉴，带来新思路。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明是实例提供的多肽AEGSDPRMV高密度、对称展示于具有对称结构的 生物体表面图。
[0016] 图2为本发明是实例提供的多肽AEGSDPRMV借助对称载体固定及应用的流程图
[0017] 图3为本发明与传统多肽固定策略的对比A :芯片点制模式；B :芯片扫描图；C :图 B中两种多肽固定策略的荧光信号强度。
【具体实施方式】
[0018] 为便于实施本发明，本发明的目的、优点将结合实施例，参照附图进一步说明。
[0019] 实施例1 :
[0020] 多肽为SEQ ID No. 1中氨基酸所示。
[0021] 序列表 SEQ ID No. 1 为：
[0022] AEGSDPRMV
[0023] (a)序列特征：
[0024] ?长度：9
[0025] ?类型：氨基酸序列
[0026] 籲链型：单链
[0027] #拓扑结构：线性
[0028] (b)分子类型：蛋白质
[0029] (C)假设：否
[0030] (d)反义：否
[0031] (e)最初来源：人工设计
[0032] 实施例2
[0033] 使用多肽固相合成技术，在Wang树脂（具有微球结构）表面合成SEQ ID No. 1， 最后除去保护基团。但是，维持多肽与树脂间的共价连接，即得到了多肽SEQ ID No. 1对称 性装载的树脂。鉴于Wang树脂表面活性基团的密度以及多肽固相合成效率，多肽序列SEQ ID No. 1能够在Wang树脂表面高密度、对称共价连接。
[0034] 实施例3
[0035] 多肽序列SEQ ID No. 1通过现有技术中标准的遗传重组操作，采用Ff噬菌体作为 轴对称性载体，借助噬菌体VIII型展示体系，将序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列，对称 地装载于噬菌体表面，即得到多肽SEQ ID No. 1对称性装载的生物体(如图1所示)。鉴于 Ff噬菌体本身的结构与VIII型展示体系的特点，每一份主要衣壳蛋白pVIII上都将共价连 接一份多肽序列SEQ ID No. 1，从而实现了多肽序列SEQ ID No. 1的高密度、对称装载。
[0036] 实施例4
[0037] 将获得的多肽SEQ ID No. 1对称性装载的生物体（2. 2X 1012TU/mL)与相同体积的 点样液(含〇. 005%吐温20的300mM磷酸盐缓冲液，pH8. 5)混匀后，使用芯片点样仪（中国 博奥公司）点制于Slide H(德国Schott公司）基片上，然后转移至37°C、75%的湿度条件 下进行反应，实现多肽的固定(如图2中的步骤固定)。
[0038] 实施例5
[0039] 1.封闭。将实施例4中，最终得到的功能化的Slide H基片置于含有50mM乙醇胺 的硼酸缓冲液（50mM，pH9. 2)中。37°C维持2小时，封闭Slide H中剩余的氨基反应活性基 团（如图2中的步骤乙醇胺封闭）。
[0040] 2.孵育。封闭处理后，在室温条件下，使用PBST缓冲液清洗3次，每次5分钟。然 后使用去尚子水再清洗5分钟。尚心甩干后，将突光染料Cy3标记的EG I置于固相表面， 与固定的多肽相互作用。37°C维持2小时(如图2中的步骤孵育)。
[0041] 3.信号判读。室温下，使用PBST缓冲液清洗3次，每次5分钟。然后使用去离子 水再清洗5分钟。离心甩干后，使用荧光扫描仪获得荧光信号强度(如图2中的步骤信号判 读)。能够明显的看到EG I与多肽SEQ ID No. 1对称性装载生物体的结合，其也可从图3B 的右半部看出来。
[0042] 比较例
[0043] 将实施例1中SEQ ID No. 1所示的氨基酸按照传统方法进行固定。首先，考虑到 多肽SEQ ID No. 1固定之后的柔性变化以及其与EG I相互作用时的空间取向，在多肽SEQ ID No. 1的C末端加载GGGK序列，即最后合成的多肽序列为AEGSDPRMVGGGK，其中GGG提供 多肽共价固定的连接子，提高所固定多肽的自由度。K提供额外的氨基基团，使得多肽能够 共价连接至Slide H上。
[0044] 作为对照，将上述合成的多肽和实施例3中的生物体，按照实施例4中的流程点制 于同一芯片上，进行多肽的固定。随后，按照实施例5中的步骤，进行信号判读。最终结果 如图3所示，其中图3A为芯片的点制模式，1为基于传统方法固定的多肽，2为借助实施例 3中所得生物体而固定的多肽；图3B为最后的芯片扫描结果；图3C为图3B的量化结果。 采用基于本发明所制备的多肽芯片，其荧光信号强度约是传统方法制备的多肽芯片的500 倍，即本发明所固定的多肽，其效率明显优于传统方法。
【主权项】
1. 一种多肽，其特征在于：多肽序列为SEQIDNo. 1中氨基酸所示。
2. -种权利要求1所述的多肽的应用，其特征在于：所述多肽作为靶标识别元件用于 定性/定量的监测纤维素酶内切葡聚糖酶I(EGI)。
3. -种权利要求1所述的将多肽共价连接到固相界面的方法，其特征在于：将SEQID No. 1中氨基酸所示的多肽装载于对称的载体表面，而后再共价连接到固相界面。
4. 按权利要求3所述的将多肽共价连接到固相界面的方法，其特征在于：将SEQID No. 1中氨基酸所示的多肽装载于对称的载体表面，而后再将其转移至含有氨基反应活性基 团的固相界面表面，经共价反应后，实现多肽的固定。
5. 按权利要求4所述的将多肽共价连接到固相界面的方法，其特征在于：利用上述固 定的多肽定性/定量地监测纤维素酶内切葡聚糖酶I(EGI)。
【专利摘要】本发明属于生物分子固定领域，具体而言是一种多肽及其应用和将多肽共价连接到固相界面的方法。多肽序列为SEQ ID No.1中氨基酸所示。所述多肽作为靶标识别元件用于定性/定量的监测纤维素酶内切葡聚糖酶I（EG I）。本发明通过对称载体实现多肽的固定，使得固定的多肽具有定向均一、密度高等特点。
【IPC分类】C07K7-06, C12Q1-34, C07K17-02
【公开号】CN104804068
【申请号】CN201410038545
【发明人】刘爱骅, 祁环
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月26日