本发明涉及癌症的治疗。具体而言，本发明涉及新双功能抗体(bi-specificantibodies，BsAb)及其抑制癌症生长或转移；并追踪癌症发生的用途。
背景技术：
：：聚乙二醇(poly(ethyleneglycol)，PEG)共价连接(聚乙二醇化或PEG化，PEGylation)至物质，诸如蛋白质、胜肽及纳米粒子(nanoparticles，NPs)(例如，脂质体(liposomes)，微胞(micelles)等)可增加药物生物利用度，增强血液循环半衰期(half-life)和阻碍由网状内皮系统(reticuloendothelialsystem，RES)的捕获。这些有利的特性，致使PEG化广泛使用于NPs的发展，包含临床上使用，例如脂质体阿霉素(liposomaldoxorubicin，Lipo-Dox)(Caelyx)用于对卵巢癌(ovarian)、乳腺癌(breastcarcinomas)、卡波济氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)的治疗和紫杉醇添加的PEG-聚乳酸(polylacticacid，PLA)微胞(Paclitaxel-loadedPEG-PLAmicelles)在韩国核准用于转移性乳腺癌，非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer)和卵巢癌。聚乙二醇化纳米粒子(PEGylatednanoparticles，PEG-NPs)被高度视为第二代药物递送系统和治疗剂或显像剂的主流。由于肿瘤中内皮细胞的异常结构引起的增加渗透和滞留(enhancedpermeabilityandretention，EPR)可在肿瘤中堆积PEG化物质，特别是PEG-NPs。然而，PEG-NPs常累积于肿瘤附近但不穿透进入肿瘤块，且一些药物不能轻易由PEG-NPs扩散至癌细胞。因此，一些研究报告指出，抗体与PEG-NPs的的化学共轭作用(chemicalconjugation)增加专一性靶向和细胞内吞，从而提高治疗效果和成像的灵敏度。然而，抗体(antibody，Ab)以化学式连接PEG-NPs难以达成。大多数的官能基(例如，胺基、羧基、硫醇基团)大量存在于配体中，其可能导致抗体功能丧失，或导致该抗体的异质取向(heterogeneousorientation)，从而使其难以在化学共轭作用后得到可再现产物。此外，化学共轭作用也可能改变纳米载体和被包封药物的结构。这些问题限制了靶向的NPs的临床应用性。鉴于上述情况，在现有的相关技术中，需要一种靶向PEG化物质(例如，PEG-NPs)的改进的方法，其可再现并且易于使用。技术实现要素：本发明提供了人类化双功能抗体及其用于治疗癌症或用于追踪癌症发生的用途。因此，本发明的第一个目的是提供一种双功能抗体(bi-specificantibody，BsAb)，其结合到两个不同的抗原决定位(epitope)，其是一个PEG分子(例如，聚乙二醇的末端甲氧基(methoxy)或羟基(hydroxyl)，或PEG的主链)和目标配体(例如，表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)、TAG72、CD19或CD20)。本发明的BsAb包括一第一抗原结合位，其结合至PEG且包括一第一轻链可变结构域及一第一重链可变结构域；一第二抗原结合位，其结合至一目标配体(例如，一肿瘤抗原)。较佳地，本发明的该BsAb进一步包括一胜肽接头，位于该第一抗原结合位和该第二抗原结合位之间。视情况，该第一抗原结合位可进一步包括一第一铰链结构域(firsthingedomain)。该目标配体可以为一蛋白质，其选自由表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)、人类表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor2HER2)、HER3、肿瘤相关糖蛋白72(tumor-associatedglycoprotein72，TAG-72)、CD19和CD20所组成的群组。在一些实施例中，该BsAb的第一抗原结合位结合至PEG的主链且包含一至少90％与SEQIDNO:1相同的第一VL-Ck结构域、一至少90％与SEQIDNO：2相同的一VH-CH1结构域及一至少90％与SEQIDNO:3相同的第一铰链结构域(hingedomain)；而BsAb的第二抗原结合位结合于TAG-72、EGFR或HER2的任一且包括一至少90％与SEQIDNO:5、7或8相同的单链可变片段(singlechainvariablefragment，scFv)；及一至少90％与SEQIDNO:4相同的该胜肽接头。在一些实施例中，该第一抗原结合位结合至PEG主链且包含至少90％与SEQIDNO：9相同的该第一VL-Ck结构域，及至少90％与SEQIDNO：10相同的该第一VH-CH1结构域；而该第二抗原结合位结合于EGFR或CD19且包含一至少90％与SEQIDNO：7或11相同的scFv；和至少90％与SEQIDNO：4相同的该胜肽接头。在其它实施例中，该第一抗原结合位结合至PEG的主链且包含至少90％与SEQIDNO：9相同的一第一VL-Ck结构域、至少90％与SEQIDNO：10相同的一第一VH-CH1结构域和至少90％与SEQIDNO：22相同的第一HR-CH2-CH3结构域；而该第二抗原结合位结合于CD19或HER2和包括至少90％与SEQIDNO：23或26相同的一第二VL-CH1结构域、至少90％与SEQIDNO：24或27相同的一第二VH-Ck结构域及至少90％与SEQIDNO：25相同的一第二HR-CH2-CH3结构域。在另一个实施例中，该第一抗原结合位结合至该PEG的末端甲氧基或羟基基团，并且包括至少90％与SEQIDNO：12相同的一第一VL-Ck结构域、至少90％与SEQIDNO：13相同的一第一VH-CH1结构域和至少90％与SEQIDNO：22相同的一第一HR-CH2-CH3结构域；而该第二抗原结合位结合于CD19或HER2和包括至少90％与SEQIDNO：23或26相同的一第二VL-CH1结构域，至少90％与SEQIDNO：24或27相同的一第二VH-Ck结构域，和至少90％与SEQIDNO：25相同的一第二HR-CH2-CH3结构域。在另一个实施例中，该第一抗原结合位结合于聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)的末端甲氧基或羟基基团，并且包括至少90％与SEQIDNO：12相同的一第一VL-Ck结构域，一第一VH-CH1结构域至少90％与SEQIDNO：13相同的一第一VH-CH1结构域和至少90％与SEQIDNO：22相同的一第一HR-CH2-CH3结构域；而该第二抗原结合位结合HER2或EGFR，并且包括至少90％与SEQIDNO：15或16相同的一人类化单链可变片段(singlechainvariablefragment，scFv)。在进一步的实施例中，该第一抗原结合位结合于聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)的该末端甲氧基或羟基基团，并且包括至少90％与SEQIDNO：17相同的一人类化单链可变片段(singlechainvariablefragment，scFv)；而该第二抗原结合位结合于CD19或CD20和包含至少90％与SEQIDNO：21相同的一第一VL-Ck结构域、至少90％与SEQIDNO：20相同的一第一VH-CH1结构域。本发明的第二个目的是提供一种药物套组用于治疗或追踪癌症发展，包括转移性及/或抗药性癌症。该药物套组包括至少两种成份，其分别是上述双功能抗体；及聚乙二醇化物质，其是一治疗剂或一显像剂。该治疗剂可以是一蛋白质、一胜肽或包含一化疗药物于其中的一纳米粒子的任一者。该显像剂可以是量子点(quantumdot，QD)、微泡造影剂、一荧光染料、一铁纳米颗粒、一螯合放射性同位素或一金纳米颗粒。实际中，该双功能抗体及该药物套组的聚乙二醇化的物质首先混合以形成一组件；且该组件接着给予该个体用于治疗癌症或用于追踪癌症。本发明的第三个目的是提供一种治疗一患有一癌症生长的个体的方法。该方法包括以下步骤，给予上述的该双功能抗体及一含有治疗剂的聚乙二醇化物质，同时或依次地给予该个体一足以抑制该个体的癌症的生长及转移的剂量。较佳地，该方法包括以下步骤，混合上述的该双功能抗体及含有治疗剂的聚乙二醇化的物质以形成一组件(assembly)，并将该组件在足以抑制个体癌细胞的生长或转移的剂量给予该个体。给予该个体的剂量为约0.1至50毫克/公斤体重(mg/Kgbodyweight)。在某些实施例中，该剂量为约1至40毫克/公斤该个体的体重，较佳地，约为5至10毫克/公斤该个体的体重。该剂量可以一单一剂量或可替代地以一个以上的小剂量施予。癌症，较佳为那些显示出EGFR、HER2、TAG72、CD19或CD20的表达量增加者，经由本发明的方法治疗。在较佳实施例中，本发明的该方法对于治疗一患有乳腺癌、头颈癌、结肠直肠癌或卵巢癌的个体有效。本发明的第四个目的是提供一种在活的个体中组织成像的方法。该方法包括以下步骤，给予上述的双功能抗体及含有治疗剂的一聚乙二醇化物质，同时或依次地给予个体，其量足以在个体的组织成像。较佳地，该方法包括以下步骤：(a)混合本发明的一第一足够量的任一的人类化双功能抗体的及一第二足够量的聚乙二醇化的物质(例如，一纳米粒子其中包含成像剂如一量子点(quantumdot；PEG-QD)或一荧光染料)，以形成一个组件；(b)注入步骤(a)的该组件至该个体；及(c)通过荧光成像(fluorescenceimaging)、电子自旋共振(electronspinresonance，ESR)成像，γ相机成像，X射线成像，计算机断层扫描(computedtomography，CT)或磁共振成像(magneticresonanceimaging，MRI)进行该个体的组织成像。此外，本发明亦提供了一种显影剂(developingagent)含有一上述第一足够量的人类化双功能抗体及一第二足够量的一PEG化成像剂的混合，其中，该混合物形成一组件且该组件制备为注射一个体并成像该个体的该组织通过荧光成像、电子自旋共振(electronspinresonance，ESR)成像，X射线成像，计算机断层扫描(computedtomography，CT)或磁共振成像(magneticresonanceimaging，MRI)。根据一些实施例中，该PEG-QD包含一选自CdHgTe、硒化镉(CdSe)、硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)、硫化镉(CdS)、碲化镉(CdTe)、碲化镉/硫化镉(CdTe/CdS)、硒化铅(PbSe)和硫化铅(PbS)组成的群组中的量子点纳米晶体(quantumdotnanocrystal)。本发明的一个或多个实施例的细节阐述于下面所附的描述。本发明的其它特征和优点从该
发明内容及权利要求显而易见。附图说明本专利或申请文件包含至少一彩色附图。本专利或专利申请公开的含有彩色附图的副本将通过向官方申请并支付必要的费用而取得。参照下面的说明所附的权要求和附图，本发明的这些及其他特征、样态及优点将变得更好理解，其中：图1是具有所示的结构域的IgG抗体的示意图；图2A是根据本发明的一实施例的一二聚体BsAb结构的示意图；图2B是根据本发明的一实施例的一单体BsAb结构的示意图；图2C是根据本发明的另一个实施例的一单体BsAb结构的示意图；图2D是根据本发明的一实施例的一“孔中球(knobinhole)”BsAb结构的示意图；图2E是根据本发明的一实施例，显示修饰后“孔中球(knobinhole)”BsAb结构具有交叉重链及轻链的一个示意图；图3说明根据本发明的一实施例，使用该人类化抗mPEGBsAbs(抗mPEGBsAbs)的一步骤靶向(one-steptargeting)及治疗癌症的一个示意图；图4是根据本发明的一个实例，显示由融合瘤15-2b分泌的抗mPEG抗体与固定的PEG分子的结合；图5A是根据一本发明实施例，实例1.2为人类化抗PEG(hE11)BsAbs(抗PEG(hE11)BsAbs)DNA构建的一示意图；图5B是实例1.2的该人类化抗PEG(hE11)BsAbs的结构的示意图；图5C说明根据本发明的一实施例，实例1.2的该人类化抗PEG(hE11)BsAbs的SDS-PAGE分析于还原或非还原条件下；图5D说明根据本发明的一实施例，实例1.2的该人类化抗PEG(hE11)BsAbs的蛋白质印迹法(westernblot)分析；图6说明根据本发明的一实施例，实例1.2的PEG(hE11)BsAbs对(A)黏蛋白(mucin)、(B)BSA-PEG5,000或(C)BSA；图7说明根据本发明的一实施例，实例1.2的该人类化抗PEG(hE11)BsAbs的癌细胞的选择性；图8A说明根据本发明的一实施例，实例1.4的该二聚体人类化抗PEG(hE11)BsAbs(dimerichumanized抗PEG(hE11)BsAbs)于Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)细胞的癌细胞选择性；图8B说明根据本发明的一实施例，实例1.4的二聚体人类化抗PEG(hE11)BsAbs与该PEG化脂质体得克萨斯红(PEGylatedliposomalTexasRed)于Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)细胞中的结合活性；图8C说明根据本发明的一实施例，实例1.4的PEG(hE11)BsAbs与该PEG化的量子点(QuantumDot)(Qdot655)于Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)细胞中；图9为根据本发明的一实施例，实例2.1的为人类化单价抗PEG(hE11)BsAbs(humanizedmonovalent抗PEG(hE11)BsAbs)DNA构建及单价BsAb的结构示意图；图10说明根据本发明的一实施例，实例2.1的该人类化单价抗PEG(hE11)BsAbs的癌细胞于Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)细胞中的选择性；图11说明根据本发明的一实施例，实例2.1的人类化单价抗PEG(hE11)BsAbs与该PEG化脂质体得克萨斯红(PEGylatedliposomalTexasRed)，于Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)细胞中的结合活性；图12说明根据本发明的一实施例，实例2.1的人类化单价抗PEG(hE11)BsAbs与该PEG化的量子点(QuantumDot；Qdot655)于Jurkat(TAG-72+)、MDA-MB-468(EGFR+)或BT-474(HER2+)细胞中的结合活性；图13A是根据本发明的一实施例，实例2.2为人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbsDNA构建及该BsAb的该结构的示意图；图13B说明根据本发明的一实施例，实例2.2的该人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbs于还原或非还原条件下的该SDS-PAGE分析；图14A及图14B分别说明根据本发明的一实施例，实例2.2的该人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbs对(A)NH2-PEG10,000-NH2及(B)BSA的抗原结合活性；图14C说明根据本发明一实施例，实例2.2的人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbs与PEG化量子点(Qdot655)或聚乙二醇化脂质体得克萨斯红于Raji(CD19+)或A431(EGFR+)细胞中的结合活性；图14D和14E分别说明根据本发明的一实施例，实例2.2的该人类化单价抗PEG(h6.3)及抗CD19BsAbs对CH3-PEG5,000-Alexa647的结合动力学；图15说明根据本发明的一实施例，实例2.2的该人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbs与该PEG化的量子点(Qdot655)于A431(EGFR+)细胞中的胞吞活性的实时影像；图16A至16C分别说明根据本发明的一实施例，通过实例2.2的该人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbs于(A)A431细胞(EGFR+)、(B)MDA-MB-468细胞(EGFR+)及(C)Raji细胞(CD19+)细胞中Lipo/Dox的增加体外细胞毒性的折线图；图17根据本发明的一实施例说明，实例2.2的该人类化单价抗PEG(h6.3)BsAbs标定PEG-NIR797针对CD19+和EGFR+肿瘤的肿瘤成像增强；图18A是根据本发明的一实施例，用于人类化抗mPEGBsAbs的DNA构建的一示意图；图18B说明根据本发明的一实施例，实例2.3的该人类化BsAbs在还原或非还原条件下的SDS-PAGE分析；图18C和18D说明根据本发明的一实施例，实例2.3的该人类化BsAbs与该所示PEG-NPs于SW480细胞(EGFR+)(图2C)及SK-BR-3细胞(HER2+)(图2D)分别的结合活性；图19A说明根据本发明的一实施例，以实例2.3的该人类化BsAbs对于SW480细胞(EGFR+)及SW620细胞(EGFR-)(图2C)处理的PEG-NPs的癌细胞选择性；图19B说明根据本发明的一实例，以实例2.3的该PEG×EGFR或PEG×HER2对于SK-BR-3细胞(HER2+)及MDA-MB-468细胞(HER2-)处理的PEG-NPs的该癌细胞选择性；图20说明根据本发明的一实施例，通过实例2.3的PEG×EGFR于(A)SW480细胞(EGFR+)、(B)SW620细胞(EGFR-)、(C)SK-BR-3细胞(HER2+)及(D)MDA-MB-468细胞(HER2-)中Lipo/DOX的增加体外细胞毒性；图21是根据本发明的一实施例，实例2.3的PEG×EGFR靶向Lipo/IR780的活体成像；及图22A和22B说明根据本发明的一实施例，EGFR+及EGFR-肿瘤以PEG×EGFR靶向Lipo/Dox处理的各别大小尺寸；及图22C是一折线图，说明在图22A和22B中该试验动物的体重变化；图23A是根据本发明的一实施例，为人类化抗mPEG(h15-2b)抗CD19BsAb及mPEG(h15-2b)抗CD02BsAb的DNA构建的示意图；图23B说明根据本发明的一实施例，实例2.4的该BsAbs于Raji细胞中的癌细胞选择性；图23C说明根据本发明的一实施例，实例2.4的该BsAbs的该mPEG结合活性；图23D说明根据本发明的一实施例，实例2.4的该BsAbs的该双结合活性；图24A是根据本发明的一实施例，为实例3.1的人类化孔中球(knobinhole)抗PEG(h15-2b)BsAbs的DNA构建及该BsAbs的该结构的示意图；图24B是根据本发明的一实施例，为实例3.1的人类化孔中球(knobinhole)抗PEG(h6.3)BsAbs的DNA构建及BsAbs的该结构的示意图；图23C说明根据本发明的一实施例，实例3.1的该人类化孔中球(knobinhole)抗PEG(h15-2b或h6.3)BsAbs于非还原条件下的SDS-PAGE分析；图25说明根据本发明的一实施例，实例3.1的该人类化孔中球抗PEG(h15-2b)BsAbs于Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)细胞的癌细胞的选择性；图26说明根据本发明的一实施例，实例3.1的该人类化孔中球抗PEG(h15-2b)BsAbs与该PEG化的量子点(Qdot655)于Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)细胞的双结合活性；图27说明根据本发明的一实施例，实例3.1的该人类化孔中球抗PEG(h6.3)BsAbs于Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)细胞的该癌细胞的选择性；图28说明根据本发明的一实施例，实例3.1的该人类化孔中球抗PEG(h15-2b或h6.3)BsAbs与该PEG化的量子点(Qdot655)于Ramous(CD19+)、Raji(CD19+)及SKBR3(HER2+)细胞的该双结合活性；图29是根据本发明的一实施例，为实例4.1的BsAbs的DNA构建的一示意图；图30说明根据本发明的一实施例，通过实例4.1的BsAbs于(A)SKBR3细胞(HER2+)及(B)A431细胞(EGFR+)中的Lipo/DOX的增加体外细胞毒性；及图31说明根据本发明的一实施例，通过实例4.1的BsAbs于(A)SKBR3细胞(HER2+)及(B)A431细胞(EGFR+)中的Lipo/DOX的协同抗癌效果；及图32说明根据本发明的一实施例，通过实例4.1的BsAbs于(A)SKBR3细胞(HER2+)中的Lipo/DOX的协同抗癌效果。具体实施方式下文提供的详细描述与附图连结旨在作为对本实例的描述并非代表其中本实例可被构造或利用的唯一形式。本说明书阐述该实例的功能及用于建构和操作本实例的步骤的顺序。然而，相同或等价的功能与顺序可由不同的实例来实现。I.定义术语「抗体」是用于最广义并明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多专一性抗体(例如，双功能抗体(bi-specificantibodies))以及具有足够长度以表现所需生物活性的抗体片段，即，与抗原专一性结合，当其在蛋白质及/或其它分子的复杂混合物中优先辨识其目标抗原。如本文所用的术语“单克隆抗体”指一抗体自一本质上同源均质的抗体群获得的抗体，并且不须通过任何特定方法产生所需抗体产品。相反的多克隆抗体通常包括针对不同抗原决定位(epitope)的不同抗体，每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定位置(即抗原决定位)。本发明的该单克隆抗体可以通过融合瘤细胞方法(hybridomamethod)或通过重组DNA方法来制备。该单克隆抗体于本文中特别包括“嵌合”或“重组”抗体，其中重链及/或轻链的一部分相同于或同源对应于自一特定物种或属一抗体种类或亚种的抗体的序列，然而，该链的其余部分则相同或同源到相应的序列中自另一物种的抗体或属于另一抗体类别或亚类，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。非人(例如，鼠类)抗体的“人类化(humanized)”形式是嵌合抗体(chimericantibodies)，其含有衍生自非人免疫球蛋白(non-humanimmunoglobulin)的最少序列。人类化抗体是人类免疫求蛋白其高度变异区残基(hypervariableregionresidues)被非人物种，例如，小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类其具有期望的专一性或亲和性的高度变异区残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(frameworkregion，FR)残基被相应的非人残基所取代。在一般情况下，该人类化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常两个可变域，其中所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白的序列。该人类化抗体可视情况包含一免疫球蛋白恒定区(constantregion，Fc)的至少一个部分，通常是一人类免疫球蛋白。一"分离的"抗体(isolatedantibody)是一已经被鉴定并分离及/或其自然环境组分中回收。其自然环境的容纳性(containmentcomponentsofitsnatureenvironment)是成份(materials)其会干扰本发明的抗体的治疗用途，并且可以包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。分离的抗体包括重组细胞内的抗体原位(insitu)。通常，分离的抗体通过至少一个纯化步骤来制备。术语“双功能抗体(bi-specificantibody，BsAb)”是指一抗体具有至少两种不同抗原专一性。例如，BsAb可能具有一臂(arm)其具有一个特异性抗原位点(antigenicsite)，如肿瘤相关抗原，而另一臂识别不同的标的(target)，例如，一半抗原(hapten)其与一致死剂(lethalagent)结合(例如，IFN-α或一含有抗癌剂如长春花生物碱(vincaalkaloid)的脂质体(liposome))，或一成像剂(例如，含有造影剂或者量子点或荧光染料的微泡)。在较佳实施例中，本发明的BsAb具有两个抗原结合位，其中一个是针对肿瘤抗原(例如，TAG72，CD19，EGFR或HER2)，而另一个是针对一个亲水性聚合物(例如，聚乙二醇(polyethyleneoxide，PEG))，即是结合到含于其中的癌症治疗剂的纳米粒子(例如，Lipo/DOX)。如本文所用的术语“价(valent)”是指在一抗体分子中结合位点存在的指定数目。因此，术语“一价(monovalent)”、“二价(divalent)”、“三价(trivalent)”和”四价(tetravalent)”是指在抗体分子分别具有1、2、3和4个结合位点的存在。本发明的BsAb是至少“二价”，并且可以是多价的，例如四价。术语“接头(linker)”和“胜肽接头(peptidelinker)”在本发明所公开中可互换地使用并且是指一种胜肽具有天然或合成的氨基酸残基用于连接两个多肽(polypeptides)。例如，该胜肽接头可以用于连接VH和VL结构，以形成单链可变片段(例如，scFv)；或将该scFv连接于全长抗体，以形成本发明的一个BsAb。较佳地，该连接是一具有至少5个氨基酸残基长度胜肽，例如5至100个氨基酸残基的长度，更佳地，10至30个氨基酸残基的长度。该连接于scFv是一至少5个氨基酸残基长度的胜肽，较佳地为15至20个氨基酸残基的长度的胜肽。在一个实施例中，所述连接包含(GnS)m的的序列，其中G＝甘氨酸(glycine)，S＝丝氨酸(serine)，n为1到4之间的数字，和m为1，2或3。较佳地，该接头包含一(G4S)3的序列；或(G3S)及(G3S2)的一序列。如本发明所用的术语“聚乙二醇化物质(或PEG化物质，PEGylatedsubstance)”是指一涂覆有聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)的物质，其包括但不限于，一蛋白质(例如，趋化介素(chemokine))、一胜肽(例如，柳菩林(leuprolide))和一纳米粒子(nanoparticle，NP)含于其中的一种治疗剂或一种显影剂。在本领域技术已知用于产生纳米粒子的材料包括中孔洞氧化硅(mesoporoussilica)，以及具有一疏水部分及一亲水部分的材料其可形成一微胞结构(micellestructure)能够包括一种治疗剂(例如，抗癌剂)或一种成像剂(例如，荧光染料(fluorescencedye)、量子点(quantumdot)、螯合的放射性同位素(chelatedradioisotope)，顺磁性铁(paramagneticiron)，金纳米粒子(goldnanoparticle)或造影剂(contrastagent))在其结构中。本发明用于形成纳米粒子的合适材料包括，但不限于，中孔洞氧化硅；磷脂质(phospholipids)如卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰丝胺酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)、磷脂酸(phosphatidicacidPA)、磷脂酸肌醇(phosphatidylinositol，PI)、鞘磷脂(sphingomyelin，SPM)和类似物，单独或组合；生物可降解聚合物如聚乳酸(polylacticacid，PLA)、聚乙醇酸(polyglycolicacid，PGA)、聚乳酸甘醇酸(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)，聚己内酯(polycaprolactone，PCL)，聚二恶烷酮(polydioxanone，PDO)，聚酐(polyanhydrides)，聚原酸酯(polyorthoesters)，甲壳素(chitosan)等，单独使用或以组合使用。较佳地，所述PEG化物质，例如聚乙二醇化的纳米粒子，进一步含有一种癌症治疗剂或一种显影剂于微胞结构中。在本发明中，术语“癌症(cancer)”和“肿瘤(tumor)”可替换使用，并且较佳地，是指一在哺乳动物的生理环境，特别是在人类，特征为不受控制的细胞生长。在此方面的癌症包括转移癌(metastasescancers)及/或抗药性癌症(drug-resistantcancers)。癌症，较佳地表现出增加TAG72，EGFR，HER2，CD19，和CD20的表达量。因此，借由本发明可治疗的癌症或肿瘤为乳腺癌、肺癌、结肠癌、结肠、脾、肾、肝、膀胱、头和颈、卵巢、前列腺、脑、胰、皮肤、骨、血液、胸腺、子宫、睾丸癌、宫颈癌和神经元。更具体地，所述癌症选自乳腺癌，结肠直肠癌，头颈部癌，结肠癌，肝癌，非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)，淋巴瘤，胰腺癌，肺癌，胃癌，前列腺癌，脑肿瘤，视网膜母细胞瘤，卵巢癌，子宫颈癌，造血是统恶性肿瘤，食管癌，肾细胞癌，鳞状细胞癌，神经胶质瘤，和白血病所组成的群组中。如本发明所用的术语“治疗剂(therapeuticagent)”是指一种药剂用于治疗、对抗、改善、预防或改进疾病或状况，如患者体内的癌症。因此，用于治疗癌症的治疗剂较佳地是指细胞抑制剂(cytotoxicagent)，其周知可增进癌症治疗的治疗效果；相应地，细胞抑制剂使用于本发明包括，但不限于此，放射，化学疗剂，抗体及类似物。如本文所用的术语“抗药性癌症(drug-resistantcancer)”是指癌症的生长没有被运用已知细胞抑制剂，其可为一种化学疗剂、一种抗体、一种胜肽或一种其组合所抑制或阻滞。在一些实施例中，该药物是化疗剂。化学疗剂的实例包括烷化剂(alkylatingagent)，例如亚硝基尿素(nitrosoureas)、顺铂(cisplatin)或达卡巴仁(dacarbazine)；抗代谢物(antimetabolites)如叶酸(folicacid)，嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)拮抗剂(antagonists)；有丝分裂抑制剂(mitoticinhibitor)如长春花生物碱(vincaalkaloid)；细胞毒性抗生素(cytotoxicantibiotics)和喜树碱衍生物(camptothecinderivatives)。较佳的化疗剂包括阿德力霉素(adriamycin)、阿米福汀(amifostine)、博来霉素(bleomycin)、硫酸布他卡因(busulfan)、顺铂(cisplatin)及/或其它铂化合物，较佳地包括，卡铂定(carboplatin)及/或奥沙利铂(oxaliplatin)、喜树碱(camptothecin)、CPT-11、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、环磷酰胺((cyclophosphamide)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、达卡巴仁(dacarbazine)、放线菌素(dactinomycin)、依妥普赛(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，氟尿苷(floxuridine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基尿素(hydroxyurea)、依弗酰胺(ifosfamide)、埃达鲁比辛(idarubicin)、干扰素β(interferonbeta)、爱莱诺迪肯(irinotecan)、L-天门冬酰胺酶(L-asparaginase)、L-天门冬胺酸(L-asparticacid)、环己亚硝脲(lomustine)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)丝裂霉素(mitomycin)、胺甲喋呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、美皆斯妥(megestrol)、霉法兰(melphalan)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、米托坦(mitotane)、紫杉醇(paclitaxel，taxol)，普卡霉素(plicamycin)、喷司他丁(pentostatin)、链尿佐菌素(streptozocin)、托泊替康(topotecan)、他莫昔芬(tamoxifen)、坦尼坡赛(teniposide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或其组合。在其他实施例中，该药物是一种趋化介素(例如，CC趋化介素、CXC趋化介素、C趋化介素和CX3C趋化介素)或一种细胞生长激素(例如，干扰素(interferon)，白介素(interleukin)，淋巴因子(lymphokine)，和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor))。在进一步的实施例中，该药物是一种胜肽，较佳地一种对于癌细胞具有细胞毒性作用的胜肽。优选地，抗癌胜肽选自柳菩林(leuprolide)、诺雷德(goserelin)、善得定(octreotide)、组氨瑞林(histrelin)、阿巴瑞克(abarelix)、欣得泰(cetrorelix)、地加瑞克(degarelix)、西仑吉肽(cilengtide)、ATN-161及IM862的群组。本文所用的术语“治疗有效量(therapeuticallyeffectiveamount)”是指一有效的量，在剂量和必需的时间周期，以获得对于癌症，包括转移及抗药癌症期望的治疗要求。词组“药学上可接受的(pharmaceuticallyacceptable)＂是指分子整体及组合物是“通常认为是安全的”，例如，当给予于人，是生理上可耐受的并且通常不会产生过敏或类似的不良反应，例如胃不适，头晕等。较佳地，如本文所用的术语“药学上可接受的”指由联邦管理机构或州政府或在美国药典或其它一般公认的药典所核准可用于动物，并且更定而言是人。术语“给予(administered)”、“给药(administering)”或“施用(administration)”在本文可互换，其是指直接施用一人类化双功能抗体或一本发明的组合物。术语“个体(subject)”或“患者(patient)”是指动物，包括人类其可以本发明的组合物及/或方法治疗。术语“个体”或“患者”指男性和女性两者，除非一种性别被特别指出。因此，术语“个体”或“患者”包括可以从治疗癌症中获益的任何哺乳动物。一“个体”或“患者”的例子包括，但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟和家禽。在示范性实施例中，该患者是人。如本文所用的术语“相同的(identical)”或“百分比同一性(percentidentity)”是指两个或两个以上序列或子序列，比较及最大对应排比时具相同或特定的氨基酸残基比例是相同的。为确定百分比同一性，该序列排成一列进行比对为达最佳比较目的(例如，在第一氨基酸序列中间隙可以被引入以达与第二氨基酸序列的比对最佳排比)。该氨基酸残基对应的氨基酸位置进行比较。当在该第一序列中的一个位置被相同的氨基酸残基与第二序列中相应位置占据时，则该分子在该位置是相同的。两个序列之间的该同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置/位置的总数(例如，重迭位置)×100)。在某些实施例中，两个序列长度相同。单数形式“一”、“和”及“该”在本文中用于包括复数对象，除非上下文另有明确说明。II.本发明的说明因此，本发明的第一个方面提供双功能抗体(BsAbs)其将一个非标靶PEG化物质转化为肿瘤标靶PEG化物质，从而抑制癌细胞的生长或阻止侵入的或转移癌症，包括抗药性癌症。1.本发明双功能抗体(BsAbs)的结构抗体属于免疫球蛋白类蛋白质，其包含IgG、IgA、IgE、IgM及IgD。在血清中发现最丰富的免疫球蛋白系IgG，其结构示意图标于图1。该IgG的结构有四条链，两条轻链和两条重链；每个轻链具有两个结构域(domain)而每个重链具有四个结构域。抗原结合位位于该片段抗原结合(fragmentantigenbinding，Fab)区域，包含可变轻链(variablelight，VL)和可变重链(variableheavy，VH)链结构域，以及一个恒定轻链(constantlight，CL)和恒定重链(constantheavy，CH1)结构域。该重链的CH2和CH3结构域称为可结晶片段(fragmentcrystallizable，Fc)区域。一个全长抗体重链是一多肽，包括，从N末端至C末端，一VH、一CH1、一铰链区(hingeregion，HR)、一CH2及一CH3；缩写为VH-CH1-HR-CH2CH3。一全长抗体轻链是一多肽，一VL及一CL组成，由在N端至C端方向，简写为VL-CL，其中CL可以是κ(kappa)或λ(lambda)。该IgG抗体被认为是一异四联体(heterotetramer)具有两条重链通过双硫键(disulfidebonds，-S-S-)结合在一起，在CL结构域和CH1结构域之间和两个重链的铰链区之间。如上所述的“定义”部分中，该BsAbs是指抗体具有至少两种不同抗原的专一性；因此，本发明的BsAbs是重组抗体加工以包含能够结合不同抗原的序列。因此，各种重组双功能抗体形式已经开发于本发明中，并且这些BsAbs的概略结构示意图标于图2A至2E。在一些实施例中，本发明的BsAb是一个二聚体，四价双功能抗体，其中定向到第一抗原的全长IgG的该二重链分别经由胜肽接头被融合到定向到第二抗原的单链可变片段(例如，scFv)(图2A)。该scFv中，较佳地一个双硫键稳定的scFv，由一个抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)，和一个接头；缩写为VH-接头-VL。选择性地，本发明的BsAb可以是单体的，二价双功能抗体，其中VH-CH1结构域和引导到第一抗原的轻链VL-CL结构域通过胜肽接头融合于双硫键稳定单链结构域定向到第二抗原(图2B)。在一些实施例中，本发明的该BsAb是一单体、二价双功能抗体，其中一双硫稳定单链结构域引导该第一抗原通过胜肽接头连接一单体体抗体引导至一第二抗原(图2C)。在其他实施例中，本发明的BsAb具有“孔中球(knobintohole)”结构，其中在该第一重链的CH3结构域球是通过选择性的氨基酸取代几个氨基酸创造，并且在第二重链的CH3结构域的位置并列该位置的一孔由合适的氨基酸取代所创建。此外，半胱氨酸残基(cysteineresidues)被引入，以形成重链之间的双硫键连接。一＂孔中球＂BsAb结构示意图标如图2D描绘。在进一步的实施例中，如在图2D中所描绘的该“孔中球”BsAb进一步修饰，其中一个单体抗体重链于转录期间交叉其轻链，并由此产生一经修饰的抗体的重链杂多肽(hetero-polypeptide)，一VH、一CL一铰链区(hingeregion，HR)、一CH2及一球-CH3(knob-CH3)，由在N-端至C-端的方向组成；缩写为VH-CL-HR-CH2－球-CH3；和一修饰的抗体轻链的杂多肽，一VL及一CH1，由在N-端至C-端的方向组成；缩写为VL-CH1。图2E是本修饰的“孔中球”BsAb结构的示意图，其中一个单体抗体重链间交叉其轻链，而其它单体抗体结构保持不变。2.抗体制备用于制备本发明的BsAbs的方法在实例中描述。为了制备人类化双功能抗体，一种非人(例如鼠)抗体的制备和用作起始材料；相关技术在以下部分将简要描述。2.1鼠类抗mPEG抗体的生产为产生所需的单克隆抗体(monoclonalantibodies)，动物如小鼠、大鼠或兔子与mPEG衍生蛋白(mPEG-derivatizedproteins)分子(即该PEG分子具有末端甲氧基)或PEG衍生蛋白分子(即该PEG分子具有末端羟基)在适当剂量产生免疫反应。当该动物与mPEG-或PEG衍生蛋白质产生免疫反应时，通常，佐剂(adjuvan)与mPEG-或PEG衍生蛋白质溶液是混合在一起。佐剂用于本发明的实例中包括弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant，FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant，FIA)，和氢氧化铝佐剂。免疫反应通常进行主要通过静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射抗原。免疫间隔没有特别的限制。免疫反应可以进行在数天至数周之间隔，较佳地为2至3周，1至10次，较佳地为2至5次。当血清样品中的抗体效价(titers)于1000倍稀释后达2或更多的吸光度作为免疫反应的结果，将动物放置约1个月。然后，至少再进行一次再免疫反应。在最后一次免疫后数日，较佳地为3至5天，脾细胞(spleniccells)和区域淋巴结(regionallymphnodes)被除去。在免疫反应之后，血液样本被以常规方式取出并离心分离血清。所得的血清接着借由任何适合的方法，包括但不限于，酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、酶联免疫分析法(enzymeimmunoassay，EIA)或放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)测定抗体效价(antibodytiters)。在一较佳实例中，抗体效价利用ELISA测定。接着，最终免疫反应使那些动物对于mPEG-或PEG-衍生蛋白质同型异构物具有高抗体效价。抗体产生细胞从该免疫动物的脾细胞和区域淋巴结或类似的细胞或位置制备。在抗体产生细胞的制备过程中，尽可能除去组织碎片和红血球。市售红血球去除剂可以被用于此目的。或以氯化铵(ammoniumchloride)缓冲液及三羟甲基氨基甲烷(Tris)可以制备和使用来替代。可替代地，缓冲氯化铵和的Tris可以制备和使用。如此制备的产生抗体细胞，应立即融合不朽细胞(immortalcells)如骨髓瘤细胞(myelomacells)，以产生融合瘤细胞(hybridomacells)，其中半永远继续增生而产生抗体。通常可获得细胞株(Commonlyavailablecellstrains)被使用来自一动物，例如鼠。本发明的优选的细胞株应是那些高效融合，支持稳定高水平产生抗体，并且对HAT选择培养基敏感，其中该HAT选择培养基含有六羟基嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)和胺基喋呤(aminopterin)及当与抗体产生细胞融合生存所需。骨髓瘤细胞的种类包括，但不限于，小鼠骨髓瘤细胞株(mousemyelomacellline；如骨髓瘤FO细胞(myelomaFOcells))和人骨髓瘤细胞株(humanmyelomacellline如卡帕斯希707H(Karpas707H)。细胞融合是通过将脾细胞或淋巴结细胞与市售的骨髓瘤细胞在细胞融合促进剂(cell-fusionpromoter)的存在下混合，例如PEG约200至20,000道尔顿(daltons)或类似具有的平均分子量进行。可替代地，细胞融合可以在市售的细胞融合装置来进行利用电刺激如电-融合(electro-fusion)。融合后，得到的细胞接着稀释并在HAT培养基中培养。所需要的融合瘤从已融合细胞中被选出。该融合细胞在HAT培养基中存活下的细胞将形成群落(colony)。将每一培养皿中的上清液收集并检验是否存在对于mPEG-或PEG衍生蛋白质的抗体效价。ELISA、EIA或RIA作为确认的方法，其中CH3-PEG750-NH2或NH2-PEG3000-NH2涂覆(coated)于该盘上并用作筛选标准。一旦抗体阳性盘孔被识别，该细胞培养于一不含胺基喋呤的HT培养基。在培养一段时间之后，在培养上清液中的抗体效价再次确认。最后被选择的细胞接着被克隆(cloning)，取得一单细胞表现出高度对mPEG-或PEG衍生的蛋白质专一性的细胞株(clones)被选择，并且被克隆到一定程度来建立融合瘤。根据本发明一较佳实施例，3个融合瘤，E11、15-2b及6-3被选定。该15-2B融合瘤产生的一抗mPEG单克隆抗体，其专一性结合到末端的甲基或羟基，而不是PEG的主链。相较之下，该E11和6-3的融合瘤，其产生抗PEG主链的单克隆抗体而不是PEG的末端甲氧基或羟基基团。在一些实施例中，该抗mPEG单克隆抗体被选择跳过该抗PEG主链的单克隆抗体，由于当抗体与聚乙二醇化的纳米颗粒接合时空间均匀性呈现。在其他实施例中，抗PEG主链的单克隆抗体被选定为抗mPEG单克隆抗体。因此产生的抗mPEG或抗PEG单克隆抗体可被任何已知方法被分离或制备。例如，抗体可以从培养在低血清浓度的培养基中的融合瘤的培养上清液中制备。可替换地，融合瘤细胞可以被注入动物的腹腔和所得腹水(abdominaldropsies)被收集以制备抗体。抗体可以采用亲合柱(affinitycolumn)，凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)，离子交换层析(ionexchangechromatography)或诸如此类的方法进行纯化或分离。任何这些已知的方法可适当地选择或组合使用。可替代地，抗mPEG或抗PEG单克隆抗体可经由DNA克隆(DNAcloning)产生。抗mPEG或抗PEGmAbsDNA编码(DNAencoding)可经由使用常规方法例如使用能够专一性结合单克隆抗体的重链和轻链基因编码的寡核苷酸探针(oligonucleotideprobes)轻易地分离和定序。该融合瘤细胞(例如，E11、6-3或15-2B融合瘤)作为此类DNA的较佳来源。当该DNA被分离将其置于表达载体(vectors)中，接着将其转染到宿主细胞如大肠杆菌(Escherichiacoli，E.Coli)，猿猴COS细胞(simianCOS)或中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞或骨髓瘤细胞，其在重组宿主细胞中不产生免疫球蛋白以合成期望的单克隆抗体。该单克隆抗体因此产生且该抗体DNA编码可被用于生产嵌合抗体(chimericantibody)(例如，双功能抗体)，人类化抗体及/或抗体片段衍生物。2.2人类化抗mPEG(15-2)或抗PEG(E11或6.3)抗体的生产一非人来源单克隆抗体的主要问题是其免疫原性(immunogenicity)对于接受者(recipient)在某些情况下，造成危险的过敏反应。大多数单克隆抗体是以鼠类为来源，并已发现当注射到人体具免疫原性。为降低本发明的抗mPEG或抗PEG单克隆抗体的免疫原性，人类化抗体制备借由连接不同鼠类抗mPEG或抗PEG的该重链及轻链的结构域于人抗体的恒定区产生。为制作人类化抗mPEG或抗PEG抗体，该抗体的DNA编码被分离及定序根据上文第2.1节描述的方法，并接着用于制作人类化构建体(constructs)。详细的制造方法示于实例中。根据本发明一较佳实施例，互补决定区(complementarydeterminingregion，CDR)嫁接被应用，其中CDR区在一个人抗体的VH和VL基因被替换为相应的CDR编码片段(如在那些对应抗mPEG或抗PEG抗体片段其氨基酸片段编码的DNA片段)。因此所得到的抗体具有可变区，其中只有所述CDRs是从原来的小鼠抗体，而在VH和VL基因的框架区以及恒定区基因(即，Cκ或CH1-H-CH2-CH3)是人免疫球蛋白G(huamnIgG)。在较佳的实施例中，人类化抗mPEG或抗PEG抗体包含一重链可变结构域和一轻链可变结构域。一旦产生，该人类化抗mPEG或抗PEG抗体可根据本领域的标准程序进行纯化，包括交叉流过滤(cross-flowfiltration)，亲和柱层析，凝胶过滤等进行纯化。应当理解的是，该人类化抗体应当在相同或基本相似的鼠类抗mPEG的方式来执行。较佳地，人类化抗mPEG或抗PEG抗体(无论是在Fab或全长IgG的形式)运用于人体个体应比鼠类版本更具优势。在一些实施例中，人类化抗mPEG被运用于本发明的双功能抗体产生。在其他实施例中，人类化抗PEG抗体被用于本发明的双功能抗体生产。2.3双功能单克隆抗体(bi-specificmonoclonalantibodies，BsAbs)的产生为产生BsAbs，描述于前述于2.2节中的该人类化抗mPEG或抗PEG抗体(无论是在Fab或全长IgG的形式)进一步与抗体或scFv其与肿瘤抗原结合，以便赋予癌症靶向效果。详细的制造方法示于实例中。在一般情况下，该上述人类化抗mPEG或抗PEG抗体的DNA序列包括人类化抗mPEG或抗PEG序列的重和轻链的DNA序列片段与所需抗体或scFv其利用一接头(linker)结合于一肿瘤抗原，接着将嵌合序列转殖至一表达载体用于转染一宿主细胞，并根据在上述2.2节相似的步骤随后纯化。该制成的BsAbs接着可用于治疗癌症或追踪癌症的发展与成像系统的辅助。因此，人类化的单体和二聚体抗体产生，其对PEG化分子及肿瘤抗原具有双功能，其包括但不限于TAG72、EGFR、HER2、CD19、和CD20。在一些实施例中，单体BsAbs包括PEG×EGFR(抗PEG抗EGFR)、PEG×TAG72(抗PEG抗TAG72)和PEG×HER2(抗PEG抗HER2)与衍生自hE11Fab片段的抗PEG部份被产生。在另一个实施例中，单体h6.3Fab×EGFR(抗PEG抗EGFR)和h6.3Fab×CD19(抗PEG抗CD19)的生产，其中h6.3Fab代替hE11Fab，被与scFv融合对应EGFR或CD19。在进一步的实施例中，单体h15-2bFab×EGFRscFv(抗PEG抗EGFR)，h15-2bFab×HER2scFv(抗PEG抗HER2)的产生，其中h15-2bFab与scFv融合对应EGFR或HER2。在更进一步的实施例中，单体h15-2bscFv×CD19Fab(抗PEG抗CD19)和h15-2bscFv×CD20Fab(抗PEG抗CD20)的生产，其中h15-2bscFv与抗CD19或CD20的Fab融合。在其他实施例中，二聚BsAbs包括PEG2×EGFR(抗PEG抗EGFR)、PEG2×TAG72(抗PEG抗TAG72)及PEG2×HER2(抗PEG抗HER2)的产生。不同于该单体BsAb，每个二聚体BsAb包括全长IgG，每个重链连接到能结合一肿瘤抗原的该scFV(例如，TAG72、EGFR或HER2)。此外，本发明的PEG×EGFR、PEG×HER2和PEG×TAG72的单体BsAbs不同于其他二聚体形式的对应体(即，PEG2×EGFR、PEG2×HER2及PEG2×TAG72)，因为它们不具有在其各自结构的HR-CH2-CH3结构域不同。在又一些其他实施例中，“孔中球(knobinhole)”BsAbs的制作，其中DNA序列编码抗体重链，特别是该两条重链的CH3结构域，被设计为引入特异性和互补的相互作用在各个CH3结构域的界面的两条重链。例如，数个氨基酸被取代成另一种氨基酸在第一个重链CH3结构域以创建一“球(knob)”结构，并且第二重链CH3结构域中的数个氨基酸被改变以创建一个“孔(hole)”，如此DNA序列所表达的该抗体重链不太可能形成一只为该第一对或只为该第二对组合，而是该“孔中球”重链对的组合。该孔中球技术是本领域技术人员的均知的技术，并且可以在形成本发明的BsAbs容易地应用。此外，该“孔中球”BsAbs可进一步借由互换该抗体重链和抗体轻链进行修饰，并由此产生一抗体重链杂多肽，由N末端至C端方向为一VH、一CL、一铰链区(hingeregion，HR)、一CH2及一球-CH3；缩写为VH-CL-HR-CH2-球-CH3(VH-CL-HR-CH2-knob-CH3)；和一抗体轻链的杂多肽，由N末端至C端方向为一VL和一CH1；缩写为VL-CH1。因此，在一个具体实施例中，一个“孔中球”抗mPEG，抗CD19BsAb产生。具体地，二点突变，S354C和T366W被引入到一h15-2b(抗mPEG)重链的CH3区以产生一个球结构；然而，额外四的突变点，S349C、T366S、L368A及Y407V，被引入到一BU12(抗CD19)的重链的CH3区，以产生一个孔的结构。除了产生在各个重链的该球和该孔结构中，该Bu12孔重链可进一步修饰通过与其轻链互换以产生一杂重链多肽及一杂轻链多肽，如上所述修改。因此，该Y形h15-2b球/Bu12孔BsAb(Y-shapeh15-2bknob/Bu12-holeBsAb)的每个臂分别识别不同的抗原，即，一PEG化分子和CD19。在一个具体的实施例中，h15-2b球/HER-2孔BsAb(h15-2bknob/HER2-holeBsAb)被提供，其中，该Y形h15-2b球/HER-2孔BsAb的该两个臂分别识别一个PEG化的分子和HER2。本发明中该组成和BsAbs各自的氨基酸序列列于表1至13。表1、PEG2×TAG72的氨基酸序列表2、PEG2×EGFR的氨基酸序列表3、PEG2×HER2的氨基酸序列表4、h6.3Fab×EGFR的氨基酸序列表5、h6.3Fab×CD19的氨基酸序列表6、h15-2bFab×HER2scFv的氨基酸序列表7、h15-2bFab×EGFRscFv的氨基酸序列表8、h15-2bscFv×CD19Fab的氨基酸序列表9、h15-2bscFv×CD20Fab的氨基酸序列表10、15-2b球/Bu12hole的氨基酸序列表11、15-2b球/抗HER2孔的氨基酸序列表12、h6.3球/BU12孔的氨基酸序列表13、h6.3球/抗HER2孔的氨基酸序列3.药物套组本发明的第二个方面提供一种药物套组用于治疗或成像癌症，包括转移性及/或抗药性的癌症。该药物套组，包括至少两种成分，第一成分是本发明的该BsAbs；及第二组分是PEG化物质，其包括一癌症治疗剂(例如，长春花生物碱(vincaalkaloid))，或一成像剂(例如，一微泡其中含一造影剂，或者一量子点(quantumdot))于PEG化物质内。通常情况下，各成分被包含在各自单独的容器中。较佳地，该第一和该第二成分可以分别存在于所述容器中以一干燥固体的形式或作为在生理上可接受的水性载体中的悬浮液。该试剂套组可视情况包括生理上可接受的水性载体，如一盐水在注射前该干燥成份的复水(reconstitution)。该两种成分将分别与各自的载体进行复水，然后混合以形成一个组件，其被给予于个体(例如，通过注射)。4.靶向及治疗癌症的一步方法因此，本发明的第三个方面提供靶向和治疗癌症的步骤方法，包括转移性和/或抗药性的癌症。该方法采用在第3节中描述的药物套组，其中所述分离的人类化抗PEG双功能抗体(bi-specificantibody，BsAbs)，为在第2节是一PEG化物质混合以形成一组件，在被给予于个体。可替代地，在第2节中描述的该人类化BsAbs首先被注入到个体(例如，人类)，再接着是注射PEG化物质(数据未显示)。图3是一示意图，说明借由使用本发明的药物套组300的一步方法靶向和治疗癌症。该药物套组300包括一人类化抗PEGBsAb310(humanized抗PEGBsAb310)和一PEG化物质320。该人类化抗PEGBsAb310由第一抗原结合位311，其选择性地结合到PEG化物质320，其包含在其结构内的一癌症治疗剂；及一第二抗原结合位312，其选择性地结合到靶蛋白质，例如肿瘤抗原340。在本实施例中，该PEG化物质320被描绘为一脂质体(liposome)或微胞(micelle)，并且其特征在于在具有一癌症治疗剂321的该脂质体或微胞结构内和多个PEG分子322从脂质体或微胞的该表面延伸。在结合到该聚乙二醇化的物质320中，该BsAb310的该第一抗原结合位311允许该BsAb310来定向该第二抗原结合位312从PEG化物质320的表面向外，从而将非靶向PEG化物质320转变为以肿瘤细胞靶向PEG化物质。实际中，为达成一步骤靶向和治疗目的，该人类化抗PEGBsAb310与PEG化物质320混合，以形成一组件330，该组件330接着立即给予(例如，注射)给个体(例如，人360，如图3中所描绘)。因此，本发明的第三个方面以提供一治疗癌症的方法。该方法包括的步骤中，向个体给予时，本发明的该BsAb及PEG化物质其含有癌症治疗剂在其中，其具有足以抑制个体的癌症的生长或转移的剂量。该给予个体的剂量为约0.1至50mg/Kg个体体重。在某些实施例中，该剂量给予于个体约1至40mg/Kg个体体重，如10至30mg/kg个体体重。该剂量可以施予单一剂量或给予一次以上小剂量来替代。本发明的该BsAb和该PEG化物质可以给予于哺乳动物，较佳地为人类，借由任何途径其可有效地传输包含在该PEG化物质中的化疗药物至适当的或期望的位点，如口服、经鼻、经肺、经皮，如被动或离子电渗递送，或肠胃外，例如，直肠，长效制剂，皮下，静脉内，肌内，鼻内，小脑，眼用溶液或软膏。应当理解的是，本发明的剂量依患者而异，不仅用于癌症治疗剂选择，给药途径，和该BsAb的结合一PEG化物质的能力，以引发在所希望的反应于该患者，也用于如疾病状态或病症的严重程度减轻，年龄，性别，体重的病人，对作为患者状况，和在病理条件下，正在接受治疗的严重程度，同时使用的药物或特殊饮食的患者，和其他因素，本领域技术人员将认识到，用适当的剂量，最终是由主治医生决定。给药方案可进行调整以提供改进的治疗反应。治疗有效量也是其中的治疗有益效果胜过癌症治疗剂的任何毒性或有害作用。较佳地，本发明的该BsAb及该聚乙二醇化的物质被给予在一剂量和一时间，使得症状的数量及/或严重程度降低。5.靶向组织成像的方法本发明的第四方面是提供一组织成像的方法，特别是活体个体的癌组织。该方法还需要利用在第3节中描述的药物套组，其中如在第2部分所述该分离的人类化抗PEG双功能性抗体(BsAbs)与PEG化物质混合，在被给予于个体之前，形成一组件。该方法包括，(a)将本发明的一第一足够量该人类化BsAb和一第二足够量的PEG化的量子点(PEGylatedquantumdot，PEG-QD)或一含有荧光染料的PEG化脂质体，以形成一个组件；(b)注入步骤(a)的该组件到该个体的身体部位；及(c)借由荧光光成像，电子自旋共振(electronspinresonance，ESR)成像，X射线成像，计算机断层扫描(computedtomography，CT)或磁共振成像(magneticresonanceimaging，MRI)以成像该个体的身体部位。该PEG-QD包含一量子点纳米晶体，其选自由一CdHgTe、硒化镉(CdSe)、硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)、硫化镉(CdS)、碲化镉(CdTe)、碲化镉/硫化镉(CdTe/CdS)、硒化铅(PbSe)和硫化铅(PbS)所组成的群组。本发明将更具体的说明，以下面的实施例，其提供了用于示范，而不是限制的目的。实例材料与方法细胞与动物乳腺癌细胞株MCF-7、人T淋巴细胞细胞株Jurkat、卵巢癌细胞株OVCAR-3、表皮样癌细胞株A431(EGFR+)(ATCCCRL1555)中、B淋巴细胞细胞株Raji(CD19+)(ATCCCCL86)、恶性黑色素瘤细胞株A-375、293FT细胞、B淋巴母细胞株拉莫斯(Ramos)(CD19+)(ATCCCRL-1596)、SW480(EGFR+)、SW620人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞株SKBR3(HER2+)，人乳腺癌细胞株MDA-MB-468、BALB3T3细胞中及GP2-293逆转录病毒包装细胞在本发明中使用。在一般情况下，细胞培养于Dulbecco改良的Eagle培养基(Sigma,StLouis,MO,USA)，其补充含有10％胎牛血清(fetalcalfserum；HyClone,Logan,UT)，100U/mL青霉素(penicillin)和100μg/mL链霉素(streptomycin)，在37℃下含5％CO2。A431、Raji和Ramos细胞生长在含有相同补充剂的RPMI-1640，但有10％牛血清(bovineserum)的来源。雌性BALB/c裸小鼠(6-8周龄)从台湾的台北国家实验动物中心取得。所有的动物实验均根据机构准则进行，并经中央研究院的生物医学科学研究所(IBMS)的实验动物设施和病理核心委员会同意。产生鼠类抗PEG抗体(antibodies，Abs)融合瘤细胞分泌抗PEG抗体是通过免疫雌性BALB/c小鼠的mPEG衍生的蛋白质或PEG衍生的蛋白质如前所述生成(Suetal.,BioconjugateChemistry(2010)21(7),1264-1270)。该融合瘤接着利用ELISA筛选。具体而言，用1μg/孔(well)的CH3-PEG750-NH2、NH2-PEG3000-NH2(Sigma-Aldrich)、或CH3-PEG5000-NH2在5μL/孔的0.1M的NaHCO3/Na2CO3于37℃下涂覆96孔盘反应3小时，接着，利用200μL/孔稀释缓冲液(2％脱脂牛奶于PBS中)于4℃下过夜进行阻断(blocked)。含抗体的梯度浓度的50μL2％脱脂牛奶加入到盘中在室温下1小时。该盘以PBS-T(PBS含有0.05％妥文-20(Tween-20))洗3次并以PBS洗2次。山葵过氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)共轭山羊抗小鼠IgMμ链(HRP-conjugatedgoatanti-mouseIgMμchain)(2μg/mL)或HRP共轭驴抗小鼠IgGFc(HRP-conjugateddonkeyantimouseIgGFc)(2μg/mL)稀释缓冲液被加入反应1小时。该盘洗涤并且过氧化物酶活性通过加入100μL/wellTMB受质溶液(BioLegend,SanDiego,CA)室温中反应30分钟进行测量。加入终止缓冲液(2NH2SO4，50μL/孔)后，读取吸光度(405nm)。选择的融合瘤被以3次极限稀释(limitingdilution)于含有胸腺饲养细胞(thymocytefeedercells)的HT培养基(Sigma-Aldrich)，含15％胎牛血清(Hyclone)96孔盘被克隆，并且3株融合瘤细胞，E11、6-3及15-2b被生产，其中E11和6-3分泌抗PEG主链抗体，而15-2b分泌抗mPEG抗体。PEG2×EGFR、PEG2×TAG72、PEG2×HER2、h6.3Fab×EGFR及h6.3Fab×CD19的DNA质粒构建为了产生该抗PEGFab或IgG为基础的BsAbs，该抗PEG抗体的该小鼠VL和VH结构域被分别从E11、6-3及15-2B融合瘤细胞所制备的cDNA克隆。该抗PEG(hE11,h6-3)和抗mPEG(h15-2b)抗体的该人类化VL和VH结构域通过E11、h6-3和15-25的该轻链和重链可变区域的该DNA序列编译互补决定区域(complementarity-determiningregions，CDRs)嫁接进入人类IgGVL和VH基因的框架区，接着与该剩余人IgG1恒定区基因的DNA序列进行融合。该Cκ、CH1及部分CH1-铰链-CH2-CH3(Fc)、人类IgG1恒定结构域是从提取的人PBMCcDNA中利用表14中的引物所克隆。表14克隆人CH1、Ck及Fc片段的引物该人类化可变结构域(VL或VH)及人抗体恒定结构域(Cκ、CH1或铰链-CH2-CH3(Hinge-CH2-CH3))通过重迭PCR接合。为了这个目的，所有该人类化的VL片段使用表15中的引物通过PCR扩增以引入部分Cκ片段于C端。表15、克隆人类化E11、6-3、15-2b抗PEG片段的该VL结构域的引物该VL-部分Cκ(VL-partialCκ)及Cκ片段借由重迭PCR进行再次接合，利用反向引物如上表14及表15所示的VL结构域的该正向引物及该Cκ以产生VL-Cκ片段。同样地，所有的该人类化VH片段通过PCR增幅以表16所示的引物，于C端引入部分CH1片段。表16、克隆人类化E11、6-3、15-2b抗PEG片段的该VH结构域的引物该VH-部分CH1(VH-partialCH1)、CH1和Fc片段通过重迭PCR(overlapPCR)接合，使用表14及表16所指的该VH结构域的该正向引物及该CH1及Fc反向引物，产生VH-CH1或VH-CH1-铰链-CH2-CH3(VH-CH1-hinge-CH2-CH3)片段。该hBU12dsFv的DNA片段利用组合PCR(assemblyPCR)以hBU12的VH及VL序列为基础被合成，如美国专利号7,968,687B2所述，该专利的全部内容在此引入作为参考。PCR反应如下进行：95℃，3分钟；10个循环的95℃30秒，63至53℃递减每1分钟(每个循环减少1℃)，72℃1分钟；25个循环的95℃30秒，53℃1分钟，72℃1分钟；72℃下进行10分钟。该VH和VL片段连接并使用表17中所述P1和P22引物扩增。该11F8dsFv的DNA片段利用组合PCR(assemblyPCR)以11F8的VH及VL序列为基础被合成，如欧洲专利号EP2332990A1所述，该全部内容在此引入作为参考。PCR如上所述被执行。该VH和VL片段分别以P23到P34引物及P35到P44引物如表18所述，使用组合PCR组装产生。该hCC49scFv及DNSscFv的DNA片段，利用过去研究(KCChenetal.,BioconjugateChemistry22:938-948,2011)所教示的该引物进行PCR增幅。C6ML3-9dsFv质粒的该产物于欧洲专利号EP2258726A1中所描述。接下使用表19所列引物利用PCR以产生SalI-接头-MfeI-hBU12scdsFv-MluI-6×His-ClaI(SalI-linker-MfeI-hBU12scdsFv-Mlul-6×His-ClaI)；而MfeI-接头-11F8dsFv-MluI(MfeI-linker-11F8dsFv-MluI)、MfeI-接头-DNSdsFv-MluⅠ(MfeI-linker-DNSdsFv-MluI)及MfeI-接头-hCC49dsFv-MluI(MfeI-linker-hCC49dsFv-MluI)是利用表20所述的引物通过PCR生成。表17、用于hBU12dsFv克隆的引物表18、用于11F8dsFv克隆的引物表19、克隆SalI-linker-MfeI-hBU12scFv-Mlul-6×His-ClaI的引物表20、克隆MfeI-linker-11F8dsFv-MluI,MfeI-linker-DNSdsFv-MluI及MfeI-linker-hCC49dsFv-MluI的引物该pLNCX-SfiI-mAGP3VL-Cκ-XhoⅠ-F2A-BglⅡ-mAGP3VH-CH1-SalI-eB7-ClaI质粒作为模板用于进一步的亚克隆(sub-cloning)。该SfiI-VL-Cκ-XhoI或BglII-VH-CH1-SalI或BglII-VH-CH1-铰链-CH2-CH3-SalI(BglII-VH-CH1-hinge-CH2-CH3-SalI)片段被亚克隆进入该叙述于上通过适当限制酶切割的模板DNA质粒，以产生的pLNCX-SfiI-抗PEGVL-Cκ-XhoI-F2A-BglII-抗PEGVH-CH1-SalI-eB7-ClaI或pLNCX-SfiI-抗PEGVL-Cκ-XhoI-F2A-BglII-抗PEGVH-CH1-绞链-CH2-CH3-SalI-eB7-ClaI质粒。此外，该单链可变片段(scFv或scdsFv)亚克隆进入这些质粒，利用SalI和ClaⅠ或随后的MfeI和ClaⅠ酶消化。15-2B球/Bu12孔(15-2bknob/Bu12hole)、15-2b球/抗HER2孔(15-2bknob/抗HER2hole)、h6.3球/Bu12孔(h6.3knob/Bu12hole)及h6.3球/抗HER2孔(h6.3knob/抗HER2hole)的DNA质粒构建为了构建该孔中球BsAbs(knobintoholeBsAbs)、h15-2b的VH-CH1或h6-3与修改后的人IgG1CH2-CH3结构域融合，借组合PCR(assemblyPCR)形成h15-2b球或h6-3球的重链。该重链序列，随后是由衍生自弗林蛋白酶2A(furin-2A，F2A)的一序列及h15-2b或h6-3的该轻链序列，通过NheⅠ和PmeI限制酶切位点的使用，被克隆进入慢病毒载体(lentivalvector)pLKOAS3W-hyg(RNAi核心实验室，中央研究院，台北，台湾)。采用免疫球蛋白结构域交叉的方式，单独与该CH1及铰链区的位置的修饰，产生BU12孔和α-Her-2孔。简言之，VH-部分CH1-Cκ-部分铰链(VH-partialCH1-Cκ-partialhinge)，具有一人流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)标记蛋白质融合在重链的N-端，与人IgG1CH2-CH3结构域融合以形成新的重链。α-Her2抗体或BU12的VL-CH1部分铰链序列借由F2A序列与该新的重链序列连接并利用SfiI和PmeI的限制酶位点克隆进入慢病毒载体pLKOAS3W-pur(RNAi核心实验室，中央研究院，台北，台湾)。克隆所用的引物如表21所述。表21、克隆孔中球(knobintohole)BsAbs的引物15-2bFab×HER2scFv、15-2bFab×EGFRscFv、15-2bscFv×CD19Fab及15-2bscFv×CD20FabDNA质粒构建该抗mPEG抗体的该VL-Cκ及VH-CH1结构域自该15-2b融合瘤的cDNA中克隆及人类化，以如前所述(ChuangK-Hetal.,J.Nucl.Med.2010(51):933-941)。该人类化抗mPEGVLandVH片段由组合聚合酶链反应(assemblypolymerasechainreaction，assemblyPCR)所合成并亚克隆分别进入反转录病毒载体(retroviralvector，pLNCX-抗PEG-eB7)中的独特的BglII、SalI、SfiI和XhoI限制酶切位。克隆15-2bFab序列的引物于表22中。该人类抗EGFRscFv被基于该h528FvDNA序列被克隆(Makabeetal.,(2008)J.Biol.Chem,283,1156-1166.)。因此，h528FvDNA序列通过组装PCR(assemblyPCR)产生。用于抗EGFRVH及VL的克隆引物于表23中。接着利用Mfe-ahEGFRVL引物、ahEGFRVL-(G4S)2引物、(G4S)2-ahEGFRVH引物及ahEGFRVH-stop-Cal引物产生人抗EGFRscFv，其含有一myc标记及15个氨基酸(GGGGS)3弯曲接头于该序列前方。一人类抗HER2scFv及抗DNSscFv分别自pBub-YCMC质粒(Shahiedetal.,(2004)J.Biol.Chem.279,53907-53914)及pLNCX-DNS-B7质粒(Chuangetal.,(2006)BioconjugateChemistry17,707-714)中克隆出。用于克隆人抗HER2scFv和抗DNSscFv的引物分别列于表24及表25中。一myc标记及15个氨基酸(GGGGS)3弯曲接头置于该抗mPEGFab及scFv基因间利用SalI及CalI限制酶位点以产生pLNCX-PEG×EGFR、pLNCX-PEG×HER2及pLNCX-PEG×DNS质粒。表22、克隆h15-2bFab序列的引物表23、克隆h528(抗EGFR)scFv的引物表24、克隆C6ML3-9(抗HER2)scFv的引物表25、克隆h15-2bscFv的引物用于克隆抗人类CD19VH和VL的引物列于表26。该克隆的人类CD19VH和VL序列(表13)接着与h15-2bscFv的DNA序列融合以产生DNA表达PEG×CD19的BsAbs的构建体相同地，人类抗CD20VH和VL通过表27所列引物被克隆出，并且该克隆的人类抗CD20及抗CD22序列接着与h15-2bscFv的DNA序列融合，以分别产生PEG×CD20和PEG×CD22的表达BsAbs构建体。表26、克隆hHB12b(抗CD19)VL及VH的引物表27、用于F2F(抗CD20)VL及VH的克隆引物重组PEG2×TAG72、PEG2×EGFR、PEG2-HER2、PEG×TAG72、PEG×EGFR和PEG×HERBsAbs的生产CHO-K1/PEG2×TAG72及CHO-K1/PEG2×DNS细胞其稳定分泌PEG2×TAG72及PEG2×DNSBsAbs是通过反转录病毒转导作用(transduction)进入CHO-K1中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycells)产生。PEG2×TAG72、PEG2×EGFR、PEG2-HER2、PEG×TAG72、PEG×EGFR和PEG×HERBsAbs通过293FT细胞的瞬时转染(transienttransfection)相应的质粒产生。293FT/h6.3Fab×CD19和293FT/h6.3Fab×EGFR细胞其稳定分泌h6.3Fab×CD19及h6.3Fab×EGFRBsAbs通过慢病毒转导产生。重组慢病毒颗粒通过pAS3w.Ppuro-pAS3w.Ppuro-h6.3Fab×CD19和pAS3w共转染包装。Ppuro-h6.3Fab×EGFR(7.5μg)与pCMVΔR8.91(6.75μg)和pMD.G(0.75μg)利用TransLT1转染试剂(MirusBio,Madison,WI)(45μL)于293FT细胞生长在10cm的培养皿(90％细胞满度)。48小时后，慢病毒颗粒通过超高速离心(BeckmanSW41Ti旋翼式转子，50,000g，1.5小时，4℃)收集和浓缩。慢病毒颗粒悬浮于含5μg/mL的聚凝胺(polybrene)并以0.45μm过滤的培养基中。293FT细胞于病毒感染前一日接种于6孔盘中(1×105cells/well)。含慢病毒培养基加入细胞中接着离心1.5小时(500g,32℃)，该细胞于嘌霉素(puromycin，5μg/mL)中被选择以产生稳定细胞株(celllines)。该抗PEGBsAbs利用一TALON管柱的亲和性层析纯化。简要地说，该培养基每7-10天从CELLine贴附1000生物反应器(CELLineadhere1000bioreactors)(INTEGRABiosciencesAG,Switzerland)中收集。聚组氨酸标记(Poly-histidine-tagged)的BsAbs以Co2+-TALON管柱进行纯化(GEHealthcareLifeSciences，Piscataway，NJ)。该管柱以5倍柱床体积(bedvolumes)的结合缓冲(bindingbuffer，0.3M氯化钠/20mM磷酸/盐酸，pH值7.4)洗涤，并随后以10倍床体积的洗涤缓冲液(washingbuffer，0.3M氯化钠/20mM磷酸盐/5mM咪唑/盐酸，pH值7.4)洗涤。这些聚组氨酸标记BsAbs被以洗析缓冲液(elutionbuffer)(0.3MNaCl的/20mM磷酸盐/150mM的咪唑/盐酸，pH值7.4)洗析出。该洗析的蛋白质以葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25脱盐、PBS平衡并超滤(ultrafiltration)浓缩。蛋白质浓度以二辛可宁酸(Bicinchoninicacid，BCA)蛋白分析法(Pierce,Rockford,IL,U.S.A.)测定。PEG×EGFR、PEG×HER2和PEG×DNSBsAbs的生产为产生所期望的BsAbs，该BALB3T3生产细胞以上述本发明质粒转染并以MoFloTMXDP(Beckmancoulter,Inc.,Brea,CA)荧光流式细胞分选仪(fluorescence-activatedcellsorter，FACS)于4℃分选，接着培养于含1％CCSDMEM的CELLine生物反应器(INTEGRABiosciencesAG,Zizers,Switzerland)中。于收集该培养基后，BsAbs通过mPEG亲和层析被纯化，其为o-(2-aminoethyl)-o’-methylpolyethyleneglycol750(Fluka-Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)36mg交联于活化的CNBr-SepharoseTM4B(CNBr-activatedSepharoseTM4B,GEHealthcare,LittleChalfont,UK)。此过程根据CNBr-activatedSepharoseTM4B(GEHealthcare)产品使用说明书进行。孔中球BsAbs的纯化稳定表达BsAbs的293FT细胞，其以5×107的起始细胞数培养在含10％的低牛IgG(lowbovineIgG)培养液(血清以蛋白A树脂(proteinAresin)预吸收)的DMEM培养基的CellLineadhere1000生物反应器中(IntegraBiosciencesAG,Zizers,Switzerland)。每周收集培养的上清液。该收集的上清液以于4℃下，以800g离心10分钟以去除细胞，并随后在4℃下，以15000rpm离心25分钟以除去细胞碎片。之后，将该上清液通过0.45μm过滤器和在磷酸盐缓冲液(PBS)的G25管柱中，最后利用蛋白A琼脂糖(proteinAsepharose)亲和性纯化bsAb。蛋白A纯化后，将该纯化产物利用CNBr活化SepharoseTM4B共轭接合methyl-PEG1000-NH2(CNBr-activedSepharoseTM4B，Sigma-AldrichChemicalCo,St.Louis,MO,USA)以亲和层析法进一步纯化，其每克CNBr活化SepharoseTM4B共轭接合35mg的methyl-PEG1000-NH2。随后，该纯化的bsAb进一步利用皮尔斯抗HA琼脂糖(Pierceanti-HAagarose)(ThermoScientific,MA,USA)亲和层析进行纯化。纯化的bsAb分馏物(fractions)以1000倍体积的PBS透析3次并使用AmiconUltra(30kDa截留(cutoff))(Millipore)进行浓缩。纯化BsAbs的分析5μg的BsAbs(如PEG2×TAG72、PEG2×DNS、mPEG×EGFR、mPEG×HER2、mPEG×DNS、15-2B/BU12、h6.3/BU12、h6.3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19BsAbs)利用10％聚丙烯酰胺胶体(SDS-PAGE)在还原或非还原条件下进行电泳，并以考马斯蓝(CoomassieBlue)染色。酶联免疫测定法(ELISA)BsAbs的该抗PEG结合专一性经由PEG2×TAG72、PEG2×DNS、hCC49scFv、h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19于50μL2％脱脂牛奶中以梯度浓度的方式加入由该黏蛋白(mucin)、BSA-PEG5000、NH2-PEG3k–NH2或BSA涂覆的一盘中室温中反应1小时以进行测验。该盘以PBS-T(PBS含有0.05％妥文-20(Tween-20))洗涤三次。兔抗6×His(Rabbit抗6×His)(2μg/mL)补充以含有HRP-共轭山羊抗兔子(HRP-conjugatedgoat抗rabbit)(2μg/mL)或HRP-共轭山羊免疫球蛋白(Ig)抗人IgGFab(HRP-conjugatedgoatIgantihumanIgGFab)(2μg/mL)(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)于50μL稀释缓冲液的抗体加入室温1小时。该盘以PBS-T(PBS含有0.05％的Tween-20)洗涤三次并以PBS洗涤两次。结合的过氧化物酶活性通过加入150μL/孔ABTS受质溶液(BioLegend,SanDiego,CA)，在室温下进行30分钟反应后测量。盘孔的该吸光度(405nm)以微盘分析仪(microplatereader)进行测量(MolecularDevice,MenloPark,CA)。流式细胞仪分析PEG2×TAG72或控制组PEG2×DNSBsAbs(10μg/mL)与A-375(TAG72-)、MCF-7(TAG72+)、Jurkat(TAG72+)或OVCAR-3(TAG72+)细胞于4℃下共培养30分钟，随后给予FITC-标记的山羊抗人免疫球蛋白第二抗体(FITC-labeledgoat抗humanimmunoglobulinsecondantibody)(2μg/mL)(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)或FITC-标记4臂-PEG(FITC-labeled4arm-PEG)(2μg/mL)。PEG化合物的肿瘤特异性靶向利用A431(EGFRhigh)及Raji(CD19high)细胞株以10μg/mL的h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19BsAbs于含0.05％BSA的PBS(染色缓冲液)中4℃下反应30分钟，进行染色检查。该细胞以冷PBS洗涤3次。PEG-Qdot655(8nM)(Invitrogen,GrandIsland,NY)或PEG-化脂质体得克萨斯红(PEG-liposomalTexas-Red)(100nm大小，50μM，脂质浓度)(FormuMaxScientific,PaloAlto,CA)于染色缓冲液中被加入细胞4℃下反应30分钟。Raji细胞(CD19+)或SKBR3细胞(HER2+)与10μg/mLh15-2b-球/BU12-孔(h15-2b-knob/BU12-hole)、h15-2b-球/抗Her2-孔(h15-2b-knob/anti-Her2-hole)、h6-3-球/BU12-孔(h6-3-knob/BU12-hole)或h6-3-球/抗Her2-孔(h6-3-knob/anti-Her2-hole)BsAbs共培养、洗涤并与0.25μg/mlFITC-标记山羊抗人IgG或10nM含甲氧基的-PEGQdot655于4℃下反应30分钟。用冷PBS洗涤后，104个活细胞的表面荧光通过FACScaliber流式细胞仪(BectonDickinson,MountainView,CA,USA)进行测量，接着以FlowJo(TreeStarInc.,SanCarlos,CA,USA)进行分析。BsAb标的纳米粒子的共焦显微镜摄影于POC腔室(chambers)中的该盖玻片(30mm)于室温下予以溶于PBS中的10μg/mL多聚离胺酸(poly-L-lysine)涂覆反应30分钟。该盖玻片以PBS洗涤两次并且将每个腔室接种5×104个A431(EGFR+)肿瘤细胞于盖玻片上。A431细胞与10μg/mL的h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19BsAbs在37℃的含有1μg/mL及100nM红DND-99(RedDND-99，InvitrogenLifeTechnologiesCorporation,NY,USA)培养30分钟。该细胞以培养基洗涤2次。细胞成像在给予PEG-Qdot655溶液(InvitrogenLifeTechnologiesCorporation,NY,USA)16nM后以Axiovert200M共聚焦显微镜(CarlZiessInc.,Thornwood,NY)成像记录。细胞毒性试验A431(EGFRhigh)及Raji(CD19high)细胞(5000个细胞/孔)接种于96孔盘培养至隔日。h6.3Fab×EGFR或h6.3Fab×CD19BsAbs每毫升15μg加入到该细胞在37℃下，30分钟，并随后浓度梯度给予游离态阿霉素(freedoxorubicin)或PEG化脂质体阿霉素(PEGylatedliposomaldoxorubicin)(,TaiwanLiposomeCompanyLtd.,Taipei,Taiwan)加入细胞，三重复于37℃下反应4小时。随后将该细胞洗涤一次，并额外在新鲜培养基中再培养48小时，接着给予3H-胸腺核苷(3H-thymidine，1微居里(μCi)/孔)反应16小时。结果为与未处理的细胞相比的3H-thymidine合并进入细胞的抑制作用百分比表示。PEG-NIR797探针的活体光学成像BALB/c裸鼠带有Ramos(CD19+)及A431(EGFR+)肿瘤(～250mm3)于其后肢区域给予h6.3Fab×EGFR(50μg)及PEG-NIR791(50μg)静脉注射(intravenouslyinject)。戊巴比妥(Pentobarbital)麻醉小鼠依次以IVIS光谱成像光学系统(激发，745nm；发射，840nm；Perkin-Elmer,Inc.,MA,USA)在45分钟后进行成像，在注射后24小时和48小时。检测于结肠癌和乳腺癌细胞该肿瘤标志物的表达程度EGFR的表达被测量借由染色含1mg/mL尔必得舒(Erbitux)SW480或SW620细胞，在4℃下利用，接着以1mg/ml的FITC共轭山羊抗人IgGFc(FITCconjugatedgoatanti-humanIgGFc)(JacksonImmuno-ResearchLaboratories,Westgrove,PA)。相同的过程被用来测量SK-BR-3或MDA-MB-468细胞的HER2表达，其借由贺癌平(Herceptin，1mg/mL)且随后以1mg/mL的FITC共轭山羊抗人IgGFc染色。以冰冷的PBS充分洗涤后，活细胞的该表面免疫荧光以FACScan流式细胞仪(BDBiosciences,SanDiego,CA)测定且荧光强度以Cellquestpro软件分析(BDBiosciences)。PEG×EGFR和PEG×HER2的双功能测定以2μg/孔的溶于PBS的多聚赖氨酸(poly-L-lysine)(40μg/ml)于室温下涂覆96孔盘反应5分钟，后以PBS洗涤两次，接着以2×105cells/孔的SW480(EGFR+)或SK-BR-3(HER2+)肿瘤细胞接种。PEG×EGFR、PEG×HER2和PEG×DNS(10μg/mL)加入到孔中，在室温下反应1小时。该细胞接着以DMEM洗涤三次并200ng/mL的Lipo/DOX、66.7ng/mL的Lipo/IR780、100ng/mL的SN38/PM、600ng/ml的FeOdots、0.5nM的AuNP及0.5nM的Qdot565nm被加入孔中20分钟。在以DMEM充分洗涤后，PEG纳米颗粒(PEG-NPs)的浓度借由5μg/ml抗PEG主链抗体(来自6-3融合瘤细胞产生的6-3抗体)加入反应一小时，接着DMEM洗涤三次进行测定。为了放大信号，山羊抗小鼠IgG的Fc-HRP(goat抗mouseIgGFc-HRP)(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,PA,USA)0.4μg/mL，加入到孔中。第四次用DMEM洗涤孔盘，随后在405nm吸光度值以微盘分析仪(microplatereader)(MolecularDevice,MenloPark,CA)进行测量前，加入ABTS受质。PEG-NPs与PEG×EGFR及PEG×HER2的非共价修饰BsAbs加入到含PEG-NPs的BSA/PBS缓冲液(1倍PBS缓冲液含0.05％BSA)，于4℃下以反应1小时在380-570μgBsAb/μmoldoxorubicin(为Lipo/DOX)、550μgBsAbs/μmolFeOdot及140ngBsAbs/pmolQdots的protein/PEG-NP比例。经过PEG×EGFRPEG×HER2修饰后，PEG-NPs成为αEGFR-NPs或αHER2-NPs。非靶向NPs转变为靶向NPs的确认96孔盘以2μg/孔的溶于PBS的多聚赖氨酸(poly-L-lysine)(40μg/mL)涂覆，于室温下反应5分钟，以PBS洗涤两次并且以2×105cells/well的SW480(EGFR+)、SW620(EGFR-)、SK-BR-3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)肿瘤细胞接种。SW480(EGFR+)及SW620(EGFR-)细胞与4μg/mL的αEGFR-Lipo/DOX、1μg/mL的αEGFR-Lipo/IR780及4μg/mL的FeOdots反应20分钟。以DMEM充分洗涤后，PEG化NPs的该浓度以加入抗PEG主链抗体(6-3抗体)5μg/mL1小时反应后，接着以DMEM洗涤三次后进行测定。为了放大信号，山羊抗小鼠IgG的Fc-HRP(goatanti-mouseIgGFc-HRP)(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,PA,USA)0.4μg/mL，加入到孔中。用DMEM洗涤孔盘，随后在405nm吸光度值以微盘分析仪(microplatereader)(MolecularDevice,MenloPark,CA,USA)，进行测量前加入ABTS受质。相同的过程被用来研究SK-BR-3(HER2+)和MDA-MB-468(HER2-)细胞，其以4μg/mL的αHER2-Lipo/DOX、4μg/mL的FeOdots及2nM的αEGFR-Qdot565nm反应20分钟。BsAb-靶向NPs的共聚焦显微镜成像圆形盖玻片(18mm)于12孔盘中，以溶于PBS的多聚赖氨酸(poly-L-lysine)(40μg/ml)以20μg/孔涂覆于室温下反应5分钟。该盖玻片以PBS洗涤两次，并且将每个腔室接种4×104个SW480(EGFR+)、SW620(EGFR-)、SK-BR-3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-(肿瘤细胞/孔于该盖玻片上。SW480(EGFR+)和SW620细胞(EGFR-)与300ng/mL的αEGFR-Lipo/Rho与αDNS-Lipo/Rho于37℃下培养1小时。该细胞以溶于PBS的2％多聚甲醛(paraformaldehyde)在4℃下固定30分钟，并以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在4℃下染色45分钟。接着，该盖玻片以PBS洗涤4次，并随后以荧光封固剂(fluorescentmountingmedium；Dako,Glostrup,Denmark)封片于显微镜的玻璃载玻片上。αEGFR-Lipo/Rho及αDNS-Lipo/Rho的荧光讯号以一OlympusFluoViewTMFV1000共轭焦显微镜(OlympusImagingAmericaInc.,CenterValley,PA)记录。相同的方法用于SK-BR-3(HER2+)及MDA-MB-468(HER2-)细胞成像，其分别以4nM的αHER2-Qdot565nm及αDNS-Qdot565nm染色。BsAb靶向FeOdots的标的于磁振造影(MRimaging)磁振造影以一临床3.0T磁振造影仪(MRimager；Signa；GEHealthcare,LittleChalfont,UK)执行。1×107SW480(EGFR+)或SW620(EGFR-)细胞与不同浓度的αEGFR-FeOdots或αDNS-FeOdots(7μM、14μM及28μM)在4℃下培养30分钟。该细胞于PBS洗涤3次，接着BsAbs-FeOdots的堆积作用以T2加权快速自旋回波序列(T2-weightedfastspin-echosequence；TR/TE＝2500ms/60ms)进行扫瞄。同样的步骤用于观测αHER2-FeOdots和αDNS-FeOdots在SK-BR-3(HER2+)和MDA-MB-468(HER2-)细胞中的定位。BsAb-targetedLipo/DOX的体外毒性SW480(EGFR+)及SW620(EGFR-)细胞(3×103/孔)接种于96孔盘上。2μg/mL或4μg/mL的αEGFR-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX及Lipo/DOX加至每一盘孔并培养于37℃1小时。该培养基补充并且该细胞培养72小时在细胞活性以该ATPliteTM冷光分析系统(ATPliteTMLuminescenceAssaySystem；Perkin-Elmer,Inc.,Waltham,MA)检测之前。对SK-BR-3(HER2+)或MDA-MB-468(HER2-)细胞与αHER2-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX或Lipo/DOX培养在37℃3小时的细胞活性根据相同方法测定。相对于未处理细胞的冷光的抑制百分率以下公式呈现：抑制率(％)＝100×(处理组的冷光/未处理组的冷光untreatedluminescence)。每一个数据点的该标准偏差(standarddeviation)以三个样品(n＝3)的平均。BsAb-Lipo/IR780及Lipo/IR780活体内光学成像BALB/c裸鼠带有SW480(EGFR+)和SW620(EGFR-)肿瘤(约100mm3)在其后腿区域，分别静脉内注射αEGFR-Lipo/IR780，αDNS-Lipo/IR780，和Lipo/IR780(100μg/每只小鼠)。在注射后24，48和72小时，依次将戊巴比妥麻醉的小鼠用IVIS光谱成像光学系统(激发：745nm；发射：840nm；Perkin-Elmer公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)成像。EGFR+及EGFR-肿瘤以BsAb-Lipo/DOXandLipo/DOX的治疗BALB/c裸鼠小鼠(数量为6)于其后腿区域的皮下(subcutemeous，s.c.)接种4×106SW480(EGFR+)细胞及1×106SW620(EGFR-)细胞。肿瘤大小到达约20mm3时，静脉给予(intravenous，i.v.)Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX及αEGFR-Lipo/DOX，每周一次5mgDOX/kg，连续给予3周，总共给予15mgDOX/kg的剂量。其他治疗组给予生理食盐水。肿瘤测量进行每周3次用卡尺，以及使用方程式：(长×宽×高)/2，计算肿瘤大小。小鼠秤重每周一次以观测毒性。统计分析。不同平均值之间的统计显著差异被以JMP9.0软件(SASInstitute,Inc.,Cary,NC)以无母数曼-怀特尼检定(nonparametricMann–Whitneytest)估算。P值在毒性分析及活体毒性<0.05及P-values在该活体处理<0.01被视为具统计上显著。实例1制备和二聚体人类化双功能特异性抗体(BsAbs)的生产与定性1.1鼠类抗MPEG或抗PEG抗体的产生为了产生人类化BsAbs，三融合瘤细胞，E11、15-2b和6-3，被确定，且其各自的单克隆抗体分别通过亲和层析收集。该收集的抗体对于固定的PEG的专一性结合接着被测定。一典型专一性结合于融合瘤所产生的单克隆抗体与PEG之间示于图4。从图4可以明显看出，由融合瘤15-2b所产生单克隆抗体与CH3-PEG750-NH2结合，而不是NH2-PEG3000-NH2；其表明这种单克隆抗体专一性辨识该CH3-PEG分子的甲氧基末端或PEG分子的末端羟基(图4)，并因此被称为抗mPEG抗体(anti-mPEGAb)；而由融合瘤6-3或E11产生的该抗体对该主链部份，而非该末端甲氧基、末端羟基或该PEG分子具有专一性辨识，并因此称为抗PEG抗体(anti-PEGAb)。利用惯用程序(即，利用具有对于该单克隆抗体的重链或轻链基因编码专一性接合的寡核苷酸探针)分离及定序编码该抗mPEG或抗PEG抗体的DNA。1.2二聚体人类化抗PEG(hE11)抗TAG72BsAb的产生为了产生具双功能人类化抗体，将实例1.1的鼠抗mPEGmAb的该DNA序列人类化，并与抗肿瘤相关糖蛋白72(glycoprotein72，TAG-72)抗原(hcc49scFv)或一丹磺酰半抗原(dansyl(DNS)hapten)的人类的单链抗体片段基因融合，其遵照材料与方法部分所描述的方法制得。图5A是该人类化双功能抗体的DNA构建于实例中制备的一示意图。在一般情况下，每一个构建体依序列编码，HA抗原决定基(epitope)标记(tag)(HA)、该hE11抗PEG轻链、F2A一双顺反子因子(F2Abicistronicelement)、该hE11抗PEG重链、一绞链-CH2-CH3结构域(hinge-CH2-CH3domain)、一接头胜肽(L)、一抗肿瘤scFv序列(例如hcc49scFv用于PEG2×TAG72质粒，及抗丹磺酰scFv用于控制PEG2×DNS质粒)，及一组氨酸标记。图5B是此一实例的二聚人类化抗PEGBsAb的一示意图。因此，BsAbs包括制备出的PEG2×TAG72及PEG2×DNS。SDS-PAGE分析说明其BsAbs由一个VH-CH1-H-CH2-CH3-scFv片段(72kDa)和轻链(35kDa)在还原条件下(图5C，右图)组成；相较之下，一个230kDa的双硫键连接BsAbs于非还原条件被观测到(图5C，左图)。该结果进一步由蛋白印迹法(Westernblot)分析证实，在其中，该hE11抗PEG轻链的该N端上的HA抗原决定位及该scFv贴附于该hE11抗PEG重链的C端上呈现的该组胺酸抗原决定位标记被识别，证明其双功能抗体呈现预期的结构(图5D)。1.3实例1.2的BsAbs功能特性实例1.2的该人类化hE11BsAbs的双功能活性于本实例中观测。该BsAbs的结合利用ELISA法检测。微量盘首先以抗原涂覆并接着加入PEG2×TAG72、PEG2×DNSBsAbs或hCC49(抗TAG72)单链抗体。在该盘充分洗涤以除去未结合的抗体后，每孔中剩余的该结合的抗体以HRP共轭接合的二级抗体被侦测。该PEG2×TAG72BsAb能够同时结合黏蛋白(mucin)(TAG-72肿瘤抗原)(图6A)及BSA-PEG(图6B)，但不结合BSA(图6C)，证明其PEG2×TAG72显示对于PEG及黏蛋白具双抗原特异性。相较之下，该控制组PEG2×DNSBsAb结合BSA-PEG但不结合黏蛋白。相同的，该hcc49scFv结合到黏蛋白，但不与BSA-PEG结合。总结，实例1.2的PEG2×TAG72抗PEG(hE11)BsAb可以结合PEG和肿瘤抗原两者。为确定实例1.2的该hE11BsAbs是否能结合标的细胞，MCF-7乳癌、JurkatT细胞和OVCAR-3卵巢癌细胞，其表达TAG-72抗原可由hCC49抗体识别，与PEG2×TAG72及PEG2×DNSBsAbs培养。A-375恶性黑色素瘤细胞，其不表达的TAG-72抗原，被作为阴性对照细胞株。于该细胞洗涤未结合的BsAbs后，结合至细胞的该剩余BsAbs以FITC-共轭结合的抗-人类免疫球蛋白抗体(FITC-conjugatedanti-humanimmunoglobulin)进行检测。以流式细胞仪检测表面免疫荧光反应，证明TAG-72阳性细胞结合PEG2×TAG72BsAb而不结合该控制组PEG2×DNSBsAb(图7，左图)。为测试PEG2×TAG72是否可同时结合于癌细胞和PEG化分子，该细胞先与BsAbs培养、洗涤并接着与FITC标记的PEG分子反应。TAG-72阳性细胞与PEG2×TAG72BsAb反应但不与该控制组PEG2×DNSBsAb结合PEG-FITC，证明其PEG2×TAG72作为一真正的BsAb其可同时结合肿瘤抗原和PEG分子(图7，右图)。1.4二聚体人类化抗PEG(hE11)抗EGFR或抗HERBsAbs的产生及定性评估是否其它细胞标的可被抗PEGBsAbs所标识，单链抗体片段对应上皮生长因子受器(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)及该HER2抗原与该人类化E11抗体的该重链CH3区域基因的C端融合以分别产生PEG2×EGFR及PEG2×HER2，依照实例1.2相似步骤。该BsAbs结合至癌细胞的能力评估揭示其PEG2×TAG72与JurkatT细胞(TAG-72阳性)结合但不与MDA-MB-468细胞或BT-474细胞。与此相反，PEG2×EGFRBsA与MDA-MB-468细胞(EGFR阳性)结合但不与其它细胞反应，而PEG2×HER2BsAbs与BT-474细胞(HER2阳性)专一性结合(图8A)。因此，这些BsAbs与各自的标的细胞具一抗原依赖性(antigen-dependentmanner)。该双功能抗体同时结合肿瘤细胞和PEG化的化合物的能力进一步通过首先将细胞与BsAbs共培养、从细胞洗涤未结合的抗体并接着加入PEG-脂质体得克萨斯红(PEG-liposomalTexasRed)或PEG-Qdot655(PEG化量子点(PEGylatedquantumdots))的研究。每一BsAb选择性堆积PEG化脂质体(PEGylatedliposomes)(图8B)或PEG化的纳米颗粒(图8C)于表达对应标的抗原于表面上的细胞。总结，本实例的抗PEGBsAbs可以同时结合到目标抗原及PEG化物质以选择性堆积PEG化化合物和纳米粒子于各自标的细胞上。实例2单价(monovalent)人类化BsAbs的产生与特性2.1单价抗PEG(E11)BsAbs的产生与特性单价抗PEGBsAbs通过该一衍生自该抗PEG抗体E11至单链抗体人类化抗体的Fab片段与专一性肿瘤相关抗原的融合产生。具体而言，该hE11Fab片段与衍生自抗TAG72抗表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)或抗HER2/Neu抗体的一单链抗体片段(single-chainantibodyfragment，scFv)融合(图9)。产生稳定表达该单价BsAbs的CHO细胞，并且收集每一株表达细胞株的培养基。单价BsAbs与其标的蛋白的专一性结合通过BsAbs产生细胞的被收集的培养基的测量，加入该培养基至表达标的蛋白的细胞，接着通过ELISA测定其结合程度。洗涤细胞后，该已结合的BsAbs通过FITC标记的山羊抗人免疫球蛋白二级抗体(FITC-labeledgoatanti-humanimmunoglobulinsecondantibody)检测。结果发现，其PEG×TAG72结合至JurkatT细胞(TAG-72阳性)，但不结合MDA-MB-468细胞或BT-474细胞。与此相反，PEG×EGFRBsAb结合至MDA-MB-468细胞(表皮生长因子受体阳性)，但没有与其他两个细胞结合；而PEG×HER2BsAb被发现专一性结合至BT-474细胞(HER2阳性)(图10)。因此，单价抗PEG(hE11)结合至标的细胞具有一抗原-依赖性和选择性。通过共同培养标的细胞与BsAbs和PEG化物质，以观测该单价BsAb同时与癌细胞及PEG化化合物结合的能力。在从该细胞的未接合的抗体洗涤后，PEG-脂质体得克萨斯红(PEG-liposomalTexasRed)或PEG-Qdot655(PEG化量子点)被接着加入。每个BsAbs选择性地堆积PEG化脂质体(图11)或PEG化的纳米颗粒(图12)于其表达对应标的抗原于表面的细胞中。因此，单价抗PEG(hE11)BsAbs可以同时结合的目标抗原与PEG化物质以选择性地积PEG化化合物和纳米颗粒于该目标细胞的表面上。2.2单价抗PEG(h6.3)BsAbs的产生与特性该人类化抗PEG(h6.3)Fab被以一单一开读框(openreadingframe，ORF)构建，通过融合VL-Cκ及有一弗林蛋白酶2A(furin-2A，F2A)胜肽接头的VH-CH1，允许轻链与重链分别表达，根据材料与方法部分中所描述的程序进行。该单链双硫键稳定的可变区片段(disulfide-stabilizedvariablefragments，dsFv)与该6.3Fab中的该CH1结构域的C端连接，通过一胜肽接头产生h6.3-11F8(h6-3Fab×EGFR)及h6.3-hBU12(h6.3Fab×CD19)BsAbs(图13A)。该此二BsAbs接着插入到一慢病毒表达载体，以产生稳定的293FT生产细胞株。BsAbs(包括h6-3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19)其从该培养基中纯化，预期的分子大小，显示在一10％的SDS-PAGE(图13B)。此外，h6-3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19BsAbs两者和该NH2-PEG10,000-NH2结合，但不结合至控制组的BSA蛋白，说明其具有与PEG分子结合的专一性(图14A和14B)。至于其结合至该目标抗原的专一性，流式细胞仪分析显示，其是h6.3Fab×EGFR，但不为h6.3Fab×CD19，是能够指引该PEG化物质(包括PEG-脂质体得克萨斯红及PEG-Qdot655)至A431细胞(EGFR+)；而h6.3Fab×CD19，但非h6.3Fab×EGFR，能够引导PEG化物质至Raji细胞(CD19+)(图14C)。h6-3Fab×EGFR和h6.3Fab×CD19BsAbs的PEG-结合动力学通过微型热泳(MicroscaleThermophoresis，MST)进行验证(图14D和14E)。为了验证是否BsAb标的的物质可以被抗原阳性癌细胞内化(internalize)，活细胞成像通过细胞以溶酶体追踪子(lysosometracker)与BsAbs染色，随后以PEG-Qdot655的加入及反应进行。结果发现，其h6.3Fab×EGFR处理的A431细胞显示红色荧光于胞吞囊泡(endocyticvesicle)中，而h6.3Fab×CD19处理的A431细胞未能产生的PEG-Qdot655信号(图15)。这一观察结果说明，其h6.3Fab×EGFR调节EGFR内吞作用，允许PEG-物质的摄取到A431细胞中。接着，研究h6.3Fab×CD19和h6.3Fab×EGFRBsAbs是否能增加该载药纳米颗粒(drug-loadednanoparticles，NPs)对于抗原阳性癌细胞的细胞毒性的能力。Raji细胞(CD19+)和A431(EGFR+)细胞与h6.3Fab×CD19和h6.3Fab×EGFR进行培养，接着加入梯度浓度的Doxisome(即，PEG化脂质体化阿霉素)。当与Doxisome单独处理相比，无论h6.3Fab×CD19和h6.3Fab×EGFR增强Doxisome的分别对Raji、MDA-MB-468和A431细胞的细胞毒性(图16)。该结果说明，其抗PEG(h6.3)BsAbs可以赋予肿瘤选择性和增加PEG化的纳米颗粒(例如，doxisome)与抗原阳性的癌细胞的细胞毒性。为了确定抗PEG(h6.3)BsAbs-NPs于活体的肿瘤的标的，BALB/c裸鼠带有Ramos(CD19，左侧)和SW480(EGFR，右侧)的肿瘤在其后腿区被以静脉内注射h6.3Fab×EGFR和PEG-NIR797探针。该小鼠在注射后45分钟、24及48小时内，以IVIS光谱成像光学系统成像。PEG-NIR797的增强信号在A431肿瘤中观察到，但不在Ramos肿瘤(图17)，证明其h6.3Fab×EGFRBsAbs优先递送PEG探针至EGFR抗原阳性肿瘤的体内。2.3单价抗mPEG(h15.2b)BsAbs的产生及特性在本实例中，实例1.1的鼠抗mPEG抗体的DNA序列是人类化，结合其他核酸编译EGFR或HER2的一单链可变片段(singlechainvariablefragment，scFv)根据在材料和方法部分所描述的方法进行。图18A是在本实例中该人类化双功能性抗体制备的该DNA构建体示意图，且3BsAbs包括PEG×EGFR，PEG×HER2和PEG×DNS被产生。在一般情况下，每一个构建体中编码依序为，一信号肽(signalpeptide，SP)、HA抗原决定位标记(HA)、该抗mPEG轻链、一F2A一双顺反子因子，该抗mPEG重链Fd片段，一myc抗原决定为标记，一15个氨基酸柔性接头胜肽(L)及scFv对应抗肿瘤标记序列，如抗EGFRscFv用于PEG×EGFR质粒，及抗HER2scFv用于PEG×HER2质粒和抗丹磺酰(dansyl)scFv(anti-dansylscFv)用于该控制组PEG×DNS质粒。因此，3个BsAbs包括PEG×EGFR，PEG×HER2和PEG×DNS被制作。SDS-PAGE分析说明，在还原条件下，其BsAbs由一个Fd-scFv片段(56kDa)及轻链(35kDa)组成；相比之下，一91kDa的双硫键连接BsAbs于非还原条件下被观测(图18B)。该因此制成的人类化BsAbs接着进行于抗原阳性或抗原缺陷癌细胞的双功能活性测定。简言之，细胞具有过度表达的EGFR(即，SW480，EGFR+)或HER2(即，SK-BR-3，HER2+)首先与本实例的人类化BsAbs进行培养，并且该未结合BsAbs以一缓冲溶液洗出，不同的PEG-NPs(即，Lipo/DOX、Lipo/IR780、SN38/PM、FeOdot、AuNP及Qdot565nm)接着加入，并且该个别的该BsAbs结合活性以具有抗mPEG抗体的ELISA法检测。应该注意的是PEG×EGFR，而不是该阴性对照组PEG×DNS，调控所有测试的PEG-NPs至EGFR+SW480癌细胞的结合(图18C)。同样，PEG×HER2，但不是PEG×DNS，调控PEG-NPs结合至HER2+SK-BR-肿瘤细胞(图18D)。总的，PEG×EGFR和PEG×HER2两者显示双功能结合活性，并能调控PEG-NPs至表达该EGFR或HER2肿瘤标志的细胞的交联。为评估本实例的该BsAb是否可以赋予癌细胞对于PEG-NP专一性，本实例的该BsAbs加入至各种PEG-NPs(例如，Lipo/DOX、Lipo/IR780及FeOdot)以产生靶向的PEG-NPs。结合的专一性以ELISA测量。结果描述于图19。结果发现，其PEG-NPs靶向取决于该BsAb的该抗EGFR部份，用于控制组αDNS-NPs未能结合于SW480(EGFR+)或SW620(EGFR-)肿瘤细胞(图19A)。同样，PEG-NPs与PEG×HER2反应，允许纳米颗粒与SK-BR-3(HER2+)肿瘤细胞结合，但不与MDA-MB-468(HER2-)肿瘤细胞反应(图19B)。这些结果证明，其PEG×EGFR或PEG×HER2与PEG-NPs可赋予该纳米颗粒对于癌细胞上的EGFR或HER2具有专一性。进一步研究该靶向的PEG-NP于消灭抗原阳性癌细胞的能力，并且结果提供于图20中。如描绘在图20中，αEGFR-Lipo/DOX表达出对于SW480(EGFR+)癌细胞具有较高的细胞毒性，如与Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX比较(图20A)。相比之下，αEGFR-Lipo/DOX显示类似细胞毒性于Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX对于SW620(EGFR-)肿瘤细胞(图20B)。同样地，αHER2-Lipo/DOX显著对于SK-BR-3(HER2+)癌细胞较具毒性与Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX所造成相比(图20C)。然而，αHER2-Lipo/DOX与Lipo/DOX或αDNS-Lipo/DOX相比，对于MDA-MB-468(HER2-)具有相似毒性。因此，合理的结论的抗mPEGBsAbs可以赋予肿瘤选择性和增加的PEG-NP(Lipo/DOX)的对抗原阳性癌细胞的细胞毒性。探讨活体内BsAbs-NPs的肿瘤标的，BALB/c裸鼠带有EGFR-SW620(左侧)及EGFR+SW480(右侧)肿瘤在其后腿区，给予静脉注射αEGFR-Lipo/IR780、αDNS-Lipo/IR780或Lipo/IR780。该小鼠注射后24、48和72小时，以一IVIS光谱成像光学系统进行成像。该αEGFR-Lipo/IR780的荧光讯号在SW480(EGFR+)肿瘤中被增强与SW620(EGFR-)相比，于探针注射后24至72小时(图21，底行)。αEGFR-Lipo/IR780于SW480(EGFR+)肿瘤的荧光强度相对于SW620(EGFR-)肿瘤于24，48和72小时，分别为2.037，2.318和2.328倍以上(表28)。相比之下，Lipo/IR780及αDNS-Lipo/IR780于SW620肿瘤位置较强烈，应是由EPR效应。这些数据说明，其αEGFR-Lipo/IR780可能具有选择性对于EGFR+癌症细胞，从而促进于EGFR+肿瘤的增强积累。表28、在所指定的时间中SW480(EGFR+)对SW620(EGFR-)的重点区域(regionofinterest，ROI)比率计算为观测本实例的PEG×EGFR是否能增加Lipo/DOX对于EGFR+肿瘤于活体的治疗功效，带有SW480(EGFR+)及SW620(EGFR-)肿瘤于其后腿区域的BALB/c裸鼠被给予Lipo/DOXαEGFR-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX或食盐水。结果发现，αEGFR-Lipo/DOX抑制SW480(EGFR+)肿瘤生长显著高于Lipo/DOX处理组(P<0.01；于8至45天)(图22A)，且根据小鼠体重的测定，应无任何明显的毒性(图22C)。在该SW620(EGFR-)肿瘤模型，在给予αEGFR-Lipo/DOX、αDNS-Lipo/DOX或Lipo/DOX处理之间肿瘤大小无显著差异。因此，可合理的结论，该实例的PEG×EGFR可确实提高Lipo/DOX于活体中对于EGFR+肿瘤的抗肿瘤效率。2.4单价抗mPEG(h15.2b)、抗CD19或抗CD20BsAbs的产生及特性在本实例中，鼠抗mPEG单克隆抗体的该人类化单链可变片段(singlechainvariablefragment，scFv)与另一核酸编码该CD19或CD20的单体IgG结合，根据在材料和方法部分描述的方法。图23A的于本实例中制备的人类化双特异性抗体的该DNA构建体的示意图。在一般情况下，每一个构建体中编码依序，一信号肽(signalpeptide，SP)，一抗CD19或抗CD20重链序列(VH-CH1)，一抗CD19或抗CD20的轻链序列(VL-CK)中，一氨基酸柔性接头胜肽(L)和该抗mPEGscFv。因此，两抗mPEGBsAbs分别针对CD19和CD20被生产。结合的结果证实，本实例的抗mPEGBsAbs特异性地结合至该阳性表达CD19和CD20(例如，Raji细胞)(图23B)，以及PEG分子的末端甲氧基或羟基(图23C)。此外，一旦在本实例的抗mPEGBsAbs与用于治疗纳米颗粒(例如，Lipo/DOX)混合，其能够标的递送该治疗性纳米颗粒至CD19或CD-20阳性癌细胞(图23D)。实例3二聚体人类化孔中球(knobinhole)BsAbs的构建及特性3.1孔中球抗PEG(h6.3或h15.2b)、抗HER2或抗CD19BsAbs的产生重组DNA技术被利用来创造源自抗HER2抗体(C6)或抗CD19抗体(BU12)及人类化抗甲氧基-PEG单克隆抗体h15-2b或人类化抗PEG抗体h6.3的VH及VL的cDNA编码区域，使用“孔中球(knobs-into-holes)”策略的使用及免疫球蛋白结构域交叉的方法，以异二聚体的形成及正确抗体重链和轻链组件。为了产生正确组装抗体，BU12或C6抗体的该抗原结合片段(antigenbindingfragment，Fab)中的该轻链Ck结构域与重链CH1结构域被交换，而该抗PEG抗体保持不变。特别是，该肿瘤抗原的抗体BU12和C6的Cκ被该部分CH1片段及部分该抗体重链的部分铰链被取代，且抗体重链中的该原CH1片段位被该抗体轻链的该Cκ序列取代。这使得该轻链与其同源重链配对，而不是该抗PEG-球抗体的该重链。此外，对于重链异源二聚体的形成，分别将一个球结构(T366W和S354C)被引入该h15-2b和h6.3CH3区和一个孔结构(T366S，L368A，Y407V和Y349C)被引入到C6的CH3和BU12。自该抗mPEG(h15-2b)-球(anti-mPEG(h15-2b)-knob)抗体及BU12-孔(BU12-hole)或抗HER2-孔(anti-HER2-hole)抗体构建BsAbs的构建结构图描绘于图24A；而从该抗PEG抗体(h6.3)-球(anti-PEGantibody(h6.3)-knob)及BU12-孔或抗HER2-孔抗体构建BsAbs的DNA图显示在图24B上。BsAbs的该DNA构建体接着插入到慢病毒表达载体，以产生稳定的293FT生产细胞株。BsAbs(包括h15-2b球+BU12孔(h15-2bknob+BU12-hole)，h6.3+BU12孔(h6.3+BU12-hole))其自培养基中纯化，于10％的SDS-PAGE上显示预期的分子大小(图24C)。3.2实例3.1的孔中球BsAbs的特性在此实例中，实例3.1的该纯化孔中球BsAbs的该双特异性被研究。简言之，Ramos细胞(CD19+)和SKBR3细胞(HER2+)被用来验证是否纯化的BsAbs可结合于PEG化合物和其表达CD19或Her2/neu肿瘤抗原的癌细胞两者。简言之，将Ramos细胞(CD19+)，Raji细胞(CD19+)或SKBR3细胞(HER2+)培养于10μg/mLh15-2b球/BU12孔(h15-2b-knob/BU12-hole)或h15-2b球/抗Her2孔BsAbs(h15-2b-knob/anti-Her2-holeBsAbs)，洗涤并与0.25μg/mLFITC-标记的山羊抗人IgG(FITC-labeledgoatanti-humanIgG)或10nM的甲氧基聚乙二醇的Qdot655(methoxy-PEGQdot655)，在4℃下反应30分钟。活细胞的该表面荧光测定在FACSCalibur。结果示于图25至28。结果发现，h15-2b-球/BU12-孔(h15-2b-knob/BU12-hole)BsAbs结合于CD19阳性Ramos細胞，但不结合于SKBR3細胞；而h15-2b-球/抗HER2-孔(h15-2b-knob/anti-HER2-hole)BsAbs结合至SKBR3(Her2陽性)(图25)。这表示其h15-2bBsAbs保留该特异性结合到癌细胞抗原依赖性方式的能力。更重要的是，h15-2b-球/BU12-孔可以保持稳定的PEG化量子点于Ramos细胞和Raji细胞；及h15-2b-球/抗HER2-孔可以保留该量子点在SKBR3细胞中(图26)。因此，这些试剂充当真正的双特异性分子。h6.3-球/BU12-孔(h6.3-knob/BU12-hole)BsAbs以流式细胞仪测量，观察到类似的结果，其可以结合到CD19表达细胞(Ramos及Raji)(图27)。h6.3-球/BU12-孔亦有效地结合PEG修饰的量子点与Raji细胞(图28)，这表该此BsAb可以同时结合于癌细胞上的CD19和一聚乙二醇化纳米颗粒的PEG分子。实例4重组完整抗癌BsAbs的构建和定性4.1贺癌平(Herceptin)/h-α-PEG和尔必得舒(Erbitux)/h-αPEGAbs的产生创造试剂其可以协同攻击癌细胞，一功能和人类化抗PEG的单链抗体(h-αPEGscFv)与市售标靶抗体(包括贺癌平和尔必得舒)的C端融合，以形成双功能的贺癌平/h-αPEG及尔必得舒/h-αPEGAbs(图29)。因此，不仅有该贺癌平及/或尔必得舒抗体的原始抗癌作用被保留，且该新产生的BsAbs亦可以积极地结合到PEG化的药物于肿瘤部位，以产生协同抗癌作用(即，双攻击策略)。4.2实例4.1的BsAbs该功能的定性在本实例中，实例4.1的BsAbs的双功能活性被研究。简要地说，SKBR-3人乳腺癌细胞，其过量表达该HER2/c-erb-2基因产物，涂覆在96孔微量孔盘；接着贺癌平/h-αPEG抗体及控制组贺癌平抗体加入该微量孔盘中。在未结合的双功能抗体被洗出后，其中含有阿霉素(doxorubicin)的PEG化脂质体(在本文中为Lipo-DOX)加入到盘孔中。该PEG化化合物的结合通过ELISA来确定。正如预期的，贺癌平/h-αPEG而不是控制组贺癌平抗体，选择性地结合Lipo-DOX至SKBR-3细胞(图30A)。类似的结果也观察到的A431人上皮癌细胞，其具有过量表达EGFR。尔必得舒/h-αPEG而不是控制组尔必得舒抗体，指引PEG化的化合物堆积于A431细胞的表面(EGFR+)(图30B)。实例4.1靶向Lipo-Dox对癌细胞所使用的BsAbs的抗癌效果进一步于体外检测。结果描述于图31。据证实，贺癌平/h-αPEG(图31A)和尔必得舒/h-αPEG(图31B)，但不包括控制组，当分别与Lipo-Dox合并表现出协同抗肿瘤效果，说明该双攻击策略有助于实现肿瘤的杀伤效果更上一层楼。在一个类似的实验中，HER-2阳性SKBR-3细胞与5μg/mL贺癌平/h-αPEG或贺癌平，在37℃进行预培养1小时。洗涤去除未结合的抗体后，将细胞再用梯度浓度的Lipo-Dox(9、3及0.33μg/mL)处理三重复反应6小时。含药培养基以新鲜培养基置换，并允许细胞继续培养额外72小时。细胞ATP合成在经药物处理的细胞，然后与未处理的细胞比较。结果发现，细胞毒性程度在细胞预处理双特异性贺癌平抗体和Lipo-Dox，比用任单一贺癌平或Lipo-Dox处理组来的高(图32)。该发现是与图31相符的，在其中观察到Lipo-Dox和抗PEGBsAb的协同杀伤作用。应该理解的是，其上实施例所描述仅通过实例及各种修改可以由那些本领域的普通技术人员进行说明。以上说明书、实例及数据提供了对结构和使用本发明示例性实施例的完整描述。虽然本发明的各种实施例已经描述了以上带着一定程度的特殊性或参考一个或多个个体实施例中，那些与在本领域的普通技术人员可以做出多种更改对所公开的实施例而不脱离的精神或范围的本发明。当前第1页1 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