β细胞标记抗体的制作方法

专利名称：β细胞标记抗体的制作方法
β细胞标记抗体本发明涉及针对β细胞标记蛋白的抗体，尤其涉及针对蛋白ΤΜΕΜ27的抗体。功能性β细胞群的损失是1型和2型糖尿病两者发病机理的基础。因此体内β 细胞群的非侵入性成像将为定量糖尿病的进展和对治疗干预的响应提供有价值的诊断和研究工具。此外，体内非侵入性和靶向β细胞siRNA递送对于研究和治疗两者将是非常有价值的。跨膜蛋白Tmem27(C0lleCtrin)表达在胰β细胞中，其中它调节胰β细胞群和胰岛素分泌。Tmem27在质膜处通过蛋白水解切割和释放失活。因此，需要用于定量β细胞群的诊断和/或研究工具并且需要用于靶向药物递送到β细胞的工具。本发明的一个目的是提供针对Tmem27多肽表位的抗体。在优选的实施方案中所述抗体针对人Tmem27多肽。在进一步的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，优选是人源化抗体。在进一步的实施方案中，已经通过用表达Tmem27多肽(优选人Tmem27多肽)的全细胞免疫合适的动物产生所述抗体。在进一步优选的实施方案中，所述抗体包含可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域的CDR3和可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995) 获得的抗体的\结构域的⑶R3。在进一步优选的实施方案中，所述抗体包含可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域的CDRl至CDR3和可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)获得的抗体的Vl结构域的CDRl至CDR3。在进一步优选的实施方案中，所述抗体是包含可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域和\结构域的嵌合抗体。在进一步优选的实施方案中，所述抗体由杂交瘤细胞系TMEM27-8/9产生，该细胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)并且收到保藏号 DSM ACC29950在第二个目的中，本发明涉及本发明的抗体在制备用于治疗涉及TMEM27切割和其信号传导途径的调节的疾病的药物中的用途。所述疾病优选的是糖尿病。在进一步的实施方案中，使用本发明的抗体作为用于胞内递送活性化合物的工具。所述活性化合物优选与所述抗体共价偶联。“活性化合物”可以是任何合适的分子，包括DNA、RNA、siRNA、蛋白、肽或药物活性剂，诸如，例如，毒素、抗生素、抗病原药剂、抗原、抗体、抗体片段、免疫调节剂、酶或治疗药剂。本发明的抗体适于胞内递送活性化合物，因为所述抗体通过特异靶向胰β细胞从而允许靶向胞内递送所述活性化合物。在进一步的实施方案中，本发明的抗体可以用于动物(优选人类)胰脏中的β细胞胰岛和β细胞群的体内成像。用于体内成像的合适方法是例如免疫-PET(正电子发射断层扫描)。免疫-PET基于对标记有发射正电子的核素的单克隆抗体的一致性检测。以下正电子发射体可以用于免疫-PET 镓-68 (68Ga ；t1/2,1. 13小时)、氟-18 (18F ；t1/2,1. 83小时)、铜-64 (64Cu ；t1/2,12. 7 小时)、钇-86 (86Y ；t1/2,14. 7 小时)、溴-76 (76Br ；t1/2,16. 2 小时)、锆-89 (89Zr ;t1/2, 78. 4 小时)和碘-124 (124I ；t1/2，100. 3 小时)[The Oncologist (肿瘤学家)，Vol. 12，No. 12，1379-1389，2007 年 12 月)]。可以通过使用PET照相机检测淹没光子对(annihilation photon pairs)来监测患者体内PET缀合物的分布。PET照相机由放置在患者身体周围的检测器环组成。如果位于身体相对侧的检测器在非常短的时间间隔内(典型地5-15纳秒)记录了两个光子，则假定沿两个检测器之间连线的某处淹没事件已经发生。通过计算所有线的交叉，可以确定辐射源(放射性标记的mAb)的位置。术语“抗体”涵盖抗体结构的多种形式，包括但不限于完整的抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是人源化抗体、嵌合抗体或其它遗传改造的抗体，只要根据本发明的特征性质仍旧保留。“抗体片段”包含完整长度抗体的部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv 抗体在例如 Houston，J. S.，Methods in Enzymol (酶学方法).203 (1991) 46-96)中得到描述。此外，抗体片段包含这样的单链多肽，其具有Vh结构域的特征，即能够与\结构域一起组装，或具有结合于ANG-2的\结构域的特征，即能够与Vh结构域一起组装形成功能性抗原结合位点并由此提供性质。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生根据本发明的特性， 特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种嵌合抗体称作“类别转换抗体”。 嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如^01^化011，5丄.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；美国专利号 5，202，238 和 5，204，244。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白的CDR相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR。在优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见例如， Riechmann, L.等，自然(Nature)332(1988)323-327 ；和 Neuberger，M. S.等，自然 (Nature) 314 (1985) 268-270.特别优选的CDR对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生根据本发明的特性，特别是关于Clq 结合和/或Fc受体(FcR)结合。用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., 当前化学生物学观点(Curr. Opin. Chem. Biol). 5 (2001) 368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits，Α.， 等.，Proc. Natl. Acad. ki. USA(美国国家科学院学报)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等·，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Brueggemann, M.，等·，Year Immunol.(免疫学年度)7(199 33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H. R.，和 Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)222 (1991) 581-597)。Cole等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole等，单克隆抗体and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R. Liss, ρ· 77 (1985)；禾口 Boerner, P.等，J. Immunol.(免疫学杂志)147 (1991) 86-95)。如已经对根据本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生根据本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR 结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4 突变。)术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面定群(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。“可变结构域”(轻链(Vl)的可变结构域，重链(Vh)的可变结构域)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补决定区，⑶R)相连接。构架区采用β-折叠构象且⑶R可以形成连接折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构并与来自另一条链的 CDR—起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/ 亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。用于本文时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。 抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3 是最有助于抗原结合的区域并且限定抗体的性质。根据Kabat等，免疫目的的蛋白质序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第 5版，公众健康月艮务，国家健康
(Public Health Service,National Institutes of Health) ,Bethesda,MD(1991) 的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基确定CDR和FR区域。术语“Tmem27多肽”用于本文时指来自任何动物(例如哺乳动物)、物种(包括人)的天然Tmem27多肽和Tmem27变体。Tmem27多肽可以分离自多种来源，包括人组织类型或由重组和/或合成方法制备。人Tmem27多肽的氨基酸序列在kq. Id. No. 7中给出。在进一步的目的中，本发明提供包含本发明的抗体和与所述抗体共价连接的活性化合物的缀合物。在优选的实施方案中，所述活性化合物是毒素或SiRNA分子，优选是SiRNA分子。
通过使本发明的抗体与SiRNA分子的末端基团共价连接以A-X-Y的形式制备 siRNA-抗体缀合物的方法，所述方法包括选择预定的siRNA分子；以及将siRNA分子共价连接到本发明的抗体，其中A是本发明的抗体，X是连接体介导的共价键，而Y是siRNA分子。制备siRNA-抗体缀合物的方法可以包括激活siRNA的官能团，以及将激活的官能团共价连接到所述抗体。待激活的官能团可以包括但不限于胺基、硫醇基、磷酸基团或其组合。在一些实施方案中，激活siRNA官能团的物质包括1-乙基-3，3- 二乙基氨基丙基碳二亚胺、咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、二氯己基-碳二亚胺、N-马来酰亚胺基丙酸、N-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯(N-maleimidopropyl-oxylsuccinimide ester)、N-琥珀酰亚胺基吡啶二硫丙酸酯或其组合。制备本发明的siRNA抗体缀合物的其他方法可以在Handbook of Cell Penetrating P印tides (细胞穿透肽手册)，18章，第二版，2006年4月，编辑 ο Langel中找到。在进一步的目的中，本发明提供包含本发明的抗体或缀合物以及药用载体的药物组合物。为更好的给药，除上述活性成分外所述组合物可以进一步包含至少一种药用载体。这种载体的实例包括盐水、无菌水、林格氏液、缓冲的盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精 (水)溶液、甘油、乙醇及其化合物。如果需要，可以添加典型的添加剂诸如抗氧化剂、缓冲齐U、抑菌剂等。此外，可以通过添加更多的添加剂诸如稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂在制药上将所述组合物制备成用于以水溶液、悬浮液、乳化液等的形式注射。本发明的药物组合物可以通过不同的给药途径与身体接触，包括静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药、髓内给药、鞘内给药、心脏内给药、经皮给药、皮下给药、腹膜内给药、舌下给药和局部给药。对这样的临床给药，可以使用常规技术将本发明的药物组合物制成适当的产品。可以使用例如如在美国专利号4，816，567中所述的重组方法和组合物生产抗体。 在一个实施方案中，提供分离的编码本文中所述的抗ΤΜΕΜ27的抗体的核酸。这种核酸可以编码包含抗体的\的氨基酸序列和/或包含抗体的Vh的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和 /或重链)。在进一步的实施方案中，提供包含这种核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中， 宿主细胞包含(例如，已经转化有)(1)包含编码包含所述抗体的\的氨基酸序列和包含所述抗体的Vh的氨基酸序列的核酸的载体，或( 包含编码包含所述抗体的\的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含所述抗体的Vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如， Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗TMEM27抗体的方法，其中所述方法包括培养包含编码如以上提供的抗体的核酸的宿主细胞，在适于表达所述抗体的条件下，以及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为重组制备本发明的抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸并将其插入到用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一种或多种载体。这种核酸可以被容易地分离并使用常规方法(例如，通过使用能够特异性地结合编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。
适于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其是当不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利号5，648，237,5, 789，199和5，840，523。(也参见 Charlton，Methods in Molecular Biology (分子生物学方法)，卷 248 (B. K. C. Lo 编辑， Humana Press, Totowa, NJ, 2003)，245-254页，描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以从可溶组分中的细菌细胞糊状物(paste)分离所述抗体并将其进一步纯化。从产生单克隆抗体的杂交瘤克隆抗体基因的方法对本领域技术人员是已知的。例如，可以使用聚合酶链反应(PCR)用免疫球蛋白特异性的引物从杂交瘤细胞扩增可变重链和轻链结构域(Vi^PVl)的遗传信息(Methods Mol Med (分子医学方法)2004 ；94 :447-58)。 然后可以将编码可变重链和轻链结构域(Vh和VJ的核酸克隆到适于在宿主细胞中表达的载体中。附图简述

图1显示β细胞ΤΜΕΜ27蛋白水平与糖尿病进展相关联。用抗胰岛素(红色)、胰高血糖素(蓝色)和ΤΜΕΜ27 (绿色)的抗体给来自7或9周龄瘦(lean)或ZDF大鼠的胰脏石蜡切片染色。在胰岛素抵抗但是血糖正常的7周ZDF大鼠的胰脏切片中TMEM27的表达增加，其与β细胞群扩增相关联，图2显示在2型糖尿病患者体内ΤΜΕΜ27蛋白水平降低。对来自正常血糖供者和 2型糖尿病患者的胰脏石蜡切片的免疫组织化学染色显示在2型糖尿病胰岛中不与胰高血糖素(红色)共定位的ΤΜΕΜ27 (绿色)显著减少，图3显示允许人Tmem27以多西环素依赖的方式可诱导表达的INS-I稳定细胞系的蛋白质印迹。hTMEM27蛋白可以剂量依赖地被多西环素诱导，图 4a_4k 显示 TMEM27-8/9-Alexa488_IgG 和 TMEM27-8/9-Alexa555_Fab 与活的 INS-hTMEM27细胞孵育的结果，图5显示FDA批准的人组织微阵列的免疫组织化学染色。用结合有Alexa488的抗TMEM27 (克隆8/9)给人组织微阵列的石蜡切片染色，图6a和6b显示人和猴胰脏的免疫组织化学染色。用结合有Alexa488的 TMEM27(8/9)给人和猴胰脏的石蜡切片染色，图7显示在2型糖尿病猴中TMEM27蛋白水平降低。来自正常血糖的或2型糖尿病猴的胰脏的石蜡切片的免疫组织化学染色显示在2型糖尿病猴胰岛中与胰岛素(红色) 共定位的TMEM27 (绿色)显著减少，图8a_8i显示对识别TMEM27的抗体特异的IgG介导的siRNA细胞摄取，以及图9a和9b显示源自表面免疫染色和细胞内积累的siRNA标记物Cy5的定量荧光。实验部分允许人Tmem27以多西环素依赖的方式可诱导表达的INS-I稳定细胞系的产生将INS-IE细胞在包含IlmM葡萄糖(InvitrogenJi^i)并补充有IOmMH印es(pH 7. 3),10 % (ν/ν)热失活的胎牛血清(Brunsctiwig AG，瑞士)、50 μ Mβ -巯基乙醇、 ImM丙酮酸钠、SOyg/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的RPMI1640培养基中培养。将人 TMEM27cDNA(5183554, Invitrogen)亚克隆到 pTRE2 载体(631008，Clontech)中，遵循由 Wang等描述的方法将pTRE2载体用于转染并产生来源于INS-I的稳定细胞系。选择显示最高可诱导性和最低背景的克隆INS-hTMEM27*F2。如在图3中由蛋白质印迹所示，hTMEM27 蛋白可以由多西环素剂量依赖地诱导。图3 在存在所示浓度的多西环素的条件下将细胞培养Mh。在化学发光检测后用结合有辣根过氧化物酶的鼠抗人TMEM27单克隆抗体(克隆3/3)进行免疫印迹。细胞为,疮产牛鼠杭TMEM27单克降杭体使用INS-h_TMEM27克隆F2INS-1细胞通过重复注射活细胞进行对瑞士白化小鼠的免疫。一旦该动物显示对hTMEM27特异性的免疫反应，就将脾细胞移走并根据G. Kohler 禾口 C.Milstein(1975) “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity (分泌具有预定特异性的抗体的融合细胞的连续培养)”. Nature (自然)256 =495-497将其融合到Ag8细胞。将TMEM27-8/9-Alexa488-IgG 和 TMEM27-8/9-Alexa555_Fab 与活的 INS_hTMEM27 细胞孵育。INS-h-TMEM27克隆F2WT细胞在PDL包被的载玻片上生长并在37°C孵育。将不同浓度的mAb' s添加到诱导培养基(完全培养基+500ng/ml多西环素) 0. 6ml/ 孔并在 33°C孵育 Mhrs。然后用 Dulbeccos PBS (+Ca2+/+Mg2+)漂洗细胞 IX 并用 2% 甲醛固定。图 4a-4k 显示 TMEM27-8/9-Alexa488_IgG 和 TMEM27-8/9-Alexa555_Fab 与活的 INS-hTMEM27细胞孵育的结果。TMEM27定位在人和猴胰岛的β细胞将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的切片用于组装载玻片。顺序地将载玻片浸泡在二甲苯(χ2)、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和IXPBS(各3分钟)中以脱水。 通过将载玻片浸泡在IX柠檬酸缓冲液中并将其在微波(850瓦)中煮3分钟来进行抗原提取。在用水冲洗载玻片两次后，在室温用IOOyL 0.2%溶于IX PBS的Triton透化细胞10 分钟。在用IX PBS漂洗3次后，在室温用2%溶于IX PBS的BSA封闭30'到lh。在Ab孵育前用IX PBS再漂洗三次(1-2小时在37°C或4°C 0/N)。再漂洗三次并用DAPI染色(5_10 分钟、室温、暗处)。最后漂洗三次并组装盖玻片。图5 :FDA批准的人组织微阵列的免疫组织化学染色。用结合有Alexa488的抗 TMEM27(克隆8/9)给人组织微阵列的石蜡切片染色。抗TEMEM27特异性地染色人和猴β细胞。图6a、6b和7 人和猴胰脏的免疫组织化学染色。用结合有Alexa488的 TMEM27(8/9)给人和猴胰脏的石蜡切片染色使用TMEM27抗体作为载体，定量细胞siRNA摄取siRNA 制备寡核糖核苷酸合成根据亚磷酰胺技术在固相上使用ABI 394合成器(Applied Biosystems)在 10 μ mol量级合成寡核糖核苷酸。RNA序列信息见于表1。在由可控孔度玻璃(CPG，520人， 具有75 μ mol/g的加载，获得自I^rime Synthesis，ASton，PA，美国)制成的固体支持物上进行合成。常规RNA亚磷酰胺，2’ -0-甲基亚磷酰胺以及辅助试剂购自Proligo (Hamburg,德国)。特别地，使用以下亚酰胺(5’ -0- 二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰)-2’ -Ο-t- 丁基二甲基硅烷基-腺苷-3’ -0-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5’ -0-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙酰)-2，-Ο-t-丁基二甲基硅烷基-胞苷-3，-0-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5，-0-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰)-2，-Ο-t-丁基二甲基硅烷基-鸟苷-3，-0-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5，-0-二甲氧基三苯甲基-2’ -Ο-t- 丁基二甲基硅烷基-尿苷_3’ -0-(2-氰基乙基-N，N- 二异丙基氨基)亚磷酰胺。除N4-(t-丁基苯氧基乙酰)保护的2’-0_甲基-胞苷外，2’-0_甲基亚磷酰胺携带与常规RNA亚酰胺相同的保护基团。所有亚酰胺都溶解在无水乙腈(IOOmM)中并添加分子筛(3人)。为了在低聚物的5，端产生巯基连接体，使用来源于Glen Research (Sterling, Virginia，美国)的1_0_ 二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1 ‘ -[ (2-氰基乙基)-(N， N- 二异丙基)]-亚磷酰胺连接体。在mAb结合前使用TCEP减少二硫化物连接体(见下)。 对于Cy5缀合，使用6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)_(N，N- 二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research)在寡核糖核苷酸的5’端装配上C_6氨基连接体。将 5-乙基巯基四氮唑(ETT，500mM溶于乙腈)用作激活剂溶液。偶联时间是6分钟。为了引入硫代磷酸连接，使用IOOmM 3-乙氧基-1，2，4-二噻唑啉-5-酮(EDITH，获得自Link Technologies, Lanarkshire,苏格兰)无水乙腈溶液。使用相应的NHS酯(获得自GE Healthcare, Munich，德国)和携带有C6氨基连接体的寡核糖核苷酸将Cy5荧光染料连接到5’端。与支持物结合的低聚物的切割和去保护在结束固相合成后，将干燥的固体支持物转移至15mL管中并用溶于甲醇的甲胺 QM，Aldrich)在45°C处理180min。在离心后，将上清转移至新的15mL管中并且用1200yL N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，Fluka，BuchS，瑞士)漂洗CPG。将漂洗物(washing)与甲胺的甲醇溶液结合并添加450 μ L三乙胺三氟化氢(TEA · 3HF，Alfa Aesar，Karlsruhe，德国)。 将此混合物在65°C放置150min。在冷却到室温后，添加0. 75mL NMP和1. 5mL乙氧基三甲基硅烷(Fluka，Buchs，瑞士)。IOmin后，通过离心收集沉淀的寡核糖核苷酸，丢弃上清并且使固体在ImL缓冲液A中再生(见下)。寡核糖核苷酸的纯化通过强阴离子交换(SAX)HPLC使用预装的22x 250mm DNA Pac 100柱(Dionex， Idstein，德国)在AKTA Explorer系统(GE Healthcare)上纯化未加工的寡核糖核苷酸。 缓冲液A由IOmM NaC104、lmM EDTAUOmM Tris，pH 7. 4、6M尿素和20%乙腈组成。缓冲液 B是具有500mM NaC104的缓冲液Α。采用4. 5mL/min的流速。记录260和^Onm处的UV迹线。采用在55min内从20% B到45% B的梯度。集中合适的级分并用3MNa0Ac，pH = 5. 2 和70%乙醇沉淀。通过RP HPLC 使用 XiTerra Prep MS C810x 50mm 柱(Waters，Eschborn，德国)在 AKTA Explorer系统(GE Healthcare)上纯化未加工的带标记的低聚物。缓冲液A是IOOmM 三乙基乙酸铵(Biosolve，Valkenswaard，荷兰)而缓冲液B是包含50%乙腈的缓冲液A。 采用5mL/min的流速。记录260、280和643nm (在Cy5的情况中)处的UV迹线。采用在58 个柱体积(CV)内从5% B到60% B的梯度。集中合适的级分并用3M NaOAc, pH = 5. 2和 70%乙醇沉淀。最后，通过尺寸排阻层析在包含kphadex G-25 (GE Healthcare)的柱上使纯化的低聚物脱盐。通过在UV光度计中测量^Onm处的吸光度(Beckman Coulter, KrefelcMiI 国)确定溶液的浓度。直到退火，将单独的链作为冷冻溶液储存于-20°C。使寡核糖核苷酸退火以产生siRNA通过结合等摩尔的RNA溶液使互补链退火。冻干所述混合物并用合适体积的退火缓冲液(IOOmM NaCl、20mM磷酸钠，pH 6.8)使其再生以达到所需的浓度。将此溶液放置到在池内冷却到室温的95°C水浴中。表l:siRNA序列信息
权利要求
1.针对Tmem27多肽的表位的抗体。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体针对人Tmem27多肽。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1至3的抗体，其中所述抗体已经通过表达Tmem27多肽、优选人Tmem27多肽的全细胞免疫合适的动物产生。
5.权利要求1至4的抗体，其中所述抗体包含可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域的CDR3和可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995) 获得的抗体的\结构域的⑶R3。
6.权利要求1至5的抗体，其中所述抗体包含可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域的CDRl至CDR3和可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)获得的抗体的Vl结构域的CDRl至CDR3。
7.权利要求1至6的抗体，其中所述抗体包含可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域和\结构域。
8.权利要求1至7的抗体，其中所述抗体由杂交瘤细胞系TMEM27-8/9产生，所述细胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心)并且收到保藏号 DSM ACC29950
9.用作药物的权利要求1至8的抗体。
10.权利要求1至8的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗涉及调节TMEM27 切割及其信号传导途径的疾病，优选糖尿病。
11.用于治疗糖尿病的权利要求1至8的抗体。
12.权利要求1至8的抗体用于β细胞胰岛和β细胞群在动物的胰中体内成像的用途。
13.一种缀合物，所述缀合物包含权利要求1至8的抗体和与所述抗体共价连接的活性化合物。
14.权利要求13的缀合物，其中所述活性化合物是毒素或siRNA分子，优选siRNA分子。
15.杂交瘤细胞系ΤΜΕΜ27-8/9，所述细胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)并且收到保藏号DSM AC(^995。
16.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)获得的抗体的Vh结构域的序列。
17.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码可从杂交瘤细胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)获得的抗体的\结构域的序列。
18.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码由杂交瘤细胞系TMEM27-8/9产生的抗体的序列，所述细胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ (德国微生物和细胞培养物保藏中心) 并且收到保藏号DSM AC(^995。
19.包含权利要求16至18的核酸序列的载体。
20.包含权利要求19的载体的宿主细胞。
21.如本文之前所述的、尤其是根据上述实施例的发明。
全文摘要
本发明涉及针对β细胞标记蛋白的抗体，尤其涉及针对蛋白TMEM27的抗体。
文档编号C07K16/28GK102471383SQ201080034289
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年8月4日
发明者克里斯蒂亚诺·米廖里尼, 桑纳何·索夫曼·詹森, 王海燕, 胡格斯·马蒂勒, 谢斯廷·扬-霍夫曼 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司