专利名称：色素标记聚合抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用色素标记的聚合抗体及其制备方法。
色素标记抗体，因能与试液中抗原发生特异反应，同时具有可视性，所以可被如免疫传感器检出，在临床上可利用免疫学的抗原抗体反应来检测试液中所含的检体。目前已广泛用于各医疗机构的临床诊断中。
标记抗体的色素大多使用具有高的摩尔吸光系数、反应性高的花青类标记色素(Bioconjugate Chemistry Vol.4,No.2,pp105-111,1993)。
这样的花青类色素其官能团与抗体的氨基或羧基反应，进行共价结合，对于1分子抗体来说，结合20-50分子的上述色素。
这样制成的花青类色素标记抗体一般肉眼识别性好，例如用免疫层析法，可有效地检出只存在于孕妇尿中的人绒毛膜促性腺素等微量成分。
通常，1分子抗体与抗原反应部位只有2个，因此与抗原的反应灵敏度不高。
所以，在将现有色素标记抗体用于免疫传感器等情况下，限于其灵敏度，若试样液中所含的检测对象(抗原)浓度低时，其检出有困难。
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供检测对象浓度低时也能检出的高灵敏度的色素标记聚合抗体。
本发明的目的还在于提供制备这种色素标记聚合抗体的方法。
本发明提供色素标记聚合抗体，它由经多官能团试剂聚合的聚合抗体和如下式(1)或式(2)或式(2)所示花青类色素制成，所述聚合抗体被所述色素标记。
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
聚合抗体是具有多个抗原反应部位的多价抗体，因此与通常的二价抗体相比，与抗原的结合灵敏度高。
而且，每分子聚合抗体结合的色素数目比1分子抗体也增多，因此肉眼识别性提高。
从而，本发明的色素标记聚合抗体如果用于如免疫层析法，则在检测对象(检体)浓度低的情况下，也能高灵敏度地检出检体。而且，由于灵敏度高，本发明的色素标记聚合抗体也可适用于生物传感器。
本发明的色素标记聚合抗体通过所述花青类色素的琥珀酰亚胺碳与所述聚合抗体的氨基氮共价结合形成所述色素的骨架与所述聚合抗体结合的结构。
本发明的色素标记聚合抗体中抗体的聚合度通常以2-50范围内为佳。
本发明也涉及色素标记聚合抗体的制备方法，包括如下步骤在中性或弱碱性磷酸缓冲液中用多官能团试剂聚合抗体和在此缓冲液中加入式(1)或式(2)所示花青类色素标记所述聚合抗体。
此处所用的磷酸缓冲液的pH以7.0-8.0为佳。
可用于本发明的色素标记聚合抗体的抗体无特殊限制，与抗体来源及其亚型等无关。例如，作为免疫球蛋白(Ig)，可列举小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠IgA、小鼠IgE、大鼠IgG、大鼠IgM、大鼠IgA、大鼠IgE、家兔IgG、家兔IgM、家兔IgA、家兔IgE、山羊IgG、山羊IgM、山羊IgE、山羊IgA、绵羊IgG、绵羊IgM、绵羊IgA、绵羊IgE等。这些抗体可从商业途径购得也可直接从动物身上采取。
多官能团试剂可列举在同一个分子上有两个或两个以上能结合于抗体的官能团如琥珀酰亚胺基、吡啶基二硫基等的试剂。这些试剂的例子可以是式(3)所示丙酸二硫基磺基琥珀酰亚胺酯、式(4)所示辛二酸二(磺基琥珀酰亚胺)酯、式(5)所示酒石酸二琥珀酰亚胺酯、式(6)所示二(琥珀酰亚胺基琥珀酸乙二醇酯、式(7)所示N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸等。
式(1)或式(2)所示花青类色素是青色系列的色素，在长波长范围内有吸收，不易受杂质的影响。因此，可用于根据吸光度检出特定物质的传感器。
式(1)或式(2)中，X表示的卤素可列举氟、氯、溴或碘，M表示的金属可列举锂、钠和钾等。
图1是阐明本发明的一个实施例中免疫层析传感器结构概况的斜视图。
下面描述式(1)或式(2)所示花青类色素的合成途径的一个实施例。
首先，将肼基苯磺酸(8)与异丙基甲基酮溶于酸性溶剂中，加热，形成磺酸假吲哚鎓(9)。然后，在磺酸假吲哚鎓(9)的醇溶液中加入金属氢氧化物的醇溶液，得到磺酸假吲哚鎓的金属盐(10)。
接着，在上述金属盐(10)的有机溶剂溶液中加入饱和脂肪酸的卤化物，加热，得到羧基烷基磺酸假吲哚鎓的金属盐(11)。考虑到水溶性，上述脂肪酸的碳原子数以1-4为宜。
然后，将上述金属盐(11)与四甲氧基丙烷溶于碱性有机溶剂，加热，制成羧酸衍生物(12)，最后，在羧酸衍生物(12)的有机溶剂溶液中加入羟基琥珀酰亚胺和缩合剂二环己基碳化二亚胺，搅拌，得到式(1)所示花青类标记色素。
在式(2)所示花青类色素的合成上，用戊烯二醛四甲基缩醛代替四甲氧基丙烷。
又，式(1)、式(2)、式(11)和式(12)所示各化合物中所含的卤素为例如氟、氯、溴、碘。式(1)、式(2)、式(10)-(12)所示各化合物中所含的金属为例如锂、钠、钾等。
下面将描述用多官能团试剂进行抗体聚合反应的机制。
首先，如式(13)所示，将多官能团试剂(具有2个以上琥珀酰亚胺基的二硫二(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯))与抗体混合，如式(14)所示，抗体的氨基接近上述试剂的一个琥珀酰亚胺基的酯结合部位。
然后，如式(15)所示，上述氨基与上述酯结合部位反应，从上述氨基夺取一个氢原子。从此氨基脱离的氢原子与上述琥珀酰亚胺基的琥珀酰亚胺结合。琥珀酰亚胺变成羟基琥珀酰亚胺从琥珀酰亚胺基上脱离，与此同时，上述琥珀酰亚胺基的剩余部分与上述被夺取一个氢原子的氨基形成酰胺键，上述试剂通过此酰胺键与上述抗体结合。
上述试剂的其它琥珀酰亚胺基也与上述同样起反应，如式(16)所示，上述试剂与其它抗体通过酰胺键结合。此反应反复进行，使抗体发生聚合。
花青类色素的琥珀酰亚胺基与抗体的氨基结合反应的机制也与上述相同。
以下举出具体的实施例对本发明作更详细的说明。
(Ⅰ)小鼠IgG的聚合将10mg(6.667×10-5mmol)小鼠IgG(以下简称IgG)溶于1ml磷酸缓冲液(以下简称“PBS”)。将其在室温下边搅拌边滴加含二硫二(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(ヒァス公司制，以下简称“DTSSP”)的PBS溶液0.1ml。所滴加的DTSSP的PBS溶液中含DTSSP 4.057mg(0.006667mmol,100当量)。
然后，于35℃搅拌30分钟，将混合物用琼脂糖凝胶(商品名Sephadex G25M柱)过滤，得到约6ml IgG凝聚物(以下称作IgGagg.)的PBS溶液。所得溶液的浓度计算如下取所得的溶液0.5ml于280nm处测定吸光度，吸光度值为2.43。由于280nm处观察到的吸光度来自IgG，因此，IgG凝聚物的1分子IgG的浓度〔IgGagg.〕可计算如下。IgG在280nm处的吸光系数为2.099×105。
〔IgGagg.〕=2.43/2.099×105=1.158×10-5(M)(2)聚合抗体的色素标记将式(1)所示色素溶于0.2ml PBS(总蛋白量的400倍)中，配制成色素溶液(以下称作SLIC5)28.2mg。但是，使用式(1)中X为碘、M为钾、碳原子数n为2的化合物。
然后，将SLIC5缓缓滴入(1)中所得的IgGagg.溶液(使总抗体量为10mg)。其后，于4℃静置20小时，对添加了叠氮钠作为防腐剂的PBS 20升进行透析，以除去未反应的色素分子。得到约6ml SLIC5标记聚合抗体的PBS溶液。
按如下计算，求出所得的SLIC5标记聚合抗体的每分子IgG的SLIC5的分子数。
测定所得溶液的280nm和640nm处吸光度。结果，吸光度分别为12.0和45.5。聚合抗体在640nm处无吸收，因此，观察到的吸光来自结合的SLIC5。然而，SLIC5的浓度〔SLIC5〕可按如下方法求出。SLIC5的640nm处摩尔吸光系数为1.01×105。
〔SLIC5〕=45.5/1.01×105=4.505×10-4(M)又，观察到的280nm处的吸光来自聚合抗体的IgG，而结合的SLIC5在280nm处也有吸收，扣除此影响，按下式求出聚合抗体的IgG分子的浓度〔IgGagg.〕。而来自聚合抗体的280nm吸光度为Ab280,IgG,SLIC5的280mm摩尔吸光系数为2.11×103，聚合抗体的IgG分子的280nm摩尔吸光系数为2.099×105。Ab280,IgG=12.0-(4.505×10-4×2.11×104)=2.494〔IgGagg.〕=2.494/2.099×105=1.188×10-5(M)从而，SLIC5标记聚合抗体的每分子IgG结合的SLIC5的分子数计算如下。
〔SLIC5〕/〔IgGagg.〕=4.505×10-4/1.188×10-5=37.9(个)(3)色素标记聚合抗体的评价将(2)中制得的色素标记聚合抗体用免疫层析传感器测定640nm处吸光度来评估因色素标记聚合抗体的集聚而产生的发光度(敏感性)。
图1是显示免疫层析传感器概略结构的斜视图。将第一玻璃滤纸2、硝基纤维素制的抗体固定膜5和第二玻璃滤纸6依次放置在聚氯乙烯之类塑料制的支持板1上。然后，将第一玻璃滤纸2的接触抗体固定膜5侧的端部浸渍(2)中所得的色素标记聚合抗体，这部分形成标记抗体部3。将能与色素标记聚合抗体的同样抗原反应的抗体吸附固定于抗体固定膜5的预定部位，形成抗体固定部4。
用具有上述结构的免疫层析传感器测定吸光度按例如下面的方法进行。
按照层析法的原理，当试样液滴加到图1的第一玻璃滤纸2的不与抗体固定膜5接触的另一端时，试样液开始从第一玻璃滤纸2向第二玻璃滤纸6移动。标记抗体部3上，色素标记聚合抗体与试样液中的抗原结合。然后，含此标记抗体与抗原结合的试样液向抗体固定部4移动，上述抗原在此处与固定抗体结合，固定在此处。剩余的试样液经抗体固定膜5继续移动，最后吸附在第二玻璃滤纸6上。
将波长640nm的L1光辐照抗体固定部4，测定反射光L2，从而测得吸光度。
作为对比实施例，除了不聚合抗体外，按上述同样的方法制备色素标记抗体。与上述同样地，将其用免疫层析传感器测定吸光度。
结果，使用本发明的色素标记聚合抗体时，吸光度约为0.8，使用色素标记抗体时的吸光度约为0.08。
从该结果可以认为，本发明的实施例的色素标记聚合抗体的灵敏度约为对比实施例灵敏度的10倍。
如上所述，本发明的色素标记聚合抗体具有多个与抗原反应部位，因此灵敏度高。然而，例如将本发明的色素标记聚合抗体用于免疫层析法的传感器，则可制成比用现有技术制成标记抗体时灵敏度高的传感器。
权利要求
1．色素标记聚合抗体，其特征在于由经多官能团试剂聚合的聚合抗体和如下式(1)或式(2)所示花青类色素制成，所述聚合抗体被所述花青类色素标记
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
2．如权利要求1所述的色素标记聚合抗体，其特征还在于所述色素的骨架通过所述花青类色素的琥珀酰亚胺基碳与所述聚合抗体的氨基氮形成共价键而与聚合抗体结合。
3．色素标记聚合抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤在中性或弱碱性的磷酸缓冲液中用多官能团试剂聚合抗体；及在此缓冲液中加入式(1)或式(2)所示花青类色素，标记所述聚合抗体
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
全文摘要
本发明公开了检测对象低浓度时也可能检出的高灵敏度色素标记聚合抗体。该聚合抗体由经多官能团试剂聚合的抗体和如右式(1)或式(2)所示花青类色素制成，所述聚合抗体被所述花青类色素标记。式中，R
文档编号C07K16/44GK1238218SQ99106738
公开日1999年12月15日 申请日期1999年5月14日 优先权日1998年5月14日
发明者重藤修行, 宫崎仁诚, 平井真人 申请人:松下电器产业株式会社