专利名称：一种抗体的代谢标记方法及其荧光检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，涉及抗体的代谢标记方法及其通过点击化学进行免疫荧光染色分析的方法。
背景技术：
点击化学是通过小单元的拼接，快速可靠的完成形形色色分子的化学合成。它尤其强调以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助该反应来简单高效的获得分子多样性。由于点击化学产物无毒，且稳定性好，已被广泛用于药物筛选、药物开发、聚合及其它生物体外和体内分析。生物偶联技术是通过小分子化合物对生物大分子进行修饰的一种技术，已经在分子生物学和化学生物学等领域广泛的应用，如蛋白质、核酸等荧光团标记、修饰、配体螯合、 放射性同位素标记等。免疫荧光抗体技术是使用一个特殊的荧光标记物共价连接到任何一种抗原或抗体，并通过荧光显微镜进行检测的方法。目前，FITC、罗丹明等荧光标记物已经广泛应用于免疫荧光分析技术中，此外，利用生物素-亲和素系统的免疫检测系统，也被广泛应用。
发明内容
本发明的目的是开发一种新型的抗体标记方法，使该方法与传统方法相比具备操作容易，步骤少等优点，以丰富免疫学检测体系和荧光抗体检测手段，提供一种新的抗体代谢标记方法及其在荧光检测中的应用。本发明首先提供了一种抗体代谢标记方法，该方法包括
以含有叠氮基团的非天然单糖作为糖蛋白合成时的代谢标记物，其糖结构可以取代正常糖蛋白中的正常单糖，从而使被标记蛋白质含有叠氮基团，进而通过叠氮基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应，使蛋白质具备发光功能或偶联可被检测的标签基团。所述的叠氮反应基团是能与叠氮基团形成三唑环的炔基化合物，且具备发荧光特性或含有标签基团。所述的具备发荧光特性的偶联基团包括Cy3、Cy5、FITC、TRITC、ΡΕ、DAPI、Texas red、RB200、Indo-I 和量子点等。所述的标签基团包括His、GST、FLAG、HA和生物素等。
本发明同时提供了一种采用代谢标记方法标记的抗体在荧光标记及免疫荧光分析方法中的应用。
本发明涉及的关键化合物即含有叠氮基团的非天然单糖包括非天然单糖 1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰甘露糖胺(1，3，4，6-tetra-0-acetyl-N-azidoacetylmannosamine, Ac4ManNAz)、1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰唾液酸 (1, 3, 4, 6-tetra-0-acetyl-azido sialic acid, Ac4SiaNAz)、1，3，4，6-氧乙酰-2-脱 ii -N- # M Zi lit ^ L H 1 (ι, 3, 4, 6-tetra-0-acetyl-N-azidoacetylgalactosamine, Ac4GalNAz)禾口 1，3，4，6-氧乙酰 _2_ 脱氧-N-叠氮乙酰葡萄糖胺(1，3，4，6-tetra-0-acety 1-N-azidoacetylglucosamine, Ac4GlcNAz)以及检测化合物 4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺。将合成的非天然单糖加入到杂交瘤细胞培养基中培养，使之替代天然单糖，获得代谢标记的叠氮化的抗her2抗体，随后通过铜离子催化检测化合物中的炔基与代谢标记抗体的叠氮基团进行点击化学反应，实现荧光显色，其检测限可达0.1 yg，EC50为1 μ g， 并在细胞水平进行荧光染色分析验证。本发明自行合成了非天然单糖化合物Ac4ManNAz、Ac4SiaNAz、Ac4GalNAz、 Ac4GlcNAz和检测化合物4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺，非天然单糖拥有与替代正常单糖的能力，且能与炔基发生特异性的点击化学反应，改变4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺的电子分布。以上述合成的非天然单糖进行代谢标记，制备含叠氮基团地抗体，建立了使用该抗体的荧光抗体分析方法，通过细胞的免疫荧光染色和点击化学方法进行验证，同时确认了该标记方法的检测灵敏度和检测限。
本发明提供的抗体的叠氮标记方法的具体步骤如下
将含有叠氮基团的非天然单糖缓慢加入到细胞培养基中，终浓度为0. 2 mM，混勻后加入到杂交瘤细胞中，37°C，5% CO2培养72 h，收集细胞悬液，1000 r/min离心3 min，吸取上清液，以抗体纯化亲和层析柱纯化代谢标记的抗体。本发明提供的点击化学催化反应及荧光基团分析方法如下
将0.广1.0 mmol/L的非天然单糖加入至含有0. 5 mmol/L 4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺、0.2 mmol/L Tris-triazoleamineU mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS 溶液中，室温反应60 min。以365 nm波长激发光激发反应产物，以465 nm发射波长测定各组荧光强度，绘制叠氮基团浓度相关的标准曲线；同时，以3 ymol/L代谢标记的抗her2 抗体替代非天然单糖进行点击化学反应，根据反应产物的荧光强度确认抗体的叠氮化标记效率。
本发明的有益效果本发明采用叠氮标记抗体进行免疫荧光分析，该发明可与其他现有的免疫荧光技术同时使用，且结果互不干扰。本发明通过开发一种新型的抗体标记技术， 建立了一种新的免疫荧光抗体分析方法，丰富了免疫荧光抗体检测手段，在未来的免疫研究中具备发展潜力和广泛应用前景。
图1是叠氮定量曲线；
图2是叠氮标记抗体的检测灵敏度；图3是细胞染色分析， A 阴性对照；B 反应组；C 阳性对照； 图4是三通道荧光染色分析，
A 代谢标记Her2抗体染色；B =FITC标记抗体的EGFR4染色；C 生物素化的GRP94染色；D 三通道复合分析。
具体实施例方式实施例1
Anti-HP15的荧光标记
将1 mg NHS-FITC或NHS-罗丹明溶解于100 μ L DMSO中，随后吸取4. 7 μ L NHS-FITC 或 3. 5 μ L NHS-罗丹明逐滴加入 1 mL Anti-HP15 抗体溶液(0. 1 mol/L，pH=9. 0 Na2CO3-NaHCO3,1 mg/mL IgG)中，于室温下搅拌 1 h 后，5000 r/min 离心 10 min，吸取上清并于 PBS (pH=7. 2,0. 02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4,0. 15 mol/L NaCl)中充分透析，去除未反应的NHS-FITC和NHS-罗丹明，获得FITC或罗丹明标记的Anti_HP15抗体，用于阳性对照。 实施例2
关键化合物(含有叠氮基团的非天然单糖)的合成
关键的化合物合成方法如下选择如N-乙酰甘露糖、N-乙酰唾液酸、N-乙酰半乳糖和 N-乙酰葡萄糖等前体单糖通过优化糖基保护策略进行叠氮化和乙酰化，分别合成制备乙酰化的特异性修饰的非天然单糖；向4溴-1，8-萘酰亚胺中加入乙胺，在乙醇溶液中反应后收集产物，加入三甲基硅烷基炔，在四氢呋喃体系中经四(三苯基膦)钯和碘化亚铜催化反应，获得4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺。 实施例3
抗her2抗体的代谢标记
将实施例2合成的非天然单糖缓慢加入到的细胞培养基中，终浓度为0. 2 mM，混勻后加入到杂交瘤细胞中，37°C，5% CO2培养72 h，收集细胞悬液，1000 r/min离心3 min，吸取上清液，以抗体纯化亲和层析柱纯化代谢标记的抗体。
实施例4
代谢标记抗体的叠氮标记量分析
将不同浓度的1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰葡萄糖胺加入至含有0. 5 mmol/ L4-乙炔基-N-乙基-1,8-萘酰亚胺、0. 2 mmol/L Tris-triazoleamineU mmol/L CuSO4及 2 mmol/L抗坏血酸钠的PBS溶液中，室温60 min后，于365 nm激发光下测定465 nm下的各组荧光强度，绘制叠氮基团浓度相关的标准曲线(图1);同时，以3 μ mol/L代谢标记抗体替代1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰葡萄糖胺进行点击化学反应，根据反应产物的荧光强度确认抗体的叠氮化标记效率，换算得知抗体标记效率为每一分子抗体约标记3个叠氮基团。
实施例5
叠氮标记抗体的灵敏度分析
采用酶联免疫吸附分析法测定代谢标记抗体的检测灵敏度。向96孔酶标板中加入超声破碎的100 μ L膜抗原5 yg,37 ° C包被2 h后采用1% BSA 4 ° C封闭过夜， 随后加入100 μ L系列稀释的浓度相同的代谢标记的抗体、FITC标记的抗体和罗丹明标记的抗体(10、1、0. 1、0. 01、0. 001和0. 001 yg/mL)，室温反应3 h。充分洗涤后，向叠氮标记反应组中加入含有0.5 mmol/L 4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺、0. 2 mmol/L Tris-triazoleamineU mmol/L CuSO4及2 mmol/L抗坏血酸钠的PBS溶液，洗涤后，测定 365 nm激发光下每孔的荧光强度，发射波长为465 nm ;FITC标记的抗体和罗丹明标记的抗体以相应激发波长(488 nm和570 nm)激发并分别测定518 nm和590 nm下的荧光强度。 代谢标记抗体的EC5tl值比对照组略低，但在同一数量级，其检出限约为0. 1 μ g，即代谢标记抗体的检测灵敏度与已有的商品化的标记试剂NHS-FITC和NHS-罗丹明的检测灵敏度几乎一致，检测限一致，能够作为一种有效的补充方法应用于免疫荧光分析中(图2)。
实施例6
免疫荧光分析
将人乳腺癌细胞系SK-BR-3于含有10% FBS的RPMI 1640培养基中培养3天，然后将 1.25 X IO5细胞转移到激光共聚焦培养板中培养过夜，随后以4%多聚甲醛室温固定30 min，充分洗涤封闭后，加入1 mg/mL代谢标记抗体，室温反应3 h后加入含有0. 5 mmol/L 4-乙炔基-N-乙基-1,8-萘酰亚胺、0. 2 mmol/L Tris-triazoleamineU mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L抗坏血酸钠的PBS溶液催化反应，通过激光共聚焦显微镜在365 nm下观察。同时，采用相同的未标记的抗体和(实施例1制备的)对应的FITC标记二抗进行细胞荧光染色作为阳性对照，于488 nm下进行分析；仅加入催化反应溶液而未加入一抗的细胞作为阴性对照组于365 nm下观察。在采用代谢标记抗体染色分析时，365 nm下可以明显地观察到蓝色荧光(图3B)，而在未加入抗体的阴性对照中几乎没有荧光信号(图3A)；在阳性对照中，采用FITC标记的二抗进行免疫荧光染色分析，且荧光定位与使用叠氮标记抗体染色结果一致(图3C)，即本发明开发的方法无论在检测灵敏度，还是在检测结果的准确性上均与已有的方法相当，可以被广泛应用于免疫荧光检测分析中。
实施例7
复合染色分析
将人乳腺癌细胞系SK-BR-3以含10% FBS的RPMI 1640培养3 d，然后，将1. 25 X IO5细胞转移到激光共聚焦培养皿中，培养过夜，经PBS洗涤后加入4%的多聚甲醛固定，充分洗涤封闭后同时加入代谢标记抗体、兔抗EGFR4抗体和生物素化的抗GRP94抗体，室温反应1 h后，在培养皿中加入0.5 mmol/L 4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺、0. 2 mmol/ L Tris-triazoleamineU mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS 溶液，室温反应 1 h,充分洗涤后，向培养皿中加入FITC标记羊抗兔IgG和str印adivin-CY3，室温1 h后，充分洗涤，以激光共聚焦显微镜分别观察365 nm、488 nm和550nm激发光下的荧光信号。当激发波长为365 nm时，在细胞膜的内测可观测到明显的蓝色荧光信号(图4A)，即4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亚胺在改变电子分布后产生自发荧光；在488 nm激发光下，在细胞膜外侧可观测到明显的FITC绿色荧光信号(图4B)；在550 nm激发光下，可以观测到明显的Cy3红色荧光信号(图4C)。荧光信号叠加结果如图4D显示，3种荧光信号可以进行有效合并，并且信号互不干扰，即代谢标记后的荧光抗体分析方法可以与已有的常规方法并用。实施例8
荧光试剂的合成与显色分析
分别将 Cy3、Cy5、FITC、TRITC、ΡΕ、DAPI、Texas red、RB200、Indo-I、量子点等荧光基团进行化学修饰，使之含有炔基基团。随后依据实施例6进行点击化学反应，使炔基与抗体上的叠氮基团反应，形成稳定的三唑环，进而使得被检测样品具备发光功能，便于检测。
实施例9
荧光试剂的合成与显色分析
分别将含有His、GST、FLAG、HA、生物素等标签基团进行化学修饰，使之含有炔基基团。 随后依据实施例6进行点击化学反应，使炔基与抗体上的叠氮基团反应，形成稳定的三唑环，随后加入各种标签对应的亲和配体，进而使得被检测样品具备发光功能，便于检测。
权利要求
1.一种抗体的代谢标记方法，其特征在于以含有叠氮基团的非天然单糖作为糖蛋白合成时的代谢标记物，取代正常糖蛋白中的正常单糖，从而使被标记蛋白质含有叠氮基团，进而通过叠氮基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应，使蛋白质具备发光功能或偶联可被检测的标签基团。
2.如权利要求1所述抗体的代谢标记方法，其特征在于该方法的具体步骤如下 将含有叠氮基团的非天然单糖缓慢加入到细胞培养基中，终浓度为0. 2 mM，混勻后加入到杂交瘤细胞中，37°C，5% CO2培养72 h，收集细胞悬液，1000 r/min离心3 min，吸取上清液，以抗体纯化亲和层析柱纯化代谢标记的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的含有叠氮基团的非天然单糖包括1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰甘露糖胺、1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰唾液酸、1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰半乳糖胺和1，3，4，6-氧乙酰-2-脱氧-N-叠氮乙酰葡萄糖胺。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的叠氮反应基团是能与叠氮基团形成三唑环的炔基化合物，且自身具备发荧光特性的偶联基团或含有标签基团。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的具备发荧光特性的偶联基团包括 Cy3, Cy5, FITC, TRITC, ΡΕ, DAPI, Texas red、RB200、Indo-I 和量子点。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的标签基团包括His、GST、FLAG、HA和生物素。
7.权利要求1所述方法制备的代谢标记抗体在荧光检测分析方法中的应用。
全文摘要
一种抗体的代谢标记方法及其荧光检测中的应用。本发明分别合成了含有叠氮基团和炔基基团的两个关键化合物，将前者添加至细胞培养基中，通过细胞的代谢途径，将叠氮基团标记在IgG的糖链上，再与含有荧光基团的后者进行点击化学反应，实现荧光显色。采用该方法在细胞水平进行染色分析，代谢标记抗体可直接用于免疫荧光染色分析；并且采用本发明方法标记的抗体可与其他现有的免疫荧光技术同时使用，且结果互不干扰。本发明通过开发一种新型的抗体标记方法，与传统方法相比，操作容易，步骤少，并丰富了免疫荧光抗体检测手段，在未来的免疫研究中具备发展潜力和广泛应用前景。
文档编号G01N33/533GK102313801SQ20111014843
公开日2012年1月11日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者侯洁, 张奇, 潘鹏炜, 白芳, 白钢, 高智慧 申请人:南开大学