一种荧光素标记核苷酸的制备方法
【专利摘要】本发明公开了本一种荧光素标记核苷酸的制备方法，具体涉及一种荧光素罗丹明B标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的制备方法，过程包括溶液A配制、溶液B配制、偶合、层析；偶合包含反应开始、反应终止、缓冲稳定和浓度调节。将丙烯胺-dUTP原溶液与NaHCO3缓冲溶液加入溶液A配制罐(1)中，制得溶液A；将与丙烯胺-dUTP相同摩尔量的罗丹明B(Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO(二甲基二砜)中制得溶液B；使溶液A与溶液B在室温下进入偶合分别进入反应开始阶段(3)、反应终止阶段(4)、缓冲稳定阶段(5)、调节浓度阶段(6)；最后将偶合反应物加入层析柱(7)，收集纯化的Rhodamine-dUTP，最终获得的产物。
【专利说明】一种荧光素标记核苷酸的制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种荧光素标记核苷酸的制备方法，具体涉及一种荧光素罗丹明B标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的制备方法，而这种荧光素标记的DNA探针可广泛用于DNA荧光原位杂交临床检验,也可用于细胞凋亡荧光检测试剂盒。
【背景技术】:
[0002]人类基因组计划的完成促进了以核酸为基础的临床诊断、法医DNA鉴定、检验检疫技术的发展。因此核酸的定性与定量分析变得越来越重要。荧光素标记检测技术的诞生，极大促进了核酸测量技术的发展，该技术正逐渐取代传统同位素标记技术，在核酸测量中广泛应用。荧光素标记核苷酸作为荧光技术中的重要工具，已应用于医学、农业、环境和生物学等领域。随着应用领域的拓展，对荧光素标记核苷酸的质量控制、纯度和量值准确提出了更高的要求。
[0003]荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP作为一种灵敏度高、量值准确的核酸探针标记原料，是生产荧光原位杂交临床检验试剂盒、细胞凋亡荧光检测试剂盒过程中的一种关键性中间产品。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是针对上述情况，提供一种荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP的制备方法，其制备的Rhodamine-dUTP能够提高检测的特异性、可靠性、均一性和灵敏度。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供的荧光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP制备方法，主要包括以下的步骤:
[0006](I)将丙烯胺-dUTP (脱氧尿嘧啶核苷三磷酸)原溶液加入到NaHCO3缓冲溶液中制得溶液A。
[0007](2)将Rhodamine (罗丹明B)溶解于DMSO (二甲基二砜)制得溶液B。
[0008](3)使溶液A与与溶液B在室温下经过2.5-4.5小时的偶合反应作用之后，按以下顺序进行每一个反应:a加入甘氨酸使反应停止；b加入缓冲液用于稳定核苷酸；c加入水，使得dUTP溶液的终浓度为0.5-1.5mmol/L。
[0009](4)将反应混合物加入层析柱，去除 未标记的罗丹明B和dUTP，收集纯化的罗丹明-dUTP。
[0010]从而制的所需的突光素标记核苷酸Rhodamine-dUTP。
[0011]本发明提供的技术方案的有益效果是:通过本方法可以获得标记率(纯度)较高的dUTP 99.9%，在-20°c下稳定一年以上，在-80°c下稳定三年以上。同时，由于荧光素罗丹明B较为廉价，使得该反应具有较高的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】:
[0012]图1是荧光素罗丹明B标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的制备方法发明示意图，其中，1、溶液A配制罐2、溶液B配制罐3、偶合反应开始阶段4、偶合反应终止阶段5、偶合缓冲稳定阶段6、偶合液浓度调节阶段7、层析柱
【具体实施方式】
[0013]如图1所示，本发明的过程包括溶液A配制、溶液B配制、偶合、层析；偶合包含反应开始、反应终止、缓冲稳定和浓度调节。
[0014]将10-30mmol/L(毫摩尔)的丙烯胺-dUTP 原溶液、0.1-0.3mmol/L 的 NaHCO3 缓冲溶液加入溶液A配制罐(I)中，制得溶液A;将与丙烯胺-dUTP相同摩尔量的罗丹明B (Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO (二甲基二砜)中制得溶液B。
[0015]使溶液A与溶液B在室温下进入偶合反应开始阶段(3)，进行偶合反应2.5-4.5小时；之后加入0.1-0.3n 2mol/L的甘氨酸(pH pH 7.0-9.0，溶液终浓度为10-30mmol/L)使偶合反应终止阶段(4);反应终止后，加入0.3-0.5n lmol/L Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合而得)，pH7.0-9.0(溶液终浓度为10-30mmol/L)，是偶合反应液进入缓冲稳定阶段(5);再加入10-30n的水，进行偶合混合液的调节浓度阶段(6)，使得dUTP溶液的终浓度为0.5-1.5mmol/L。
[0016]最后将偶合反应混合物加入层析柱(7)，去除未标记的罗丹明和dUTP，收集纯化的Rhodamine-dUTP，最终获得的产物。、
【权利要求】
1.一种荧光素标记核甘酸的制备方法，具体涉及一种罗得明标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(Rhodamine-dUTP)的制备方法，主要包括以下步骤:溶液A配制、溶液B配制、偶合、层析；偶合包含反应开始、反应终止、缓冲稳定和浓度调节。
2.根据权利要求1所述一种荧光素标记核甘酸的制备方法，其特征在于，将10-30mmol/L(毫摩尔)的丙烯胺-dUTP原溶液、0.1-0.3mmol/L的NaHCO3缓冲溶液加入溶液A配制罐(I)中，制得溶液A ;将与丙烯胺-dUTP相同摩尔量的罗丹明B(Rhodamine)在溶液B配制罐(2)中，溶解于DMSO (二甲基二砜)中制得溶液B。
3.根据权利要求1所述一种荧光素标记核甘酸的制备方法，其特征在于，使溶液A与溶液B在室温下进入偶合反应开始阶段(3)，进行偶合反应2.5-4.5小时；之后加入0.l-ο.3n 2mol/L的甘氨酸(pH 7.0-9.0，溶液终浓度为10-30mmol/L)使偶合反应终止阶段(4);反应终止后，加入0.3-0.5n lmol/LTris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合而得)，PH7.0-9.0 (溶液终浓度为10-30mmol/L)，是偶合反应液进入缓冲稳定阶段(5);再加入10-30n的水，进行偶合混合液的调节浓度阶段(6)，使得dUTP溶液的终浓度为0.5-1.5mmol/L。
4.根据权利要求1所述一种荧光素标记核甘酸的制备方法，其特征在于，将偶合反应混合物加入层析柱(7 )，去除未标记的罗丹明B和dUTP，收集纯化的Rhodamine-dUTP。
【文档编号】C12N15/10GK103468671SQ201210441732
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】缪为民, 陆宏卿, 舒丽, 景晓辉 申请人:江苏美中医疗科技有限公司