专利名称：异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，具体涉及异硫氰酸荧光素共价标记的钙磷材料及其制备方法。
背景技术：
人工骨、齿科钙磷材料，如P-磷酸三钙、羟基磷灰石、生物活性玻璃等，由于其主要成分与天然骨、齿的无机成分相近，植入生物体后可起到支架作用，并能诱导新骨生长。目前，钙磷材料已在矫形外科、齿科临床上获得广泛应用。
人工合成的纳米羟基磷灰石是一种优良的硬组织替代材料，其纳米结晶与胶原、骨生长因子等制备的复合生物活性骨修复材料兼有骨传导和骨诱导的作用，可提高骨植入材料的成骨能力。此外，纳米羟基磷灰石还具
有一些特别的性能，例如对一些肿瘤细胞的生长具有抑制作用；还可作为药物缓释材料如抗生素、核酸类药物的载体等。e-磷酸三药亦被认为理想的骨组织修复材料。用磷酸钙制成的多孔支架不仅有利于组织长入，还能与骨诱导物质如骨形态发生蛋白等活性体基质形成生物活性复合材料，能促进新骨的形成。
在研究钙磷材料的生物相容性及其与细胞的相互作用时，其在细胞内的定位一直是研究的难点，如何方便实现对钙磷材料进行示踪亟待解决。目前已有的研究方法是对纳米粒子进行生物标记，例如将近红外量子点与钙磷材料复合(近红外荧光量子点标记的羟基磷石灰及其制备方法和应用，专利号200510025590.4)或者利用羟基磷灰石的强吸附作用将异硫氰酸荧光素吸附到颗粒表面(一种羟基磷灰石进行荧光标记的方法，专利号200810162190.1)。但量子点的生物相容性有待进一步研究；而物理吸附作用是可逆的，相互吸附的羟基磷灰石材料和异硫氰酸荧光素之间结合作用力小，易脱标，难以适用于复杂体内环境，也不利于标记钙磷材料的保存。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供一种共价结合异硫氰酸荧光素的 钙磷材料及其制备方法，该方法合成的材料荧光强度高，化学性质稳定， 生物相容性好，适用于复杂的体内环境，能对细胞内的钙磷材料进行示踪， 有利于研究材料的生物相容性及与细胞之间的相互作用。
本发明所采用的技术方案是
一种异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料，钙磷材料与异硫氰酸荧光素通 过氨基硅烷偶联剂共价结合，硅烷偶联剂与材料表面形成硅-氧-磷
(Si-0-P)共价键，偶联剂中的氨基基团与荧光素中异硫氰根共价结合， 形成稳定的荧光标记的钙磷材料。
优选地，所述钙磷材料为a -磷酸三钙(a -TCP)、 0 -磷酸三钙(0 -TCP)、磷酸四转或者羟基磷灰石(HA)，以及元素掺杂钙磷材料，
优选地，所述的元素掺杂钙磷材料为晶格中钙元素被取代的含镁、锶、 镧系元素、铁、镍、铜、银、.锌羟基磷灰石，晶格中羟基被取代的含氟、 氯羟基磷灰石，以及晶格中磷酸根被取代的含碳酸根、硅羟基磷灰石。
优选地，所述氨基硅垸偶联剂为Y-氨丙基三甲氧基硅垸、Y-氨丙基 三乙氧基硅烷、N-(e-氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(e-氨乙基)-Y -氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N- ( P -氨乙基)-Y -氨丙基三乙氧基硅烷、 N-( 0 -氨乙基)-Y -氨丙基甲基二乙氧基硅烷、Y -氨丙基甲基二乙氧基硅 烷、苯氨基甲基三甲氧基硅垸、苯氨基甲基三乙氧基硅垸、二乙烯三氨丙 基三甲氧基硅垸、二乙烯三氨丙基三乙氧基硅垸或者二乙烯三氨丙基甲基 二甲氧基硅垸。
异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方法，该制备方法的具体步骤
为
(1) 在持续搅拌下将钙磷材料粉末加入非质子类反应介质中，钙磷材 料粉末悬浮分散均匀后在反应体系中加入氨基硅垸偶联剂，继续反应6 24 小时，所述氨基硅垸偶联剂的用量为钙磷材料用量的0. 1 5. 0wt%;
(2) 用水和/或醇洗涤，除去未反应的硅烷偶联剂，干燥；
(3 )将氨基硅垸偶联剂改性的钙磷材料粉末分散于极性反应介质中， 搅拌10 60分钟后加入异硫氰酸荧光素醇溶液，继续反应1 10小时，优选3 5小时，所述异硫氰酸荧光素的用量为改性钙磷材料用量的0. l
5. 0wt%;
(4)用水和/或醇离心洗涤或透析除去游离的异硫氰酸荧光素，干燥，
得到最终产品。
优选地，所述非质子类反应介质为苯、甲苯、二甲苯、N,N-二甲基甲 酰胺、四氯化碳、乙醚或者丙酮。
优选地，所述氨基硅垸偶联剂为Y-氨丙基三甲氧基硅垸、Y-氨丙基 三乙氧基硅烷、N-(e-氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅垸、N-(e-氨乙基)-Y -氨丙基甲基二甲氧基硅垸、N-( e -氨乙基)-Y -氨丙基三乙氧基硅烷、 N-( e -氨乙基)-Y -氨丙基甲基二乙氧基硅垸、Y -氨丙基甲基二乙氧基硅
烷、苯氨基甲基三甲氧基硅垸、苯氨基甲基三乙氧基硅垸、二乙烯三氨丙 基三甲氧基硅垸、二乙烯三氨丙基三乙氧基硅垸或者二乙烯三氨丙基甲基 二甲氧基硅烷。。
优选地，所述氨基硅烷偶联剂的用量为钙磷材料用量的0. 5 2. 0wt%。 优选地，所述极性反应介质为水、甲醇或者乙醇。 优选地，所述异硫氰酸荧光素的用量为改性钙磷材料用量的0.5 2. 0wt%。
进一步地，所述步骤(3)和(4)的操作是在避光环境中进行。 进一步地，制备得到的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料最大吸收波长 为490 495纳米，最大发射波长为530 540纳米。 本发明具有以下优点
本发明所采用的氨基硅垸偶联剂能与钙磷材料表面形成硅-氧-磷 (Si-0-P)共价键，偶联剂上的氨基可以与异硫氰酸荧光素(FITC)中异 硫氰根共价结合，从而形成稳定的荧光标记钙磷材料。经XRD和FTIR检测 和细胞实验证明，荧光标记过程仅发生于其表面而不改变钙磷材料内部结 构及其性能；经荧光光谱仪检测和荧光显微镜观察，该材料荧光强度高， 成像清晰。
图1是一种通过Y -氨丙基三乙氧基硅垸共价结合异硫氰酸荧光素钙磷材料的结构示意图2是实施例1在明场情况下共价结合异硫氰酸荧光素的纳米含锌羟 基磷灰石在荧光显微镜下的照片；
图3是实施例1在荧光情况下共价结合异硫氰酸荧光素的纳米含锌羟 基磷灰石在荧光显微镜下的照片；
图4是实施例3在明场情况下共价结合异硫氰酸荧光素的纳米羟基磷 灰石材料被人单核细胞THP-1吞噬情况的荧光显微镜图片；
图5是实施例3在荧光情况下共价结合异硫氰酸荧光素的纳米羟基磷 灰石材料被人单核细胞THP-1吞噬情况的荧光显微镜图片。
具体实施例方式
下面结合附图对本实用新型作进一步的详细说明。
参照图1,本发明提供了共价结合异硫氰酸荧光素的钙磷材料，钙磷材 料与异硫氰酸荧光素通过氨基硅烷偶联剂共价结合，硅烷偶联剂与材料表 面形成硅-氧-磷(Si-0-P)共价键，偶联剂中的氨基基团与荧光素中异硫 氰根共价结合，形成稳定的荧光标记钙磷材料。制备该材料的技术方案是: 在非质子类反应介质中制备钙磷材料表面的氨基硅垸修饰层，然后在一定 的液相介质中通过亲核加成反应使异硫氰酸荧光素(FITC)共价结合到改 性后的钙磷材料上，再经离心分离、洗涤、干燥等操作步骤，最终得到共 价结合异硫氰酸荧光素的钙磷材料。整个制备过程采用氨基硅烷偶联的方 式将异硫氰酸荧光素共价结合于钙磷材料表面。
实施例l
选择长为200nm，宽为40nm的针状羟基磷灰石颗粒，其共价结合异硫 氰酸荧光素的过程为
(1) 在磁力搅拌下将1.0g羟基磷灰石粉末分散于50ml甲苯中，匀速 搅拌30分钟；
(2) 将0.02gY-氨丙基三乙氧基硅烷(21ul)加入上述第(1)步的 甲苯悬液中，持续搅拌12小时；
(3) 离心分离，无水乙醇离心洗涤3遍，5(TC下干燥过夜；
(4) 将0.2g上述第(3)步所得的Y-氨丙基三乙氧基氨基硅垸改性的羟基磷灰石粉末分散于20ml甲醇中，磁力搅拌30min;
(5) 将异硫氰酸荧光素5 6mg配制成2mg/ml甲醇溶液，取lml缓慢 加入上述第(4)步所得悬浊液，室温下持续搅拌3小时；
(6) 离心分离，无水乙醇离心洗涤5遍，4(TC烘干过夜；
(7) 将第(6)步所得改性后的羟基磷灰石粉末用三蒸水离心洗涤5 遍，4(TC烘干过夜。
(8) 经荧光光谱仪检测和荧光显微镜观察，在激发波长为488nm时， 所得共价结合异硫氰酸荧光素纳米羟基磷灰石发出明亮绿色荧光，荧光强 度高，成像清晰，适用于材料与细胞相互作用的研究。该材料在荧光显微 镜下的照片参照图2和图3。
实施例2
选择粒径为300nm的纳米e -TCP颗粒，其共价结合异硫氰酸荧光素的 过程为
(1) 在磁力搅拌下将1.0g 3-TCP粉末分散于50ml甲苯中，匀速搅 拌30分钟；
(2) 将0.02g Y-氨丙基三乙氧基硅烷(21ul)加入上述第(1)步 的甲苯悬液中，持续搅拌12小时；
(3) 离心分离，无水乙醇离心洗涤3遍，50。C下干燥过夜；
(4) 将0.2g上述第(3)步所得的Y-氨丙基三乙氧基硅垸改性的e -TCP粉末分散于20ml甲醇中，磁力搅拌30min;
(5) 将异硫氰酸异硫氰酸荧光素5 6mg配制成2mg/ml甲醇溶液，取 lml缓慢加入上述第(4)步所得悬浊液，室温下持续搅拌3小时；
(6) 离心分离，无水乙醇离心洗涤5遍，40。C烘干过夜；
(7) 将第(6)步所得改性后的e-TCP粉末用三蒸水离心洗涤5遍， 4(TC烘干过夜。
(8) 经荧光光谱仪检测和荧光显微镜观察，在激发波长为488nm时， 所得共价结合异硫氰酸荧光素纳米3 -TCP发出明亮绿色荧光，荧光强度高， 成像清晰，适用于材料与细胞相互作用的研究。
实施例3
选择长为200mn，宽为40nm的针状含锌羟基磷灰石(ZnCa9(P04)6(0H)2)颗粒，其共价结合异硫氰酸荧光素的过程为
(1) 在磁力搅拌下将1.0g羟基磷灰石粉末分散于50ml二甲苯中，匀
速搅拌30分钟；
(2) 将0.02g y-氨丙基三甲氧基硅烷(21p1)加入上述第(1)步
的二甲苯悬液中，持续搅拌12小时；
(3) 离心分离，无水乙醇离心洗涤3遍，5(TC下干燥过夜；
(4) 将0.2g上述第(3)步所得的y-氨丙基三甲氧基硅垸改性的羟 基磷灰石粉末分散于20ml乙醇中，磁力搅拌30min;
(5) 将异硫氰酸荧光素5 6mg配制成2mg/ml乙醇溶液，取lml缓慢 加入上述第(4)步所得悬浊液，室温下持续搅拌3小时；
(6) 离心分离，无水乙醇离心洗涤5遍，4(TC烘干过夜；
(7) 将第(6)步所得改性后的羟基磷灰石粉末用三蒸水离心洗涤5 遍，40。C烘干过夜。
(8) 经荧光光谱仪检测和荧光显微镜观察，在激发波长为488nm时， 所得共价结合异硫氰酸荧光素纳米羟基磷灰石发出明亮绿色荧光，荧光强 度高，成像清晰，适用于材料与细胞相互作用的研究。该材料被细胞吞噬 后在荧光显微镜下的照片参照图4和图5。
实施例4
选择直径为20 um的不规则羟基磷灰石颗粒，其共价结合异硫氰酸荧 光素的过程为
(1) 在磁力搅拌下将1.0g羟基磷灰石粉末分散于50ml甲苯中，匀速 搅拌30分钟；
(2) 将O.Olg y-氨丙基三乙氧基硅烷(21iil)加入上述第(1)步 的甲苯悬液中，持续搅拌12小时；
(3) 离心分离，无水乙醇离心洗涤3遍，5(TC下干燥过夜；
(4) 将0.2g上述第(3)步所得的y-氨丙基三乙氧基硅垸改性的羟 基磷灰石粉末分散于20ml甲醇中，磁力搅拌30min;
(5) 将异硫氰酸荧光素2 4mg配制成2mg/ml甲醇溶液，取0. 5ml缓 慢加入上述第(4)步所得悬浊液，室温下持续搅拌3小时；
(6) 离心分离，无水乙醇离心洗涤5遍，4(TC烘干过夜；(7) 将第(6)步所得改性后的羟基磷灰石粉末用三蒸水离心洗涤5 遍，40。C烘干过夜。
(8) 经荧光光谱仪检测和荧光显微镜观察，在激发波长为488nm时， 所得共价结合异硫氰酸荧光素纳米羟基磷灰石发出明亮绿色荧光，荧光强 度高，成像清晰，适用于材料与细胞相互作用的研究。
实施例5
选择长为200nm，宽为40mn的针状羟基磷灰石颗粒，其共价结合异硫 氰酸荧光素的过程为
(1) 在磁力搅拌下将1.0g羟基磷灰石粉末分散于50ml二甲苯中，匀 速搅拌30分钟；
(2) 将0.02gN-(e-氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅烷(21ul)加入 上述第(1)步的二甲苯悬液中，持续搅拌12小时；
(3) 离心分离，无水乙醇离心洗涤3遍，50。C下干燥过夜；
(4) 将0.2g上述第(3)步所得的N-(e-氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧 基硅烷改性的羟基磷灰石粉末分散于20ml甲醇中，磁力搅拌30min;
(5) 将异硫氰酸异硫氰酸荧光素5 6mg配制成2mg/ml甲醇溶液，取 lml缓慢加入上述第(4)步所得悬浊液，室温下持续搅拌3小时；
(6) 离心分离，无水乙醇离心洗涤5遍，4(TC烘干过夜；
(7) 将第(6)步所得改性后的羟基磷灰石粉末用三蒸水离心洗涤5 遍，4(TC烘干过夜。
(8) 经荧光光谱仪检测和荧光显微镜观察，在激发波长为488nm时， 所得共价结合异硫氰酸荧光素纳米羟基磷灰石发出明亮绿色荧光，荧光强 度高，成像清晰，适用于材料与细胞相互作用的研究。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非 限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技 术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求 范围当中。
权利要求
1.一种异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料，其特征在于，钙磷材料与异硫氰酸荧光素通过氨基硅烷偶联剂共价结合，硅烷偶联剂与材料表面形成硅-氧-磷(Si-O-P)共价键，偶联剂中的氨基基团与荧光素中异硫氰根共价结合，形成稳定的荧光标记的钙磷材料。
2. 根据权利要求1所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料，其特征在 于，所述钙磷材料为a-磷酸三钙(a-TCP)、 0-磷酸三钙(e-TCP)、磷 酸四钙或者羟基磷灰石(HA)，以及元素掺杂钙磷材料。
3. 根据权利要求2所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料，其特征在 于，所述的元素掺杂钙磷材料为晶格中钙元素被取代的含镁、锶、镧系元 素、铁、镍、铜、银、锌羟基磷灰石，晶格中羟基被取代的含氟、氯羟基 磷灰石，以及晶格中磷酸根被取代的含碳酸根、硅羟基磷灰石。
4. 根据权利要求1所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料，其特征在 于，所述氨基硅烷偶联剂为Y-氨丙基三甲氧基硅垸、Y-氨丙基三乙氧基 硅垸、N-(p-氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基)-Y-氨丙 基甲基二甲氧基硅垸、N-(P-氨乙基)-Y-氨丙基三乙氧基硅垸、N-(e-氨 乙基)-Y-氨丙基甲基二乙氧基硅垸、Y-氨丙基甲基二乙氧基硅烷、苯氨 基甲基三甲氧基硅烷、苯氨基甲基三乙氧基硅垸、二乙烯三氨丙基三甲氧 基硅烷、二乙烯三氨丙基三乙氧基硅烷或者二乙烯三氨丙基甲基二甲氧基娃院o
5. 异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤为(1) 在持续搅拌下将钙磷材料粉末加入非质子类反应介质中，钙磷材 料粉末悬浮分散均匀后在反应体系中加入氨基硅烷偶联剂，继续反应6 24 小时，所述氨基硅烷偶联剂的用量为钙磷材料用量的0. 1 5. 0wt%;(2) 用水和/或醇洗涤，除去未反应的硅垸偶联剂，干燥；(3 )将氨基硅垸偶联剂改性的钙磷材料粉末分散于极性反应介质中， 搅拌10 60分钟后加入异硫氰酸荧光素醇溶液，继续反应1 10小时，优选3 5小时，所述异硫氰酸荧光素的用量为改性钙磷材料用量的0. l 5. 0wt%;(4)用水和/或醇离心洗涤或透析除去游离的异硫氰酸荧光素，干燥，得到最终产品。
6. 根据权利要求5所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方法， 其特征在于，所述非质子类反应介质为苯、甲苯、二甲苯、N，N-二甲基甲 酰胺、四氯化碳、乙醚或者丙酮。
7. 根据权利要求5所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方法， 其特征在于，所述氨基硅垸偶联剂为Y-氨丙基三甲氧基硅垸、Y-氨丙基 三乙氧基硅烷、N-(e-氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅垸、N-(e-氨乙基)-Y -氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N-( e -氨乙基)-Y -氨丙基三乙氧基硅垸、 N-( 0 -氨乙基)-Y -氨丙基甲基二乙氧基硅烷、Y -氨丙基甲基二乙氧基硅烷、苯氨基甲基三甲氧基硅烷、苯氨基甲基三乙氧基硅垸、二乙烯三氨丙 基三甲氧基硅烷、二乙烯三氨丙基三乙氧基硅烷或者二乙烯三氨丙基甲基 二甲氧基硅烷。。
8. 根据权利要求5所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方法， 其特征在于，所述氨基硅垸偶联剂的用量为钙磷材料用量的0. 5 2. 0wt%。
9. 根据权利要求5所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方法， 其特征在于，所述极性反应介质为水、甲醇或者乙醇。
10. 根据权利要求5所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方 法，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素的用量为改性钙磷材料用量的0.5 2. Owt%。
11. 根据权利要求5所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料的制备方 法，其特征在于，所述步骤(3)和(4)的操作是在避光环境中进行。
12. 根据权利要求5至11任意一项所述的异硫氰酸荧光素标记的钙磷 材料的制备方法，其特征在于，制备得到的异硫氰酸荧光素标记的钙磷材 料最大吸收波长为490 495纳米，最大发射波长为530 540纳米。
全文摘要
本发明公开了一种异硫氰酸荧光素标记的钙磷材料及其制备方法。本发明先采用氨基硅烷偶联剂对钙磷材料进行表面改性，在钙磷材料表面形成硅-氧-磷(Si-O-P)共价键，再利用偶联剂中的氨基基团与荧光素中的异硫氰根共价结合，从而形成稳定的共价型荧光标记钙磷材料。合成的材料荧光强度高，化学性质稳定，生物相容性好，适用于在复杂体内外环境中对细胞内的钙磷材料进行示踪，在材料生物相容性评价及材料-细胞间相互作用等方面具有重要应用。
文档编号C09K11/06GK101643645SQ20091006331
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月24日 优先权日2009年7月24日
发明者仇志烨, 健 刘, 磊 周, 张胜民, 王深琪 申请人:华中科技大学